Vezeltype en subcellulair-specifieke analyse van lipidedruppelgehalte in skeletspieren

Dit protocol maakt de kwantificering van lipidedruppels en de analyse van hun morfologie en subcellulaire distributie op een vezeltypespecifieke manier mogelijk. Deze techniek maakt de gelijktijdige verwerking van verschillende spieren mogelijk, waardoor tijd wordt bespaard en artefacten worden vermeden die kunnen optreden wanneer ze onafhankelijk worden verwerkt. Het maakt ook de automatisering van lipidedruppeltjes kwantificering mogelijk.

Myosteatose werd beoordeeld in mariene spieren, maar dit protocol kan worden vertaald naar mensen in verschillende omstandigheden, zoals obesitas, veroudering en kanker. Het herkennen van dezelfde vezels in parallelle sectie kan moeilijk zijn, maar opmerkelijke structuren zoals axon tweaks of spierspindels zijn goede oriëntatiepunten die de onderzoeker zullen helpen dezelfde vezels op beide dia's te lokaliseren. Plaats om te beginnen twee seriële cryo bevroren doorsneden van het spiermonster op twee vooraf gelabelde hechtingsglaasjes.

Eén dia om vezeltypen te bepalen en de andere om het lipidengehalte te kwantificeren. Voor immunohistochemische detectie van het spiervezeltype, omring de secties met een omtrek getekend met een hydrofobe pen. Plaats het in een vochtige kamer en spoel het af met ijskoude 0,1 molaire PBS gedurende één minuut bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens de PBS, voeg de blokkerende oplossing toe aan de dia en incubeer gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder later de blokkerende oplossing en incubeer de dia's gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius met de oplossing die de primaire antilichamen bevat. Was de dia's driemaal met PBS gedurende vijf minuten elk, op kamertemperatuur.

Voeg de oplossing met de secundaire antilichamen toe en incubeer de dia's in het donker gedurende één uur bij kamertemperatuur, zorg er vervolgens voor dat de dia uit de buurt van het licht wordt gehouden en ga verder met de drie wasbeurten in PBS gedurende elk vijf minuten, spoel de dia vervolgens af in dubbel gedestilleerd water, monteer na het verwijderen van het overtollige water de dia met antifadereagens en bewaar deze bij vier graden Celsius beschermd tegen licht. Om de lipidedruppel met body te kleuren, omringt u het spiergedeelte met een omtrek getekend door een hydrofobe pen voordat u het gedurende 10 minuten spoelt met ijskoude 0,1 molaire PBS. Beide dia's moeten tegelijkertijd worden gekleurd.

Bevestig de sectie met koud vier procent paraformaldehyde zonder methanol gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na de eerste snelle spoeling de dia's driemaal met PBS gedurende vijf minuten wassen. Blokkeer de dia met 5% normaal geitenserum in PBS gedurende één uur in de menselijke kamer.

Gevolgd door het incuberen van de dia met de oplossing van het primaire antilichaam bestaande uit 2% normaal geitenserum en rattenanti-laminine in PBS gedurende 90 minuten. Na het driemaal wassen van dia's in PBS, voert u de volgende incubatie uit met de secundaire antilichaamoplossing die geit, anti-rat, Alexa fluor 647-antilichaam in PBS bij kamertemperatuur gedurende één uur bevat. Zorg ervoor dat de dia beschermd is tegen het licht.

Na incubatie was de glijbaan driemaal met PBS. Incubeer vervolgens de sectie gedurende 20 minuten met dapi en bodipy-oplossing. Na een snelle spoeling, was driemaal met PBS en eenmaal met dubbel gedestilleerd water, verwijder dan het overtollige water en monteer het gedeelte met een anti-fade reagens.

Zodra de spier is gescand, uploadt u de vastgelegde digitale afbeeldingen naar elke beeldverwerkingssoftware voor reconstructie. Op basis van de vezelmorfologie en de histologie van de spiersectie, slaat u de afbeelding op in een geschikt formaat met alle kanalen samengevoegd. Voor bodipy beeldobservatie en -acquisitie stelt u de parameters in voor een confocale microscoop, met een 40 X olie-onderdompelingsobjectieflens en een numeriek diafragma van 1,4, zoals beschreven in het manuscript.

Om kruisverwijzing tussen bodipy en 558, 568 en laminine Alexa fluor 647 te voorkomen; Gebruik de sequentiële scanmodus op de confocale software. Excite bodipy en 493, 503 met behulp van de 488 nanometer laserlijn of argonlaserlijn, en excite bodipy en 555, 568 met behulp van de 561 nanometer diodelaserlijn. Detecteer ten slotte laminine Alexa fluor 647 met een 640 nanometer diodelaserlijn, afhankelijk van de gekozen kleurstof, stel de emissiesnelheden in op 570 tot 650 nanometer voor lichamelijk lichaam en 493, 503.

En op 565 tot 620 nanometer voor bodipy en 558, 568. Stel het emissiebereik voor laminine in op 656 tot 700 nanometer. Stel vervolgens de versterking en digitale versterking op de juiste manier in om te voorkomen dat verzadigde pixels op de bereikindicator worden gedetecteerd.

Corrigeer het achtergrondsignaal door de offset aan te passen. Om het type vezel op de confocale microscoop te identificeren, gebruikt u een laptop waarop het beeld van de eerder gereconstrueerde dia met de immunodetectie van het vezeltype kan worden gecontroleerd. Zodra een groep vezels correct is geïdentificeerd, krijgt u het beeld met de bodipy- en lamininekanalen.

