Name: Multiplex chemische beeldvorming op basis van breedband gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer multiplex chemische beeldvorming met breedband gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie. Deze labelvrije methode maakt snelle kwantificering van chemische componenten in biologische monsters mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.P. erkent de financiering van het project CRIMSON van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 101016923 en het Regione Lombardia-project NEWMED onder subsidieovereenkomst nr. POR FESR 2014-2020. G. C. erkent de financiering van het PROJECT GRAPHENE Core3 van de Europese Unie onder nummer 881603. G. C. erkent ook financiering van de King Abdullah University of Science and Technology, Grant Award Number: OSR-2016-CRG5-3017-01.

<ol><li>Stewart, S., Priore, R. J., Nelson, M. P., Treado, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Raman Imaging.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 5 (1), 337-360 (2012).</li>
<li>Smekal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+quantentheorie+der+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Zur quantentheorie der dispersion.</a> Die Naturwissenschaften. 11 (43), 873-875 (1923).</li>
<li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+secondary+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).</li>
<li>Vanna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+imaging+for+label-free+cancer+diagnosis+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22La+Rivista+del+Nuovo+Cimento%22%5BJournal%5D)">Vibrational imaging for label-free cancer diagnosis and classification.</a> La Rivista del Nuovo Cimento. 45, 107-187 (2021).</li>
<li>Eckhardt, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+scattering+from+organic+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman scattering from organic liquids.</a> Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).</li>
<li>Hellwarth, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Theory of stimulated Raman scattering.</a> Physical Review. 130 (5), 1850-1852 (1963).</li>
<li>Maker, P. D., Terhune, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+optical+effects+due+to+an+induced+polarization+third+order+in+the+electric+field+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Study of optical effects due to an induced polarization third order in the electric field strength.</a> Physical Review. 137 (3), 801-818 (1965).</li>
<li>Bloembergen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stimulated+Raman+effect%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">The stimulated Raman effect.</a> American Journal of Physics. 35 (11), 989-1023 (1967).</li>
<li>Levenson, M. D., Flytzanis, C., Bloembergen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+resonant+and+nonresonant+three-wave+mixing+in+diamond%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+B%22%5BJournal%5D)">Interference of resonant and nonresonant three-wave mixing in diamond.</a> Physical Review B. 6 (10), 3962-3965 (1972).</li>
<li>Polli, D., Kumar, V., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+coherent+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+%26+Photonics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Broadband coherent Raman scattering microscopy.</a> Laser & Photonics Reviews. 12 (9), 1800020(2018).</li>
<li>Rigneault, H., Berto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+Coherent+Raman+light+matter+interaction+processes%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Photonics%22%5BJournal%5D)">Tutorial: Coherent Raman light matter interaction processes.</a> APL Photonics. 3 (9), 091101(2018).</li>
<li>Hu, F., Shi, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+of+chemical+bonds+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems%3A+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), (2015).</li>
<li>Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+vibrational+imaging+by+coherent+anti-stokes+raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-stokes raman scattering.</a> Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).</li>
<li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li>
<li>Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+CARS+spectral+phase+retrieval+using+a+time-domain+Kramers-Kronig+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform.</a> Optics Letters. 34 (9), 1363(2009).</li>
<li>Valensise, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removing+non-resonant+background+from+CARS+spectra+via+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Photonics%22%5BJournal%5D)">Removing non-resonant background from CARS spectra via deep learning.</a> APL Photonics. 5 (6), 061305(2020).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCheng%2C+JX+%22Coherent+Raman+scattering+microscopy%22">Coherent Raman scattering microscopy</a>. , CRC press. Boca Raton. (2012).</li>
<li>Slipchenko, M. N., Oglesbee, R. A., Zhang, D., Wu, W., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodyne+detected+nonlinear+optical+imaging+in+a+lock-in+free+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Heterodyne detected nonlinear optical imaging in a lock-in free manner.</a> Journal of Biophotonics. 5 (10), 801-807 (2012).</li>
<li>Blume, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boxcar%27%27+integrator+with+long+holding+times%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Boxcar'' integrator with long holding times.</a> Review of Scientific Instruments. 32 (9), 1016-1018 (1961).</li>
<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li>
<li>Sarri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+histology%3A+one+to+one+comparison+with+standard+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman histology: one to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining.</a> Biomedical Optics Express. 10 (10), 5378(2019).</li>
<li>Lu, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+DNA+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).</li>
<li>De la Cadena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+stimulated+Raman+imaging+based+on+multi-channel+lock-in+detection+for+spectral+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Photonics%22%5BJournal%5D)">Broadband stimulated Raman imaging based on multi-channel lock-in detection for spectral histopathology.</a> APL Photonics. 7 (7), (2022).</li>
<li>Dela Cadena, A., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G., Polli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+wavelength-scanning+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Broadband stimulated Raman scattering microscopy with wavelength-scanning detection.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 51 (10), 1951-1959 (2020).</li>
<li>Sciortino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-channel+differential+lock-in+amplifiers+with+autobalancing+network+for+stimulated+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Solid-State+Circuits%22%5BJournal%5D)">Four-channel differential lock-in amplifiers with autobalancing network for stimulated Raman spectroscopy.</a> IEEE Journal of Solid-State Circuits. 56 (6), 1859-1870 (2021).</li>
<li>Coluccelli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+30+fs+light+pulses+at+1+W+power+level+from+a+Yb-pumped+optical+parametric+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Tunable 30 fs light pulses at 1 W power level from a Yb-pumped optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 42 (21), 4545(2017).</li>
<li>Monmayrant, A., Weber, S., Chatel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newcomer%27s+guide+to+ultrashort+pulse+shaping+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+B%3A+Atomic%2C+Molecular+and+Optical+Physics%22%5BJournal%5D)">A newcomer's guide to ultrashort pulse shaping and characterization.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 43 (10), 103001(2010).</li>
<li>Fork, R. L., Martinez, O. E., Gordon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+dispersion+using+pairs+of+prisms%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Negative dispersion using pairs of prisms.</a> Optics Letters. 9 (5), 150(1984).</li>
<li>Crisafi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-line+balanced+detection+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In-line balanced detection stimulated Raman scattering microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10475(2017).</li>
<li>Alem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+spectral+density+measured+with+lock-in+amplifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Zurich+Instruments+Company+Blog%22%5BJournal%5D)">Noise spectral density measured with lock-in amplifiers.</a> Zurich Instruments Company Blog. , https://www.zhinst.com/europe/en/blogs/noise-spectral-density-measured-lock-amplifiers (2021).</li>
<li>Palmer, C., Loewen, E. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalmer%2C+C+%22Diffraction+grating+handbook%22">Diffraction grating handbook</a>. , (2005).</li>
<li>Tauler, R., de Juan, A., Jaumot, J. Multivariate curve resolution homepage. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/">https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/</a> (2021).</li>
<li>Tauler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+curve+resolution+applied+to+second+order+data%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">Multivariate curve resolution applied to second order data.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).</li>
<li>de Juan, A., Jaumot, J., Tauler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+Curve+Resolution+%28MCR%29.+Solving+the+mixture+analysis+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Multivariate Curve Resolution (MCR). Solving the mixture analysis problem.</a> Analytical Methods. 6 (14), 4964-4976 (2014).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+vibrational+imaging+by+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+multivariate+curve+resolution+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative vibrational imaging by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy and multivariate curve resolution analysis.</a> Analytical Chemistry. 85 (1), 98-106 (2013).</li>
<li>Chitra Ragupathy, I., Schweikhard, V., Zumbusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+analysis+of+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Multivariate analysis of hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy images.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 52 (9), 1630-1642 (2021).</li>
<li>Brown, S. D., Tauler, R., Walczak, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+SD+%22Comprehensive+Chemometrics%3A+Chemical+and+Biochemical+Data+Analysis%22">Comprehensive Chemometrics: Chemical and Biochemical Data Analysis</a>. , Elsevier. (2020).</li>
<li>Guild, J. B., Xu, C., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+group+delay+dispersion+of+high+numerical+aperture+objective+lenses+using+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Measurement of group delay dispersion of high numerical aperture objective lenses using two-photon excited fluorescence.</a> Applied Optics. 36 (1), 397(1997).</li>
<li>Paschotta, R. RP Photonics Encyclopedia. Article on &#34;Relative Intensity Noise.&#34. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html">https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html</a> (2021).</li>
<li>Audier, X., Heuke, S., Volz, P., Rimke, I., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+in+stimulated+Raman+scattering+measurement%3A+From+basics+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Photonics%22%5BJournal%5D)">Noise in stimulated Raman scattering measurement: From basics to practice.</a> APL Photonics. 5 (1), 011101(2020).</li>
<li>Xu, S., Camp, C. H., Lee, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy+for+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for polymers.</a> Journal of Polymer Science. , (2021).</li>
<li>Davydova, D., de al Cadena, A., Akimov, D., Dietzek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+absorption+microscopy%3A+advances+in+chemical+imaging+of+photoinduced+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+%26+Photonics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Transient absorption microscopy: advances in chemical imaging of photoinduced dynamics.</a> Laser & Photonics Reviews. 10 (1), 62-81 (2016).</li>
<li>Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodyne+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+%28CARS%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging.</a> Optics Letters. 31 (2), 241(2006).</li>
<li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America+B%22%5BJournal%5D)">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Journal of the Optical Society of America B. 19 (6), 1363(2002).</li>
<li>Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. H., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+vibrational+imaging+with+sum+frequency+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy.</a> Optics Letters. 36 (19), 3891(2011).</li>
</ol>

