Thermochemische studies van Ni (II) en Zn (II) Ternaire complexen met behulp van ionenmobiliteit-massaspectrometrie

Deze nieuwe techniek combineert ionenmobiliteit-massaspectrometrie met moleculaire modellering en reactiedynamicatheorie om de relatieve thermochemie van twee concurrerende dissociatiereacties van een ternair complex te bepalen. De combinatie van deze technieken karakteriseert de reactieroutes van reactanten en producten, conformatiestructuren en de affiniteit van het ligand om een ternair complex met het metaalion te vormen. Dit onderzoek modelleert de reactiviteit van twee potentiële peptidetags voor recombinante eiwitzuivering, waarbij de tag reageert met het metaal gecheleerd door nitrilotriacetinezuur in een geïmmobiliseerde metaalaffiniteitskolom.

Begin met het laden van het monster van 2 milliliter in een stompe neusspuit van 2,5 milliliter en injecteer het monster in de elektrospray van het instrument met behulp van de spuitpomp van het instrument met een stroomsnelheid van 10 microliter per minuut. Plaats het instrument in negatieve ionenmobiliteit-massaspectrometrie of IM-MS-modus. Identificeer het massa-tot-lading isotooppatroon van het negatief geladen alternatieve metaalbindende ternaire complex, of amb-metaal-NTA-complex, door het massaspectrometrieprogramma te openen en Spectrum te selecteren.

Selecteer vervolgens Gereedschappen gevolgd door Isotope Model. Maak in het pop-upvenster een lijst met de molecuulformule van het complex, vink het vakje aan voor Toon geladen ion, voer 1 in voor de lading van negatieve en klik op OK.In het weergegeven isotooppatroon van het complex, noteer de laagste massapiek. Selecteer in de instrumentsoftware Setup gevolgd door Quad Profile.

Selecteer vervolgens Handmatig vast en voer de massa van de laagste isotopische patroonpiek in. Klik op Bijwerken en sluit het venster. Selecteer opnieuw Setup en klik vervolgens op Quad oplossen.

Verzamel de negatieve ion IM-MS spectra te beginnen met de eerste overdracht botsing energie met behulp van een 5-minuten looptijd en 2-seconden scantijd. Herhaal dit om de IM-MS-spectra voor elk van de andere botsingsenergieën te verzamelen. Gebruik de geïntegreerde aankomsttijdverdelingen, of ATD-gebieden, voor het ternaire amb-metaal-NTA-complex en twee producten, NTA-metaalcomplex en amb-metaalcomplex, om te normaliseren tot een relatieve procentuele schaal.

Zoek uit de replicaatdrempelbotsing-geïnduceerde dissociatie, of TCID-metingen, de gemiddelde en standaardafwijkingen van elk gegevenspunt. Zet vervolgens de botsingsenergie van de lab-frame-overdracht om in de botsingsenergie van het midden van de massa. Om botsingsdoorsneden te meten, verzamelt u gedurende 10 minuten de negatieve ionEN-IM-MS-spectra van het 10 ppm poly-DL-alanine- of PA-monster met behulp van de instrumentele bedrijfsomstandigheden.

Verzamel vervolgens de IM-MS-spectra van elk ternair complex gedurende 5 minuten. Pak de ATD van elk van de PA- en ternaire complexen uit en exporteer hun bestanden naar de massaspectrometriesoftware met behulp van de optie Drifttijd behouden. Zoek de gemiddelde aankomsttijden uit de maxima van de overeenkomstige ATD-curven.

Gebruik een transversale kalibratiemethode om de gemiddelde aankomsttijden om te zetten in botsingdoorsneden van het ternaire complex. Open in het hoofdmenu van CRUNCH het GB5-tekstbestand met de energie van het massamiddelpunt of ECM-afhankelijke relatieve intensiteiten van de producten. Antwoord Nee om parameters te lezen.

Selecteer vervolgens Modellering gevolgd door Alle parameters instellen. Kies in de opties van het reactiemodel de standaard threshold CID-optie gevolgd door RRKM met integratie over de energieoverdrachtsverdeling van het ternaire complex. Voer 2 in voor onafhankelijke productkanalen die zijn gemodelleerd en selecteer Doorsneden berekenen.