Open elke afbeelding met behulp van de importeur van het bioformat uit Fiji. Selecteer onder de weergavestapel met optie hyperstapel, vervolgens kleurmodus en standaard. Zorg ervoor dat het venster voor automatisch schalen is geselecteerd.

Gebruik de selectietool met de vrije hand om handmatig het sarcolemma van de vezel te selecteren op basis van het lamininekanaal. En druk op T op het toetsenbord om de interesseregio in het ROI-venster vast te leggen. Ga naar het hoofdvenster van Fiji en klik op analyseren en metingen instellen.

Selecteer vervolgens in het pop-upvenster het gebied en laat voor verhoogde diameter de resterende vakjes uitgeschakeld en andere parameters zoals ze standaard worden weergegeven. Klik op meten in het ROI-venster om het gebied en minimaal voor de verhoogde diameter van de geselecteerde vezel te verkrijgen en noteer ze voor later gebruik. Bereken de waarde van een zesde van de minimale voor verhoogde diameter om het centrale deel van de vezel af te bakenen.

Klik op het ROI-venster, klik op toevoegen om een duplicaat van de eerste ROI te hebben en selecteer de tweede ROI die in het venster verschijnt. Klik in het hoofdvenster van Fiji op bewerken, vervolgens op selecteren en vergroten. Om de eerder berekende waarde met een minteken voor het getal in te voeren en op ok te klikken.

Klik in het ROI-venster op toevoegen, een derde ROI moet verschijnen en verwijderen om de tweede ROI te verwijderen. Selecteer in het ROI-venster beide ROI's en klik op meer dan ZOR en voeg toe, wacht tot een derde ROI verschijnt die overeenkomt met de periferie van de vezel. Als een heranalyse van dezelfde vezels nodig is, slaat u de ROI's op door op meer te klikken en vervolgens op te slaan.

Selecteer het bodipy-kanaal en open de drempeltool door te klikken op de tabbladen afbeelding, aanpassen en drempel in het hoofdvenster van Fiji. Stel in het pop-upvenster van de drempel de waarden in op 70 en 255. Selecteer vervolgens YEN en zwart-wit methode.

Voordat u op donkere achtergrond klikt. Klik ten slotte op het tabblad Toepassen. Ga naar het hoofdvenster van Fiji en klik op analyseren en metingen instellen.

Selecteer in het pop-upvenster gebied, gebiedsfractie en limiet tot drempel. Laat de resterende vakken en parameters als standaard staan. Ga naar het ROI-venster en selecteer de eerste ROI.

Klik in het hoofdvenster van Fiji op analyseren en vervolgens op het gereedschap Deeltjes analyseren. Stel in het venster geanalyseerde deeltjes de waarden in van twee tot oneindig en vink het vakje pixels aan. Behoud de standaard circulariteitswaarde en selecteer samenvatten voordat u op OK klikt.

Om de waarden van het centrum en de periferie van de vezel te verkrijgen, herhaalt u de selectie van de tweede en de derde ROI elke keer. Sla vervolgens de resultaten op door op bestand te klikken en sla vervolgens op zoals in het overzichtsvenster. Vermeld het type vezel op de naam van het bestand.

Dit immunohistochemische protocol maakt de herkenning van muizen mogelijk, langzame oxidatieve vezels, zoals type 1 en 2A, snelle glycolytische vezels, zoals type 2X en 2B, en de aanwezigheid van hybride vezels. Door het meten van het gebied en minimaal voor verhoogde diameter van de spiervezel werd een grootteafhankelijke reductie toegepast om de centrale en perifere gebieden van elke vezel te verkrijgen. Opmerkelijke structuren van elk spiergedeelte, zoals axontakjes of spierspillen, zijn goede oriëntatiepunten die kunnen helpen bij het lokaliseren van dezelfde vezels aan beide zijden.

De beschreven instellingen voor het verkrijgen van bodipy lamininekleuring door confocale microscopie. Toegestaan, de visualisatie en analyse van de grootte, het aantal en de verdeling van lipidedruppels van drie tot zes vezels tegelijkertijd. De methode maakte ook de kwantificering van drie belangrijke parameters mogelijk, namelijk het percentage van het vezelgebied dat wordt ingenomen door de lipidedruppels, de dichtheid en de gemiddelde grootte van lipidedruppels.

Onjuiste bevriezingsprocedure en het niet bereiken van de juiste temperatuur van isopentaan resulteerde in een ijskristalvorming in de spiervezels. Wanneer secties niet transversaal waren uitgelijnd, kon de lipidedruppelkwantificering en vergelijking tussen vezels, spieren of dieren niet worden uitgevoerd. De verwerking van de tweede dia moet gelijktijdig met de eerste gebeuren.

Het aan de lucht drogen van de glijbaan na cryosectie gedurende 15 minuten zal de grootte en het aantal lipidedruppels aanzienlijk verminderen. Bodipy kan worden gebruikt om de interactie van lipidedruppels met andere subcellulaire organellen te bestuderen, of eiwitstapel met fluorescentie van een ander spectrum, of met genetisch gemodificeerde GFP-modellen. Myosteatose is gemeld als een slechte prognostische factor voor verschillende ziekten.

Daarom kan deze techniek worden gebruikt om de progressie van een ziekte te volgen of om het effect van een behandeling te evalueren.