G. C. verklaart betrokken te zijn bij het bedrijf, Cambridge Raman Imaging, dat tot doel heeft de breedband SRS-microscopietechnologie te commercialiseren. De andere auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Breedband SRS-microscopie is een krachtige beeldvormingstechniek die authentiek chemisch contrast biedt om de chemische bestanddelen van een heterogeen monster te identificeren en te ontwarren. Het potentieel van dit analytische instrument kan gunstig zijn voor verschillende onderzoeksgebieden, variërend van materiaalkunde tot histopathologie. Het nadeel van breedband SRS-microscopie is het feit dat het technisch veeleisend is; de experimentalist vereist niet alleen kennis van breedbandlaserbronnen, maar moet ook de laserpulsen manipuleren om efficiënt SRS te genereren, een signaal dat op zijn beurt moet worden gemeten met geavanceerde detectieschema's. Dit artikel presenteert een protocol dat een workflow beschrijft om chemische kaarten van gemengde chemische verbindingen te produceren met behulp van een multiplex breedband SRS-microscoop. Hoewel het beschreven werk triviaal kan zijn voor sommige laserfysici en niet-lineaire microscopisten, is dit misschien niet het geval voor lezers die geïnteresseerd zijn in de voordelen van breedband SRS-microscopie waarvan de wetenschappelijke kennis zich buiten deze domeinen bevindt. Daarom wilden we elke stap gedetailleerd beschrijven om het brede publiek te begeleiden dat geïnteresseerd is in breedband SRS-microscopie.
Het protocol bij de hand begon met het laten zien hoe een eenvoudig maar spectroscopisch rijk monster te bereiden dat bestond uit verschillende sterke en bekende Raman-strooiers. We bespraken hoe we de breedbandpomp en smalband Stokes-balken konden verkrijgen die nodig zijn om een SRS-microscoop op te zetten. Figuur 5C toont een schema van de SHG- en OPO-opstellingen. Merk op dat lens f1 de fundamentele straal op LBO1 richt om de SHG te genereren, terwijl een dichroïsche spiegel de SHG-straling reflecteert en de resterende fundamentele straal doorgeeft. Een tweede lens f2 collimeert de SHG-bundel. Als f2 > f1 wordt de SHG-bundel uitgebreid met een factor gelijk aan f2/f1. Een derde lens f3 richt de uitgebreide SHG-bundel op een tweede Type I LBO-kristal (LBO2) gesneden op θ = 90° en φ = 29,0°. Door LBO2 te pompen met de eerder genoemde SGH (520 nm), zal straling binnen het bereik van 680-910 nm uit LBO2 komen door middel van verschilfrequentiegeneratie (DFG), waardoor twee bundels worden geproduceerd: het signaal en idler27 (figuur 5D, E). De laatste wordt weggegooid, terwijl de eerste wordt versterkt in de OPO-holte om de pomppulsen af te leveren die in de SRS-experimenten worden gebruikt. De pomp van de OPO bij 520 nm, namelijk de SHG-bundel, moet niet worden verward met de pomp van de SRS-experimenten (d.w.z. de signaalbundel van de OPO).
Het contrast in SRS-microscopie komt voort uit een niet-lineair signaal dat wordt gegenereerd op de brandpuntsplek van de microscoop, een signaal dat vereist dat een groot aantal fotonen op een bepaald moment in het monstervlak wordt beperkt. Deze fotonenopsluiting wordt bereikt met een microscoopobjectief met hoog numeriek diafragma (NA), een reeks lenzen die ook de ruimtelijke resolutie van het systeem bepaalt: hoe hoger de NA, hoe hoger de ruimtelijke resolutie. Hoge NA-objectieven zijn echter dicht opeengepakt met glas, wat positieve GDD introduceert voor gepulseerde straling, een frequentie-tjirp die uiteindelijk het temporele profiel van de pulsenverbreedt 39. De GDD die door het microscoopobjectief wordt geïntroduceerd, kan dus de duur van de breedbandpomppulsen verlengen, waardoor deze zelfs langer wordt dan de Stokes-temporele envelop en de effectieve, toegankelijke bandbreedte van het Raman-signaal wordt verminderd. Bovendien zou deze verbreding ook kunnen leiden tot een vervorming van het spectrale profiel van het gemeten SRS-spectrum.
In CARS ontstaat het spectroscopisch relevante signaal op golflengten die verschillen van die van de excitatievelden. Een eenvoudige fotomultiplicatorbuis of CCD-camera (charge-coupled device) kan worden gebruikt om het CARS-signaal op tijd te integreren, waarbij duizenden pulsen worden samengevat om de laserruis te berekenen. In plaats daarvan verschijnt het SRS-signaal als een zwakke modulatieoverdracht ingebed in een sterke en fluctuerende laserachtergrond. Omdat deze modulatie zwak is, kan de laserruis deze gemakkelijk overweldigen, waardoor zowel de beeldsnelheid als de gevoeligheid van de SRS-microscoop worden verminderd. Daarom is het vóór de beeldvorming noodzakelijk om de relatieve intensiteitsruis (RIN) te meten om te bepalen of de laser geschikt is voor snelle SRS-beeldvorming en om de modulatiefrequentie met de laagste ruis te selecteren. Het RIN wordt gedefinieerd als de spectrale dichtheid van het ruisvermogen [δP(f), met W2/Hz-eenheden] van de laser, genormaliseerd met het gemiddelde optische vermogen (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq02.jpg" style="margin: auto;">)40,41. Met andere woorden, het RIN beschrijft de genormaliseerde laserfluctuaties op verschillende frequenties (Eq [4]).
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq07.jpg" style="margin: auto;"> (4)
Het RIN is dus een parameter van het SRS-systeem die het ideale modulatiefrequentiebereik voor de experimenten bepaalt. De olijfbalk in figuur 8 toont bijvoorbeeld het ideale modulatiefrequentiebereik voor SRS-beeldvorming. In het geval van smalband SRS moet de gebruiker de RIN van zowel de pomp als de Stokes meten om te kiezen welke bundel moet worden gemoduleerd om optimale prestaties te bereiken. Merk bijvoorbeeld op uit figuur 8 dat de Stokes-bundel een iets hogere RIN heeft dan de pomp, wat impliceert dat de SRG-metingen luidruchtiger zouden uitpakken dan hun SRL-tegenhangers. In het geval van breedband-SRS is de bundel die moet worden gemoduleerd de smalbandbundel.
De hoekverdeling D van het rooster drukt de diffractiehoek uit als functie van de golflengte en wordt gedefinieerd als de afgeleide van de roostervergelijking. Voor de Littrow-configuratie wordt de hoekverdeling gegeven door Eq (5).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq08.jpg" style="margin: auto;"> (5)
Om Eq (5) te krijgen, gingen we uit van α = β, losten Eq (2) op voor m/d en voegden het resultaat toe in dβ/ dλ. Merk op dat in de Littrow-configuratie β = sin-1(mλ/2d). Binnen de benadering van de kleine hoek is de verandering in positie langs het spectrum fdβ ≈ dl (figuur 10). Door dβ in Eq (5) in te voegen, kunnen we dus de lineaire dispersie berekenen, een grootheid met eenheden van nm mm-1 met behulp van Eq (6):