Kies voor het type onconvoluted model 0 Kelvin-doorsnede, inclusief de statistische RRKM-correctie van de kinetische verschuivingen als gevolg van het tijdvenster van 50 microseconden van de botsingscel naar de vluchtdetector. Kies voor de convolutie-opties de dubbele integraal van Tiernan, die de convolutie omvat over translationele energieverdelingen tussen het ternaire complexe ion en het argonbotsingsgas. Kies voor de numerieke integratiemethode Gaussiaanse kwadratuur met vooraf opgeslagen doorsneden.

Uit de opties voor het invoeren van de moleculaire parameters, voert u G in om het structurele modelleringsbestand met de PM6-trillings- en rotatiefrequenties van het ternaire complex te lezen. Antwoord Ja op de vraag:Is een van de reactanten atomair? Schrijf de locatie en naam van het modelleringsbestand.

Voer 1 in voor de lading op ion en 1,664 voor de polariseerbaarheid van het argongas. De massa van ion en massa van het doel zijn respectievelijk voor het ternaire complex en argon en worden automatisch gelezen uit het GB5-tekstbestand. Voer 0 in voor harmonische trillingen.

Druk op Enter om de 1D- en 2D-rotatieconstanten uit het structurele modelleringsbestand te lezen. Selecteer standaardwaarden van 0 voor de gehinderde rotorbehandelingen en 1 voor molecuulsymmetrie. Kies de standaard 300 Kelvin voor de reactanttemperatuur.

Selecteer Integratie voor de methode voor het verminderen van de dichtheid van de array states. Selecteer Ja om de energieverdeling af te breken. Voer 40000 golfnummer in voor maximale energie voor distributie, 2 golfnummer voor bakgrootte en 32 voor aantal punten in energiedistributie.

Kies voor parameters voor het TCID/RRKM-model Ja voor Wijzigen, voer 0 in voor Vaste tijd en 0,000050 seconden voor de bovengrens van het detectievenster. Selecteer voor productkanaal 1 1 voor een enkele overgangsstatus van de opties voor het dissociatiekanaal en 0 voor geen van de sequentiële dissociatie. Kies voor het type overgangsstatus 1 voor een baan om de aarde.

Selecteer G om de modelleringsprogrammabestanden te lezen die de PM6-rotatie- en trillingsparameters voor het amb-metaalcomplex plus NTA-producten bevatten. Voer Nee voor:Is een van de overgangstoestand van de faseruimtelimiet, of PSL TS, atomair? Voer de locatie en naam van het amb-metal complex bestand in.

Gebruik 1,062 voor schaalfrequenties, druk op Enter voor het aantal atomen en voer Nee in voor: Is het molecuul lineair? Herhaal hetzelfde voor het modelleringsbestand dat de trillings- en rotatiefrequenties van het NTA-product bevat. Voer de beschrijving van de omloop van de TS in een baan om de aarde in. Voer 1.0 in voor lading van amb-metaalion en voer vervolgens de polariseerbaarheid en het dipoolmoment van NTA in.

Selecteer 0 Kelvin voor rotatietemperatuur en locked-dipool voor de behandeling van de baanovergangstoestand. Voer de gemiddelde massa's van het amb-metaalion en NTA in. Druk op Enter om de 1D- en 2D-rotatieconstanten uit de modelleringsbestanden te lezen.

Selecteer 0 voor gehinderde rotoren, 1 voor molecuulsymmetrie en 1 voor reactiedegeneratie. Voer de optie Geen wijzigingen in. Selecteer voor productkanaal 2 1 voor enkele overgangsstatus, 0 voor geen voor de sequentiële dissociatie en 1 voor baan voor het overgangsstatustype.

Selecteer G om modelleringsbestanden in te lezen die de PM6-rotatie- en trillingsparameters voor het NTA-metaalcomplex en amb-producten bevatten. Voer vervolgens de beschrijving van de omcirkelende TS in. Voer 1.0 in voor lading van NTA-metaalcomplex ion en voer de polariseerbaarheid en het dipoolmoment van de amb in. Selecteer 0 Kelvin voor de rotatietemperatuur en locked-dipool voor de behandeling van de overgangstoestand in een baan om de aarde.

Voer de gemiddelde massa's van het NTA-metaalcomplex en amb-producten in. Druk op Enter om de 1D- en 2D-rotatieconstanten uit de modelleringsbestanden te lezen. Selecteer 0 voor gehinderde rotoren, 1 voor molecuulsymmetrie en 1 voor reactiedegeneratie.

