Detectie en kwantificering van labelvasthoudende cellen in muizensnijtanden met behulp van een 3D-reconstructiebenadering na weefselverwijdering

Dit protocol beschrijft een methode voor in vivo en driedimensionale visualisatie en kwantificering van de label-retaining cellen van muizen snijtand stamcel niche. Deze techniek is tijdbesparend en gebruiksvriendelijk voor nieuwe leerlingen. De 3D-beelden worden verkregen zonder het weefsel te beschadigen.

De 3D-kwantificering maakt de gegevens betrouwbaarder en nauwkeuriger. Om te beginnen, ontleed de kaken. Bevestig de monsters in 4% paraformaldehyde en bewaar ze een nacht op kamertemperatuur.

Verwijder na de incubatie de spieren uit de kaken. Dompel ze onder in 0,5-molaire ethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing om gedurende vier dagen te ontkalken met een dagelijkse mediumwissel op een 37-graden Celsius shaker. Ontkleur de kaken in 15 milliliter 25% Quadrol-oplossing op een 37-graden Celsius shaker gedurende één dag om het resterende bloedheem te verwijderen.

Voor hele mount 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine kleuring, bereid een verse 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine etiketteringscocktail zoals vermeld in de tekst. Spoel de kaken met een met fosfaat gebufferde zoutoplossing met Tween 20 of PBST gedurende 30 minuten op een 37 graden Celsius shaker. Spoel de kaken driemaal drie minuten met fosfaat-gebufferde zoutoplossing gedurende drie minuten, gevolgd door incubatie in een vers bereide 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine etiketteringscocktail op een shaker 's nachts.

Herhaal de fosfaat-gebufferde zoutoplossing drie keer en voer seriële delipidatie uit door de kaken gedurende zes uur in de in de tekst genoemde oplossingen in een 37-graden Celsius shaker te plaatsen. Droog de kaken uit in tert-butanol-polyethyleenglycol, of tB-PEG, oplossing gedurende twee dagen bij 37 graden Celsius met de dagelijkse mediumverandering. Verwijder na twee dagen de onderkaak in benzylbenzoaat-polyethyleenglycolreinigingsmedium dat 75% benzylbenzoaat, 22% polyethyleenglycol-methylethermethacrylaat gemiddeld 500 of PEG-MMA500 en 3% Quadrol bevat om refractieindexmatching te verkrijgen en totdat transparantie is bereikt.

Monteer de met weefsel gezuiverde hele onderkaak op merkholteglaasjes in het benzylbenzroom-polyethyleenglycolreinigingsmedium en bedek het met glazen afdekplaten. Stel in de confocale beeldvormingssoftware de gewenste beeldacquisitieparameters in. Activeer in het paneel voor fluorescerende excitatie de laser die nodig is om fluoroforen optimaal te exciteren.

Verplaats in het paneel voor fluorescerende detectie de schuifregelaar om de golflengten te selecteren die moeten worden gemeten. Voeg een druppel dompelolie met een brekingsindex van 1,52 toe aan de bovenkant van de dekplaat om overeen te komen met de brekingsindex van de glazen dekplaat en het objectief, en plaats de gemonteerde onderkaak op het microscooppodium. Schakel de fluorescentielampen in en kies een geschikt vergrotingsobjectief om interessante gebieden in beeld te brengen.

Identificeer in de live scanmodus het gezichtsveld om het hele gebied van de onderkaak in de X- en Y-dimensies te visualiseren. Stel de bovenste en onderste Z-stadiumacquisitieparameters in die nauwkeurig het volume van de stamcelnis in de muizensnijtand dekken. Gebruik een Z-stapgrootte van twee micrometer of volgens uw vereiste.

Verkrijg en bewaar Z-stack afbeeldingsbestanden in lif-indeling. Gebruik een bestandsconversieprogramma voor beeldsoftware om het Z-stack-afbeeldingsbestand naar het oorspronkelijke bestandstype te converteren. Klik in de beeldbewerkingssoftware op de knop Arena en kies vervolgens Afbeelding.

Selecteer het oorspronkelijke lif-bestand en kies het samengevoegde bestand. De beelden worden geïmporteerd in de imaging software. Dubbelklik op het geïmporteerde bestand om de afbeeldingsgegevensset te openen.

Ga in de beeldbewerkingssoftware naar het deelvenster Beeldschermaanpassing. Klik in het deelvenster Weergaveaanpassing op de naam van het kanaal. Het wordt meestal gelabeld als rood in de standaardmodus.