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq09.jpg" style="margin: auto;"> (6)
Voor een diffractierooster in de Littrow-configuratie met 1.851,85 groeven/mm, d = 540 nm. Als we de eerste-orde diffractie van licht gebruiken bij ~789 nm, dan is D = 0,0027 rad nm-1. Met een f = 750 mm lens krijgen we een lineaire dispersie van ≈ 0,5 nm mm-1, wat zich vertaalt in ≈ 7,8 cm-1 mm-1. De brandpuntsafstand van de lens bepaalt dus de "dichtheid" van nm per mm op het detectorvlak: hoe langer de brandpuntsafstand, hoe minder nm per mm wordt verkregen, waardoor de ruimte tussen de spectraallijnen van de breedbandpomp toeneemt. Omgekeerd zal er bij kortere brandpuntsafstanden meer nm per mm op het detectorvlak zijn, waardoor de ruimte die door de verspreide pomp wordt ingenomen, wordt verminderd.
Gebalanceerde detectie verbetert de beeldkwaliteit en gevoeligheid van luidruchtige opstellingen. Volgens de RIN-spectra in figuur 8 en rekening houdend met typische SRS met een amplitude van 1 x 10-5 is de ongebalanceerde signaal-ruisverhouding (SNR) bijvoorbeeld ≈60. Met behulp van gebalanceerde detectie (d.w.z. dicht bij de shot-ruis) is het mogelijk om een SNR van ≈145 te bereiken. Figuur 11 toont spectra en samengestelde beelden onder evenwichtige en onevenwichtige omstandigheden. Uiteraard hebben de effecten van gebalanceerde detectie invloed op de eindresultaten van de experimenten, namelijk de chemische kaarten. Ondersteund door deze resultaten benadrukken we dat gebalanceerde detectie een krachtige techniek is om de schadelijke effecten van laserfluctuaties op de beeldkwaliteit tegen te gaan. Het is vermeldenswaard dat gebalanceerde detectie het meest geschikt is voor luidruchtige lasers, zoals vezeloscillatoren. SRS-microscopen die werken met stille optische lichtbronnen (bijv. Solid-state lasers) vereisen mogelijk geen gebalanceerde detectie.
Het protocol verklaart ook een benadering op basis van niet-lineaire optica om de spatiotemporale overlap tussen de pulsen van deze bundels te vinden. We beschreven de voordelen van het gebruik van de 1st in plaats van de 0e diffractie-orde van een AOM als de gemoduleerde Stokes-bundel. Verder werden de schadelijke effecten van dispersie op de SRS-opwekkingsefficiëntie beschreven met suggesties voor manieren om ze te verminderen via een prismacompressor. Daarnaast legt het protocol uit hoe de prisma's moeten worden uitgelijnd en worden drie kritieke aspecten belicht waarmee rekening moet worden gehouden voor optimale prestaties. We bespreken niet alleen de relevantie van het RIN voor SRS-microscopie, maar laten ook zien hoe het te meten met een lock-in versterker en, met het RIN-spectrum, de beste modulatiefrequentie te definiëren. Met een concreet voorbeeld legt dit artikel uit hoe de roostervergelijking helpt bij het ontwerpen van de detectieketen. Ten slotte illustreert het protocol, met echte SRS-gegevens, de structuur van de SRS-hyperkubus en hoe deze te analyseren met een conventioneel gebruikte wetenschappelijke programmeertaal.
Dit protocol heeft drie kleine beperkingen. Ten eerste bestaat het detectieschema dat in deze bijdrage wordt gebruikt uit een niet-conventionele, meerkanaals lock-in detector die in eigen huis is ontworpen en gebouwd door Sciortino et al.26 Zoals eerderaangetoond 25, kan deze detector worden vervangen door een kant-en-klare gebalanceerde fotodiode. Hoewel deze wijziging alleen betrekking heeft op de detector en het protocol vrijwel ongewijzigd laat, moet men met een enkele fotodiode elke spectrale component op de detector scannen in plaats van ze allemaal tegelijk te meten. Ten tweede maakt dit protocol gebruik van inline gebalanceerde detectie, waarvoor verschillende optische elementen in het bundelpad moeten worden ingevoegd. Deze optische elementen verhogen de complexiteit van het systeem en leiden tot verlies van optisch vermogen en pulsverbreding.
Inline gebalanceerde detectie vereist ook dat de twee pompreplica's door het monster gaan, een situatie die mogelijk niet ideaal is voor lichtgevoelige monsters, zoals levende cellen, of voor sterk birefringente monsters waarin de twee pompreplica's verschillende optische eigenschappen kunnen ervaren, waardoor de gebalanceerde detectie wordt geannuleerd. Ten derde vertrouwt het protocol op een zelfgebouwde OPO, een apparaat dat mogelijk niet direct beschikbaar is. Alternatieven voor de breedbandspectra die door de OPO worden geleverd, zijn echter het supercontinua van niet-lineaire optische vezels of bulkkristallen. De laatste kon alleen worden gebruikt met lasers met een lage herhalingssnelheid (tot 5 MHz). Dus, zoals bij elk experimenteel ontwerp, heeft het betreffende protocol enkele beperkingen. Ze zijn echter minimaal en brengen het succes van deze aanpak niet in gevaar.
Hoewel hier een referentiemonster wordt beschreven, kan dit protocol met succes chemische soorten in cellen en dierlijke en plantaardige weefsels, zoals cellulose, lipidesoorten of eiwitten, ontwarren, praktische toepassingen vinden in verschillende biochemische zoektochten of als een diagnostisch hulpmiddel in histopathologie. Evenzo kan dit protocol een waardevol hulpmiddel zijn in de materiaalwetenschappen. Volgens dit protocol kan men bijvoorbeeld de moleculaire samenstelling en concentratie van polymere soorten42 ondervragen. Bovendien is deze methodologie compatibel met andere niet-lineaire microscopietechnieken, zoals breedbandmicroscopie op basis van pompsonde43 en heterodyne CARS44, viergolfmengprocessen die, net als bij SRS, ook twee excitatielichtbundels en modulatie-overdrachtsmetingen vereisen. Ten slotte kan een deel van de informatie in dit artikel worden toegepast op niet-lineaire beeldvormingstechnieken die niet afhankelijk zijn van modulatieoverdrachtstechnieken, maar die twee of meer gepulseerde laserstralen vereisen, zoals conventionele CARS45- en SFG-microscopieën46.
Samenvattend beschrijft dit protocol een krachtige methodologie op basis van breedband SRS-microscopie om chemische kaarten en hun karakteristieke SRS-spectra uit chemisch heterogene mengsels te extraheren, waardoor datasets worden geleverd die eenvoudige kwantitatieve gegevensanalyse mogelijk maken. De veelzijdigheid en eenvoud van de methode geven de geïnteresseerde lezer ook de mogelijkheid om deze aan te passen aan verschillende niet-lineaire technieken.