Voer vervolgens Geen wijzigingen in. Als u inactieve 2D-rotaties wilt verwerken, selecteert u de standaardopties voor statistische impulsmomentverdeling en integreert u P-E, G over J-verdeling. Gebruik de standaardwaarde 32 in het aantal punten in de integratie.

Selecteer in het menu Model de optie Parameters optimaliseren om gegevens te passen en voer respectievelijk de minimale energie en maximale energie in om de gegevensaanpassing te beginnen en te beëindigen. Selecteer 1 voor de experimentele standaardafwijkingen van de wegingsmodellen. Selecteer op basis van de gegevens een minimaal aanvaardbare standaarddeviatie van doorgaans 0,01 tot 0,001.

Gebruik de standaardwaarde voor de E0-convergentiegrens en selecteer Nee om een parameter op de huidige waarde te houden, 0,5 en 2,0 elektronvolt voor de onder- en bovengrens en 2 voor de afgeleide evaluatiemethode. Selecteer in het menu Optimalisatie de optie Optimalisatie starten. Het CRUNCH-programma optimaliseert het geselecteerde TCID-model voor de experimentele gegevens.

Selecteer ten slotte in het menu Model delta-H en S bij T voor de thermochemische evaluatie van de twee dissociatiekanalen. De representatieve afbeelding toont de primaire structuren van alternatieve metaalbindende A- en H-peptiden. De kleur benadrukt de potentiële metalen bindingsplaatsen.

De energieafhankelijkheid voor het vormen van de amb-metaal en NTA-metaal productionen wordt hier weergegeven. De botsingsenergie van het massamiddelpunt, waarbij er 50% dissociatie is van het amb-metaal-NTA ternaire complex, is opgenomen in de grafieken. De representatieve beelden tonen het dynamiekmodel voor de energie-opgeloste TCID-methode.

De botsingen tussen het ambH-zink-NTA-complex plus argon resulteren in de dissociatie naar het ambH-zinkcomplex en vrije NTA, of NTA-zinkcomplex en vrije ambH-producten. De drempelenergieën E1 en E2 komen overeen met de 0 Kelvin-enthalpies van dissociatie voor de reacties ambH-zink-NTA-complex tot ambH-zinkcomplex en vrij NTA, of ambH-zink-NTA-complex tot NTA-zinkcomplex en vrije ambH, respectievelijk. De pm6 geometrie-geoptimaliseerde ternaire amb-metaal-NTA complexen van A en H worden hier getoond.

Deze conformers werden gebruikt in de TCID-modellering van de experimentele gegevens en werden geselecteerd uit andere kandidaat-structuren door hun PM6 elektronische energieën te vergelijken met hoe hun berekende botsingsdoorsneden in vergelijking met de IM-MS botsingsdoorsneden maten. De energie-opgeloste TCID van de vier amb-metaal-NTA-complexen is afgebeeld in deze afbeeldingen. Voor soorten A en H worden hier de productionen van amb-metaal en NTA-metaal met de ingewikkelde CRUNCH-drempelfittingen weergegeven.

De energiewaarden zijn de enthalpies van dissociatie bij 0 Kelvin voor de reacties amb-metaal-NTA op amb-metaal en vrije NTA, of amb-metaL-NTA op NTA-metaal en vrije amb. Een vergelijking van de Gibbs vrije energieën van associatie in kilojoule per mol en vormingsconstanten afgeleid van de enthalpies van dissociatie, netto nul Kelvin, met statische mechanica berekeningen met behulp van de PM6-parameters worden hier getoond. De reactie van NTA-nikkel en vrije ambA om het ambA-nikkel-NTA-complex te vormen vertoont de hoogste formatieconstante en vertegenwoordigt de reactie waarbij het ambA-gelabelde eiwit wordt geïmmobiliseerd door het NTA-nikkel in de affiniteitskolom.

CRUNCH-fitting vereist een zorgvuldige screening van reactanten en producten om nauwkeurige drempelenergieën te verkrijgen. Expertise in moleculaire modellering om de structuren en betrouwbare moleculaire parameters te verkrijgen is vereist. De hier beschreven algemene methoden kunnen worden ontwikkeld voor het screenen van de effectiviteit van moleculen die zijn ontworpen om metaalcofactoren en actieve plaatsen van eiwitten te binden om de enzymatische functies te blokkeren.