Klik in het venster Afbeeldingseigenschappen op het tabblad Toegewezen kleur. Kies in de optie Color Tab File de optie Fire Flow en klik vervolgens op OK. Selecteer de weergavekleur om de achtergrondfluorescentie en de positieve fluorescentie van het monster te onderscheiden. Klik linksboven in het scherm in het deelvenster Scène-eigenschappen op het blauwe pictogram met het label Nieuwe surface toevoegen.

Schakel het pictogram Volume uit om het grootste deel van de achtergrondfluorescentie te verwijderen, waardoor de positieve fluorescentie duidelijk zichtbaar is tijdens handmatige segmentatie. Start vervolgens de handmatige segmentatie van de interesseregio of ROI door op het tabblad Maken te klikken en het tabblad Automatisch maken overslaan, handmatig bewerken te selecteren. Klik in de wizard voor het handmatig maken van oppervlakken op het tabblad Contour om de oriëntatie te kiezen op basis van de voorbeelden om de ROI eenvoudig te contouren.

Zorg er vervolgens voor dat het aanwijzermenu in de rechterhoek zich in de modus Selecteren bevindt. Pas de segmentpositie aan om de ROI in het weefsel te lokaliseren. Zoals eerder vermeld, is de meeste achtergrondfluorescentie al verwijderd.

Klik op de knop Tekenen en teken een voorlopig interessegebied. Selecteer de optie Zichtbaarheid op Geen om interferentie van andere gebieden dan ROI te voorkomen, gevolgd door het segmenteren van het interessegebied segment voor segment. Nadat de ROI-tekening is voltooid, klikt u op Surface maken om een 3D-geometrie van de ROI te krijgen.

Klik op de knop Bewerken in de wizard voor het handmatig maken van oppervlakken en selecteer Alles maskeren. Selecteer in het uitgeklapte venster Maskerkanaal de optie Kanaal 1 in de opties voor Kanaalselectie. Selecteer daarna Kanaal dupliceren voordat u het masker toepast.

Selecteer in de maskerinstellingen Constant binnen/buiten en stel het voxelbuitenoppervlak in op nul. Hef in het deelvenster Scène-eigenschappen de selectie van het Surface-object op en selecteer het volumeobject. Hef in de weergaveaanpassing de selectie van het oorspronkelijke rode kanaal op en selecteer het kanaal Gemaskeerd rood.

En pas de kleurintensiteiten aan om de gewenste 3D-gerenderde en positief gelabelde fluorescentie-ROI te krijgen. Maak een nieuw steunobject door op het pictogram Spots te klikken om de 3D-gerenderde labelbehoudende cellen te kwantificeren door 3D-vlekken te maken die vergelijkbaar overlappen met 3D-gerenderde labelbehoudende cellen. Gebruik de onderste pijlen om te schakelen tussen stappen in de wizard voor het maken van spots.

Klik op de knop Voltooien en selecteer de knop Statistiek. Selecteer vervolgens het tabblad Algemeen om de waarde voor het totale aantal plekken in de afbeelding te vinden. Na 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine labeling en het polyethyleenglycol-geassocieerde oplosmiddelsysteem weefselopruimingsproces, werd de transparante onderkaak verkregen.

Het gemodificeerde monster werd vergeleken met een normale onderkaak zonder een weefselzuiveringsproces en een transparante onderkaak met 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine-labeling werd onderworpen aan confocale beeldvorming. Het optische gedeelte van de snijtand toonde labelhoudende cellen in de stamcelnis van de snijtandtop in het XY-vlak. De 3D-beeldconstructie van een snijtandtop toonde 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine positieve label-behoudende rustcellen in zowel de epitheliale als mesenchymale stamcelniche.

De 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine positieve cellen werden overgebracht naar plekken voor kwantificering die vergelijkbaar overlapten met de mesenchymale label-retaining cellen. De vlekken die alleen zijn gemaakt voor mesenchymale labelhoudende cellen en alleen voor epitheliale labelhoudende cellen zijn zichtbaar in de afbeelding. Kwantificering van epitheliale en mesenchymale labelhoudende cellen werd ook uitgevoerd.

Eigenschappen voor verwerking en clearing zijn de belangrijkste stappen en moeten worden geoptimaliseerd op basis van het gebruik van het weefsel om bevredigende resultaten te verkrijgen. Deze methode kan ook worden aangepast om LRC's op S2VGFP-niveau te visualiseren en in cellijntracering om details te verkrijgen over de locatie van het nageslacht en hun kwantificering of bijdragen.