Raman-microscopie is een krachtige beeldvormingstechniek die rijke chemische kaarten levert door Raman-verstrooiing1 te meten, een inelastisch stralingsproces dat afkomstig is van moleculen die trillen als reactie op invallend licht 2,3. Elke pixel van een Raman-kaart bevat een spectrum dat directe informatie bevat over de chemische samenstelling en structuur van het monster, wat resulteert in beelden met intrinsiek trillingscontrast. Tot op heden is Raman-microscopie het referentiestandpunt voor microspectroscopiestudies van moleculaire trillingen, omdat geen enkele andere beeldvormingstechniek beelden kan produceren met zowel een hoge chemische specificiteit als een hoge ruimtelijke resolutie4. Ondanks de uitstekende chemische specificiteit is de opwekkingsefficiëntie van Raman-verstrooiing laag, wat vraagt om langere pixelverblijftijden of excitatie met een hoog vermogen, wat respectievelijk leidt tot lage acquisitiesnelheden en incompatibiliteit met gevoelige monsters.
Deze enkele tekortkoming van Raman-microscopie leidde ertoe dat onderzoekers coherente Raman-verstrooiing 5,6,7,8,9 toepasten als een bron van contrast voor microscopie. Dit is een niet-lineair optisch proces dat de trillingsrespons met verschillende (tot zeven) ordes van grootte verbetert, waardoor snelle chemische beeldvorming 10,11,12,13 mogelijk is. In het bijzonder zijn de twee meest gebruikte coherente Raman-verstrooiingstechnieken coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS)14 en gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS)15. In tegenstelling tot CARS vertoont SRS een lineaire afhankelijkheid van de concentratie van resonante moleculen. Het is immuun voor de niet-resonante achtergrond, een niet-lineair effect dat geen verband houdt met enige trillingsovergang, maar vervormt voor de Lorentziaanse vormen die kenmerkend zijn voor de Raman-spectra van de moleculaire trillingen16,17. SRS-microscopie levert dus authentieke Raman-informatie op die directe kwantitatieve beeldanalyse mogelijk maakt.
SRS is een derde-orde, niet-lineair, optisch proces dat directe informatie geeft over de chemische bindingen van een monster. Het is afkomstig van de spatiotemporale superpositie van twee optische velden in het algemeen in het nabij-infrarode spectrale gebied, namelijk de pomp en de Stokes bij frequentie ωpu en ωS, respectievelijk 10,11,18. Deze superpositie genereert een kloppend op de pomp-Stokes frequentie detuning Ω = ωpu-ω S. Wanneer Ω overeenkomt met een moleculaire trilling ΩR, resoneert het molecuul, waardoor een coherente energieoverdracht ontstaat tussen de lichtvelden en het molecuul. Als gevolg hiervan bereikt het molecuul een trillingsaangeslagen toestand. Dit proces kan worden gevolgd door het meten van de vernietiging van pompfotonen (een signaal dat bekend staat als gestimuleerd Raman-verlies [SRL]) of de gelijktijdige versterking van Stokes-fotonen (een proces dat bekend staat als gestimuleerde Raman-versterking [SRG]). SRG en SRL zijn kleine signalen (ΔI) die bovenop een intense en fluctuerende achtergrond (I) zitten. Omdat typische waarden van het SRS-signaal (ΔI/I) zich in het bereik 10-6-10-4 bevinden, kan de laserruis het gemakkelijk verduisteren. Om de schadelijke effecten van de laserruis op de signaal-ruisverhouding (SNR) en bijgevolg op de beeldsnelheid te beperken, vertrouwt SRS-detectie op modulatieoverdrachtstechnieken (bijv. Lock-in-versterkers, resonantiecircuits of box-car averagers) bij hoge modulatiefrequenties (>1 MHz), waarbij de laserruis zijn minimumwaarden 15,19,20 bereikt.
Conventionele SRS-microscopie maakt gebruik van smalbandige (≈10 cm−1) pomp- en Stokes-pulsen om chemische beelden te produceren met een enkele trillingsfrequentie, waardoor videosnelheidsbeelden mogelijk zijn met pixelverblijftijden zo laag als ≈100 ns21,22. Omdat smalband SRS-microscopie echter chemische kaarten vormt door het monster sequentieel te scannen met slechts enkele trillingsfrequenties, is de informatie beperkt23. SRS-beelden met een of twee trillingscontrasten zijn mogelijk niet voldoende om chemische soorten met overlappende Raman-banden te onderscheiden, vooral binnen heterogene systemen. Daarom benut de paradigmatische smalband SRS-microscoop niet het volledige potentieel van SRS, omdat het onderzoeken van een handvol trillingsfrequenties de chemische specificiteit ervan belemmert en de schat aan informatie verwaarloost die is gecodeerd in trillingsspectra. Bovendien resulteert sequentieel scannen van het monster op verschillende frequenties in verlengde pixelverblijftijden die fotoschade kunnen veroorzaken en rigoureuze ruimtelijke coregistratie tussen opeenvolgende afbeeldingen kunnen voorkomen, wat leidt tot bewegingsartefacten.
In tegenstelling tot zijn smalbandige tegenhanger haalt breedband SRS-microscopie bij elke monsterscan een trillingsspectrum per pixel op 10,12,24. Breedband SRS biedt dus hyperspectrale beeldvorming met strikte ruimtelijke coregistratie van verschillende trillingscontrasten, waardoor rigoureuze gegevensanalyse mogelijk is. Dit onthult niet alleen de chemische bestanddelen van het monster via Raman-spectra, maar helpt ook om hun relatieve concentraties te bepalen. Afhankelijk van hoe de spectra worden verkregen, wordt breedband SRS-microscopie geclassificeerd als hyperspectrale SRS of multiplex SRS. In hyperspectrale SRS wordt het SRS-spectrum per gescand punt van het monster sequentieel verkregen (d.w.z. het wordt opgehaald door de frequentie-detuning Ω te vegen), waardoor een SRS-spectrum wordt opgebouwd door de SRS-signalen bij opeenvolgende Raman-verschuivingen samen te stapelen. Het Raman-spectrum wordt gelijktijdig gemeten bij verschillende trillingsmodi in multiplex SRS. De multiplex SRS-benadering combineert dus een gemoduleerde smalbandpuls met een breedbandpuls om het SRS-signaal op verschillende frequenties aan te drijven, en gebruikt een meerkanaalsdetector met een gevoeligheid die vergelijkbaar is met die van smalband SRS om de SRS-spectra te detecteren.
Dit artikel presenteert een protocol om chemische kaarten van heterogene monsters te produceren met behulp van multiplex SRS-microscopie. Een schema van de in dit protocol gebruikte SRS-microscoop is weergegeven in figuur 1 en elders in detail beschreven 25,26,27. Kortom, een commerciële modus-vergrendelde Yb fiberlaser, die 140 fs pulsen produceert gecentreerd op 1040 nm, met 10 W gemiddeld vermogen en een herhalingsfrequentie van 80 MHz, drijft de breedband SRS-microscoop aan. Een polariserende bundelsplitser (PBS) scheidt de fundamentele bundel in twee takken. Om de smalband stokes pulsen te produceren, wordt een tak met 4 W van de fundamentele bundel naar een etalon gestuurd die een smalbandige (≈15 cm-1) bundel genereert, die vervolgens wordt gemoduleerd op 1,6 MHz met een akoestische optische modulator (AOM). De resterende fractie met 6 W van de fundamentele bundel wordt frequentieverdubbeld met een 2,8 mm dik lithiumtriboraat (LBO) kristal, gesneden voor type-I fase matching (θ = 90°, φ = 13,8°). De resulterende tweede harmonische generatie bij 520 nm reist naar een X-gevouwen holte om een optische parametrische oscillator (OPO) te pompen, een apparaat dat een 3,0 mm dik LBO-kristal (type I fase matching, θ = 90 °, φ = 9,8 °) als actief medium gebruikt om een breedband optische straling af te geven die niet instelbaar is binnen het spectrale gebied van 680-910 nm (figuur 2). Deze breedbandpulsen dienen als de pomp in de SRS-experimenten en verspreiden zich naar een prismacompressor om de dispersie-effecten veroorzaakt door het microscoopobjectief te precompenseren.
Na de compressiefase produceert een λ/2-golfplaat, gecombineerd met een YVO4 birefringentplaat, twee orthogonaal gepolariseerde replica's waarvan de elektronische aftrekking aan het detectievlak het geluid van de breedbandpomp annuleert. Een dichroïsche spiegel combineert de pomp en Stokes-stralen en stuurt ze naar een rechtopstaande microscoop. Een water-immersie objectief met een numeriek diafragma (NA) van 1,27 richt het licht op het monster, terwijl een olie-onderdompeling objectief met een NA van 1,4 het verzamelt. Vóór de detectiefase verwijdert een kortdoorlaatfilter (SPF) de gemoduleerde Stokes, terwijl een diffractierooster dat in Littrow-configuratie werkt, de verzonden breedbandpomp dispergeert. Een tweede PBS2 scheidt de pompreplica's en een lens richt ze op twee fotodiode-arrays. De signalen van deze fotodiode-arrays worden elektronisch afgetrokken en verzonden naar een zelfgebouwde meerkanaals-lock-in versterker (M-LIA). Het gedemoduleerde signaal wordt vervolgens genormaliseerd door de gelijkstroom (DC) metingen van een van de fotodiode-arrays, waardoor het SRL-spectrum wordt geproduceerd.
Als voorbeeldig experiment stellen we mengsels van verschillende bekende Raman-strooiers in beeld, elk met een uniek Raman-spectrum. Het protocol begint dus met het beschrijven van hoe de referentiemonsters moeten worden voorbereid. Terwijl we SRL detecteren, blijven we uitleggen hoe we smalband stokespulsen kunnen verkrijgen en de optische bron kunnen instellen die de breedband (≈250 cm-1) pomppulsen levert, namelijk de zelfgebouwde OPO. Het protocol toont de uitlijning en optimalisatie van de optische bundels en beschrijft kritische parameters zoals het vermogen en de spectra van de smalband Stokes en de breedbandpomp. Het protocol beschrijft in detail het optische pad van de breedbandpomp omdat het speciale optische elementen vereist. Het legt ook uit hoe de spatiotemporale overlap tussen pomp-Stokes-pulsen kan worden gevonden en toont een praktische manier om de relatieve intensiteitsruis (RIN) te bepalen, wat op zijn beurt helpt bij het definiëren van de beste modulatiefrequentie voor SRS-experimenten. Vervolgens leggen we het werkingsprincipe en de kalibratie van de detectieketen uit. Ten slotte toont het protocol het data-acquisitieproces, chemometrie en beeldverwerkingspijplijn.

<table><tbody><tr><td>Collectieobjectief</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon</td><td>Olie-immersieobjectief</td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Thermo Fisher</td><td>043211-KJ</td><td>Kwarts, dekglas voor microscoopglaasje, 25,4 x 25,4 x 0,15 mm</td></tr><tr><td>Vertragingslijn</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>M-406.6PD</td><td>Precisie microtranslatie-standaard, 150 mm reisbereik</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>D8418-500ML</td><td>Methylsulfinylmethaan, Moleculaire Biologie Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide</td></tr><tr><td>Etalon</td><td>SLS Optics Ltd</td><td>Op maat gemaakt</td><td>Anti reflecterende coating bij 1.040 nm, Gemonteerd in een roestvrijstalen cel met een diameter van 38 mm x 35,5 mm lang met beschermende stofdoppen, en een 'pinch-clamp' montagering met een diameter van 50 mm</td></tr><tr><td>Excitatievergroting</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon</td><td>Waterimmersieobjectief</td></tr><tr><td>Raster</td><td>LightSmyth</td><td>T-1850-800s Serie</td><td>Hoge efficiëntie transmissie rooster T-1850-800s Serie</td></tr><tr><td>Laser</td><td>Coherent</td><td>Op maat gemaakt</td><td>Fidelity, HP</td></tr><tr><td>λ/2</td><td>Thorlabs</td><td>SAHWP05M-1700</td><td>Gemonteerde superachromatische halfgolfplaat</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thorlabs</td><td>CM5-PBS203/M</td><td>16 mm Kooi-Cube-Gemonteerde Polariserende Stralingssplitter Cube,</td></tr><tr><td>PMMA kralen</td><td>Merck</td><td>MFCD00198073</td><td>Micro deeltjes op basis van polymethacrylaat</td></tr><tr><td>Prismen</td><td>Crisel</td><td>320-8218</td><td>LASER DISPERSERENDE PRISMA'S in SF11</td></tr><tr><td>PS kralen</td><td>Merck</td><td>72986-10ML-F</td><td>Micro deeltjes op basis van polystyreen</td></tr><tr><td>YVO4 kristal</td><td>Dr. Sztatecsny GmbH</td><td>Op maat gemaakt</td><td>dikte 8 mm, dia 1,00 cm, 1 689,00 689,00 geschikt voor 1" montage, gecoat voor 850 - 1.100 nm</td></tr></tbody></table>

multiplex chemische beeldvorming op basis van breedband gestimuleerde raman-verstrooiingsmicroscopie

Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopie is een niet-lineaire optische techniek voor labelvrije chemische beeldvorming. Deze analytische tool levert chemische kaarten met hoge snelheid en hoge ruimtelijke resolutie van dunne monsters door hun moleculaire trillingen rechtstreeks te onderzoeken. In de standaardimplementatie is SRS-microscopie smalbandig en vormt het beelden met slechts één trillingsfrequentie tegelijk. Deze benadering belemmert echter niet alleen de chemische specificiteit van SRS, maar verwaarloost ook de schat aan informatie die is gecodeerd in trillingsspectra. 
Deze beperkingen kunnen worden overwonnen door breedband SRS, een implementatie die in staat is om parallel een trillingsspectrum per pixel van het beeld te extraheren. Dit levert hyperspectrale gegevens op die, in combinatie met chemometrische analyse, de hoeveelheid informatie die uit het monster wordt opgehaald, maximaliseren. Breedband-SRS verbetert dus de chemische specificiteit van het systeem, waardoor de kwantitatieve bepaling van de concentratie van de verschillende bestanddelen van een monster mogelijk is. Hier rapporteren we een protocol voor chemische beeldvorming met breedband SRS-microscopie, gebaseerd op een zelfgebouwde SRS-microscoop die werkt met een aangepaste differentiële meerkanaals-lock-in versterkerdetectie. Het bespreekt de monstervoorbereiding, uitlijning van het SRS-apparaat en chemometrische analyse. Door vibrationele Raman-spectra te verkrijgen, illustreert het protocol hoe verschillende chemische soorten in een mengsel kunnen worden geïdentificeerd en hun relatieve concentraties kunnen worden bepaald.

Figuur 3 toont voorbeeldige resultaten verkregen met behulp van dit protocol met PS, PMMA en olijfolie. Deze rotatie van LBO1 zal de brekingsindex veranderen die door het SHG-veld wordt ervaren, waardoor de fasesnelheid direct wordt gewijzigd. Wanneer de fasesnelheid van het SHG-veld overeenkomt met die van de niet-lineaire polarisatie geïnduceerd in LBO1, zullen het niet-lineair gegenereerde veld en de niet-lineaire polarisatie in fase zijn, wat leidt tot intense SHG-straling. Met andere woorden, het aanpassen van de φ hoek van LBO1 zal de gebruiker in staat stellen om de ideale fase-matchingconditie voor SHG te bereiken. Omdat hier een Type I fase matching kristal wordt gebruikt, zal de polarisatie van de SHG-bundel orthogonaal zijn ten opzichte van die van de fundamentele bundel (figuur 5B).
Figuur 8 toont het RIN van de optische bronnen die in dit protocol worden gebruikt en de shot-noise limiet, die een gevolg is van de kwantumaard van elektronen en fotonen die een fundamentele limiet stelt aan de laserruis. De RIN met shotruisbeperkte wordt berekend met <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq05.jpg" style="margin: auto;"> zoals aangegeven door Eq (3).
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63709/63709eq06.jpg" style="margin: auto;"> (3)
Waarbij h de constante van Planck is en ν de optische frequentie. De schotruis biedt dus nuttige richtlijnen voor het elektronica-ontwerp.
Figuur 11A en figuur 11C tonen voorbeeldige gegevens van gebalanceerde en onevenwichtige spectra. Uiteraard hebben de effecten van gebalanceerde detectie invloed op de eindresultaten van de experimenten, namelijk de chemische kaarten. Figuur 11B en figuur 11D tonen samengestelde beelden in respectievelijk de onevenwichtige en evenwichtige omstandigheden. Het succesvol implementeren van het beschreven protocol zal helpen bij het identificeren en lokaliseren van de verschillende chemische bestanddelen van een heterogeen monster en het extraheren van hun karakteristieke SRS-spectra. Het onderwerpen van de hyperspectrale gegevens van figuur 12 aan chemometrische analyse geeft figuur 13. Figuur 13A toont een samenstelling van de concentratiekaarten van de verschillende chemische bestanddelen van het monster, terwijl figuur 13B hun karakteristieke SRS-spectra toont. Merk op dat de gegevens in figuur 13A de gebruiker niet alleen in staat stellen om de verschillende bestanddelen van het monster gemakkelijk te identificeren, maar ook om meer kwantitatieve analyses uit te voeren. Door bijvoorbeeld de concentratiekaarten te gebruiken, konden we het gemiddelde van de fractionele concentratie van elke chemische soort berekenen: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS en 22% olijfolie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van de breedband SRS-microscoop die in dit protocol wordt gebruikt. Afkortingen: PBSx = polariserende beamsplitter; SHG = tweede harmonische generatie module; OPO = optische parametrische oscillator; AOM = acousto optische modulator; SPF = kortdoorlaatfilter; M-LIA: Meerkanaals lock-in versterker; DM = dichroïsche spiegel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig02.jpg"> Figuur 2: Spectra van de afstembare breedbandpomp (blauw) en de smalbandige (rode) Stokes-balken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig03.jpg"> Figuur 3: Brightfield-afbeelding van het chemisch heterogene monster. Merk op dat conventionele microscopie het niet mogelijk maakt om de verschillende bestanddelen te onderscheiden. Schaalbalk = 100 μm. Afkortingen: PS = polystyreen; PMMA = polymethylmethacrylaat; DMSO = dimethylsulfoxide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig04.jpg"> Figuur 4: Modulatie van de smalband stokes pulsen. (A) Het transparante blauwe spoor toont de 0e diffracted bundel, terwijl de zwarte de overeenkomstige1e orde toont. (B) Optische opstelling voor het optimaliseren van de modulatie-efficiëntie van de1e orde diffracted beam en het finetunen van de spotgrootte van de Stokes-bundel voordat het excitatiedoel wordt bereikt. Afkortingen: AOM = acousto optic modulator; fx = brandpuntsafstand van lens X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig05.jpg"> Figuur 5: Niet-lineaire optische processen die nodig zijn om de OPO aan te sturen. (A) Geometrie van de SHG-interactie. Twee fundamentele fotonen bij ω1 brengen het materiële systeem naar een hoogenergetisch virtueel niveau, van waaruit het materiële systeem naar de grondtoestand springt en een foton uitzendt bij ωSHG. (B) Schema van het SHG-experiment. (C) Een schema van de SHG- en OPO-opstellingen. (D) Geometrie van de DFG-interactie. Een ωSHG-foton wordt gesplitst in de signaalfotonen (ωSignaal) en idler (ωIdler). Een versterking van de signaalbundel wordt bereikt door de signaalfotonen terug te voeren en ze in de holte te laten resoneren. (E) Schema van het DFG-experiment. Afkortingen: SMx = bolvormige spiegel (R = 75 mm); OPO = optische parametrische oscillator; SHG = tweede harmonische generatie module; DFG = verschilfrequentie generatie; LBO = lithiumtriboraat; OC = oliecondensor; DM = dichroïsche spiegel; fx = brandpuntsafstand van lens X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig06.jpg"> Figuur 6: Geometrie van de prismacompressor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig07.jpg"> Figuur 7: Het genereren van somfrequenties om de spatiotemporale overlap te optimaliseren. (A) SFG tussen de pomp en Stokes en hun respectieve SHG die op een scherm ingrijpt. Hier richtte een lens de pomp en de Stokes-stralen op het kristal, terwijl een laagdoorlaatfilter ze verwijderde. (B) Intensiteit van de SFG tussen pomp en Stokes als functie van tijdsvertraging. Stel de tijd nul van de SRS-instelling in op de positie die de SFG maximaliseert. De asymmetrie van de kruiscorrelatie in B is te wijten aan het temporele profiel veroorzaakt door de etalon op de Stokes-bundel. Afkortingen: SFG = sum-frequency generation; SHG = tweede harmonische generatie module; SRS = stimuleerde Raman verstrooiingsspectroscopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig08.jpg"> Figuur 8: RIN-spectra. De in het groen gemarkeerde band toont het beste spectrale gebied voor de SRS-experimenten. Het moduleren van de Stokes-straal op elke frequentie binnen deze band garandeert dat de effecten van de laserruis op het SRS-signaal zo laag mogelijk zullen zijn. Afkortingen: RIN = relatieve intensiteit ruis; SRS = stimuleerde Raman verstrooiingsspectroscopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig09.jpg"> Figuur 9: Balkprofielen. (A) Pomp, (B) Stokes en (C) pomp en Stokes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig10.jpg"> Figuur 10: Veronderstelde geometrie voor een dispersierooster en een fotodiode array detector. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig11.jpg"> Figuur 11. De effecten van gebalanceerde detectie. Effecten op spectra (A, C) en chemische beelden (B, D). De composieten in panelen (B) en (D) zijn de eindresultaten van de experimenten (d.w.z. na chemometrische analyse van hyperspectrale gegevens. Zie protocolsectie 4 voor meer informatie). Schaalbalken = 10 μm. Afkorting: SRS = gestimuleerde Raman verstrooiing spectroscopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig12.jpg"> Figuur 12: Een representatieve SRS-hyperkubus verkregen met breedband SRS-microscopie. Het x-y-vlak slaat de coördinaten van de gescande posities op, terwijl elke vector langs z een SRS-spectrum registreert. Afkorting: SRS = gestimuleerde Raman verstrooiing spectroscopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig12large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig13.jpg"> Figuur 13: Chemometrische analyse van hyperspectrale SRS-gegevens. (A) Samenstelling van de concentratiekaarten van de verschillende bestanddelen van het monster. (B) Karakteristieke spectra van de chemische soort. In beide panelen geel: olijfolie, blauw: DMSO, cyaan: PS en oranje: PMMA. Schaalbalk = 20 μm (A). Afkortingen: SRS = gestimuleerde Raman verstrooiing spectroscopie; PS = polystyreen; PMMA = polymethylmethacrylaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig13large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We presenteren een protocol om chemische beelden te verkrijgen met breedband gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie. Gebaseerd op een SRS-microscoop die werkt met differentiële meerkanaals-lock-in detectie, beschrijft het protocol de monstervoorbereiding, aanpassing van het SRS-apparaat en chemometrie om verschillende bestanddelen van chemisch heterogene monsters te ontwarren.

Multiplex chemische beeldvorming op basis van breedband gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a nonlinear optical technique for label-free chemical imaging. This analytical tool delivers chemical maps ...

Ons protocol beschrijft hoe een gestimuleerde Raman Scattering Microscopie te bouwen, die het mogelijk maakt om het trillingsspectrum van de moleculen binnen microseconden te meten. En wanneer het wordt toegepast op beeldvorming, kan het hyperspectrale microscopie bieden om de chemische bestanddelen van de materie op een labelvrije en niet-invasieve manier te lokaliseren en te kwantificeren. Er zijn verschillende toepassingen van dit protocol, voornamelijk in de biologische en biomedische wetenschappen.Bijvoorbeeld om cellen, of weefsels, in beeld te brengen. Er zijn twee belangrijke uitdagingen voor onze aanpak, de breedband optische bron en de detectieketen. Om het eerste aan te pakken, kan men een OPR kopen of er zelf een bouwen.Als alternatief kan men het witte licht supercontinuum gebruiken dat wordt gegenereerd in bulkkristallen of in niet-lineaire optische vezels. De laatste uitdaging kan worden aangepakt door achtereenvolgens elke spectrale component te scannen met een commerciële fotodiode en een galvo-scanner Om te beginnen, extraheer twee microliter uit een waterige suspensie van polymethylmethacrylaat of PMMA-microbeads en giet de suspensie op een microscoopdeksel. Haal vervolgens twee microliter uit een waterige suspensie van polystyreen microbeads en combineer deze met de PMMA-suspensie op de afdekslip.Meng de suspensie voorzichtig met een pipetpunt en laat deze 24 uur drogen. Een witte laag kralen verschijnt bovenop de afdekslip wanneer het water opdroogt. Voeg 20 microliter dimethylsulfoxide en 20 microliter pure olijfolie toe aan de afdekslip.En breng nagellak aan op de randen van de tweede microscoopdekselslip. Plaats de afdekslip op het mengsel, met de nagellak naar beneden gericht, en oefen voldoende druk uit om het af te sluiten. Laat het drogen.Om de modulatie-efficiëntie van de smalbandige Stokes-bundel te optimaliseren. Verander de afstand tussen de lenzen F1 en F2 en meet de gemoduleerde bundel met een fotodiode. Neem vervolgens het profiel op met een oscilloscoop.Pas de holtelengte van de optische parametrische oscillator zodanig aan dat het resulterende breedbandpompspectrum, samen met de smalband stokes op 1040 nanometer, een frequentie-de-tuning kan produceren binnen 2, 800 tot 3, 100 inverse centimeters. Dit spectrale bereik omvat de trillingen van het CH-rekgebied. Stuur de breedbandpomp naar een prismacompressor om de dispersie-effecten van het excitatiemicroscoopobjectief te compenseren.Voer de pomp in prisma A, door de top, en leid de gedispergeerde pomp naar de top van prisma B. Definieer de hoeveelheid negatieve dispersie die nodig is en stel de afstand tussen de prisma's dienovereenkomstig in. Gebruik Brewster-snijprisma's en zorg ervoor dat de polarisatie van de pompstraal binnen de driehoekige vlakken van de prisma's ligt. Om het inline gebalanceerde detectieschema te optimaliseren, stelt u de snelle as van dit birefringente kristal verticaal in en leidt u de gepolariseerde pomp naar een YV04-plaat met een lengte van 13,3 millimeter.Gebruik vervolgens een halvegolfplaat om de polarisatie van de pompbundel in te stellen op 45 graden. Combineer de pomp en de Stokes-balken met een dichroïsche spiegel en lijn ze voorzichtig uit met een paar fluorescerende gaatjes. Zorg ervoor dat beide balken zich co-lineair voortplanten.Demp de balken en leid ze naar een snelle fotodiode om ze tijdelijk te overlappen. Verwijder daarna de fotodiode. Meet vervolgens de bundelprofielen met een gekalibreerde camera en gebruik een infraroodkaart om de diameters met het oog te schatten.Gebruik twee telescopen. Een voor de pomp en een voor de Stokes-straal, en probeer de straaldiameters af te stemmen op de achteropening van het excitatieobjectief. Zodra de gestimuleerde Raman-verstrooiing, of SRS-signaal, is verkregen, gebruikt u de telescoop op de pompstraal om de diameter aan te passen, waarbij het Rayleigh-bereik wordt gevarieerd en bijgevolg het interactievolume bij de focus van de microscoop.Stop wanneer de maximale SRS is bereikt. Gebruik een fotodiode om de intensiteit van de pompstraal te meten en bereken met de responsiviteit van de fotodiode het gemiddelde vermogen dat het actieve gebied van de detector beïnvloedt. Om de relatieve intensiteitsruis van de laser te meten, koppelt u het laagdoorlaatfilter los en sluit u de uitgang van een fotodiode met hoge bandbreedte aan op de ingang van een lock-in versterker.Sla de lock-in uitgang op in volt over de vierkantswortel van Hertz bij verschillende demodulatiefrequenties en gebruik de responsiviteit van de fotodioden om volt om te zetten in Watt. Leid de pomp en de Stokes-stralen naar de microscoop. Plaats het monster en zoek een gebied zonder kralen om de pompstraal uit te lijnen.Maak vervolgens de excitatie- en verzameldoelstellingen confocaal. Plaats een shortpassfilter om de gemoduleerde Stokes te verwijderen en leid de pompstraal naar de nivellering. Plaats een lens na de sortering om de gedispergeerde straal op de detectoren te richten.Meet voor een gebalanceerde detectie het spectrum van de referentie en de signaalreplica's die zich langs de pompbundel voortplanten. Plaats een kleine spleet, of een iris, tussen de grading en een polariserende bundelsplitser, om de spectrale matching tussen de twee fotodiode-arrays te garanderen en om de gedispergeerde pomp ruimtelijk te filteren. Clip alle spectrale componenten van de pompreplica's op één na om de uitgezonden stralen te centreren op de Nth-detector van de referentie- en signaalfotodiode-arrays.Gebruik de stuurspiegels om de correlatie van de verschillende detectiekanalen aan te passen. Om de SRS-microscopie te starten: moduleer de Stokes, rasterscan het monster en verkrijg de modulatieoverdracht op het pompspectrum met het bijbehorende DC-spectrum om het genormaliseerde SRS-spectrum van elke pixel te krijgen. Produceer driedimensionale matrices, waarvan de rijen en kolommen de gescande posities van het monster bevatten.Sla op elke vector orthogonaal naar het XY-vlak een SRS-spectrum op. Zet de concentratie en de spectrale profielen uit om de chemische beelden en de karakteristieke spectra van de chemische bestanddelen van het monster te verkrijgen. De representatieve afbeelding toont de relatieve intensiteitsruispectra van de optische bronnen die in dit protocol worden gebruikt.Hier is het beste spectrale gebied voor de SRS-experimenten. Het moduleren van de Stokes-straal op elke frequentie binnen deze band garandeert dat de effecten van de laserruis op het SRS-signaal zo laag mogelijk zullen zijn. Een voorbeeld van de ongebalanceerde en gebalanceerde spectra worden hier getoond.De effecten van gebalanceerde detectie beïnvloeden de eindresultaten van de experimenten. Namelijk de chemische kaarten. De samengestelde beelden in de onevenwichtige en evenwichtige omstandigheden worden hier getoond.De representatieve beelden tonen een chemometrische analyse van de hyperspectrale SRS-gegevens. Een samenstelling van de concentratiekaarten van de verschillende chemische bestanddelen van het monster en hun karakteristieke SRS-spectra worden hier weergegeven. Uit deze gegevens kunnen de verschillende bestanddelen van het monster, bijvoorbeeld olijfolie, DMSO-polystyreen en polymethylmethacrylaat, gemakkelijk worden geïdentificeerd.Momenteel kan onze techniek alleen de CH-vibratie stretching onderzoeken. Door de optische bron te optimaliseren, stelt dezelfde detectieketen ons echter in staat om het meer informatieve vingerafdrukgebied te verkennen dat verschillende modi tegelijk detecteert. Onze detectieketen maakt de weg vrij voor de integratie van breedband-SRS in de klinieken en introduceert een technologie die de traditionele histopathologische workflow voor weefseldiagnose zal aanvullen en verbeteren.

multiplex-chemical-imaging-based-on-broadband-stimulated-raman

Research

JoVE Journal

Engineering

Techniek

Source: Espinoza, R., et al. Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis. J. Vis. Exp. (2022). The video demonstrates two-color stimulated Raman scattering (SRS) imaging of mouse brain tissue sections. Two synchronized laser beams are directed onto the tissue section to excite molecular vibrations, resulting in a relative intensity change in the beams. Lipids and proteins in the tissue are detected using distinct frequency pairs of the laser...

Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain Tissue

In dit manuscript wordt de implementatie beschreven van een gestimuleerde Raman verstrooiing (SRS) Microscoop, verkregen door de integratie van een SRS experimentele opstelling met een laser scanning microscoop. De SRS-Microscoop is gebaseerd op twee femtosecondelaser (FS) laserbronnen, een TI-Sapphire (TI: SA) en gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (OPO).

Implementatie van een niet-lineaire Microscoop op basis van gestimuleerde Raman verstrooiing

Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is een krachtige, niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechniek. Een opkomende toepassing is gestimuleerde Raman-histologie, waarbij tweekleurige SRS-beeldvorming bij de eiwit- en lipide Raman-overgangen wordt gebruikt om pseudo-hematoxyline- en eosinebeelden te genereren. Hier demonstreren we een protocol voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming voor weefseldiagnose.

Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose

Elektronische pre-resonantie gestimuleerde Raman-verstrooiing (epr-SRS) beeldvorming van regenboogachtige Raman-kleurstoffen is een nieuw platform voor sterk gemultiplexte epitoop-gebaseerde eiwitbeeldvorming. Hier presenteren we een praktische gids met antilichaamvoorbereiding, weefselmonsterkleuring, SRS-microscoopassemblage en epr-SRS-weefselbeeldvorming.

Hoog-gemultiplexte weefselbeeldvorming met Raman-kleurstoffen

Dit artikel presenteert de integratie van een spectrale focusmodule en een dual-output pulslaser, waardoor snelle hyperspectrale beeldvorming van gouden nanodeeltjes en kankercellen mogelijk wordt. Dit werk is bedoeld om de details van multimodale niet-lineaire optische technieken te demonstreren op een standaard laserscanmicroscoop.

Biomoleculaire beeldvorming van cellulaire opname van nanodeeltjes met behulp van multimodale niet-lineaire optische microscopie

Dit artikel vergelijkt direct de resolutie, gevoeligheid en beeldcontrasten van gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) en coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) geïntegreerd in hetzelfde microscoopplatform. De resultaten laten zien dat CARS een betere ruimtelijke resolutie heeft, SRS betere contrasten en spectrale resolutie geeft, en beide methoden hebben een vergelijkbare gevoeligheid.

Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

Door gebruik te maken van een multimodaal platform dat labelvrije optische beeldvormingsmodaliteiten combineert, hebben we een protocol ontwikkeld voor het visualiseren en kwantificeren van cellulaire dynamiek en metabolisme. Door middel van beeldvorming via multifotonfluorescentie, tweede harmonische generatie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie kunnen we een holistisch overzicht van de cellulaire en moleculaire omgeving genereren.

Multimodaal optisch beeldvormingsplatform voor het bestuderen van cellulair metabolisme

Een grootveld-Fourier-transform microscoop, gebaseerd op een compacte en ultrastabiele birefringent interferometer, maakt het mogelijk om spectra parallel te verkrijgen voor alle pixels van een 2D-detector. De tijddomeinbenadering maakt het mogelijk fotoluminescentie- en Raman-signalen te ontwarren, en maakt snelle Raman-mapping mogelijk (~5 ms/pixel) met een ruimtelijke resolutie van ~1 μm en een spectrale resolutie van 23 cm-1 .

Een multimodale breedveld-Fourier-transformatie Ramanmicroscoop

Leer multiplex chemische beeldvorming met breedband gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie. Deze labelvrije methode maakt snelle kwantificering van chemische componenten in biologische monsters mogelijk.

Multiplex chemische beeldvorming op basis van breedband gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Meer video's verkennen