Name: Ex Vivo Afgifte van calcitonine-gengerelateerd peptide uit het trigeminovasculaire systeem bij knaagdieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer een ex vivo model om CGRP-afgifte uit het trigeminovasculaire systeem van knaagdieren te meten. Deze methode onderzoekt farmacologische effecten op pijnmechanismen en migraine.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door Candys Foundation.

Alle dierverzorgings- en experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de gids van de Europese Gemeenschap voor de verzorging en het gebruik van dieren (2010/63/UE). Mannelijke C57BL/6JBomTac-muizen, 10 weken oud, en mannelijke Sprague Dawley-ratten, 10 weken oud, werden gebruikt om dit protocol te demonstreren.
1. Bereiding van de synthetische interstitiële vloeistof
<ol><li>Bereid synthetische interstitiële vloeistof (SIF) volgens het volgende recept: 108 mM NaCl, 3,48 mM KCl, 3,50 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 11,70 mM NaH2PO4, 1,50 mM CaCl2, 9,60 mM Na-gluconaat, 5,50 mM glucose en 7,60 mM sucrose (zie Materiaaltabel). OPMERKING: SIF kan worden gevarieerd afhankelijk van het stimulatiedoel, bijvoorbeeld een calciumvrije oplossing kan worden gebruikt bij het bestuderen van calciumkanalen.</li>
	<li>Stel de pH in op 7,4 en stabiliseer de pH door carbogenvergassing (5% CO2 en 95% O2)46.</li>
</ol>2. Euthanasie
<ol><li>Verdoof volwassen muizen en ratten met een mengsel van 70% CO2 en 30% O2. Onthoofd muizen met een schaar en ratten met een guillotine (zie Materiaaltabel). OPMERKING: Gebruik een soort en leeftijd die past bij het doel van het onderzoek. Zowel mannetjes als vrouwtjes kunnen in dit model worden gebruikt.</li>
	<li>Scheid het hoofd van het lichaam op het C3-C4-niveau van het ruggenmerg. OPMERKING: Euthanasie kan ook worden uitgevoerd met een intraperitoneale injectie van pentobarbital (100-150 mg / kg).</li>
</ol>3. Dissectie
<ol><li>Bereid het rattenweefsel voor volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Verwijder de huid en de spier rond het hoofd en de nek met een schaar (figuur 1A).</li>
		<li>Gebruik een bottentrimmer en een schaar om de onderkaken van het hoofd te scheiden (figuur 1B-C).</li>
		<li>Open het ruggenmerg door een bottrimmer caudally in het dorsale deel van de wervels in te brengen en verwijder het dorsale deel van de wervels om het ruggenmerg en de hersenstam bloot te leggen (figuur 1D).</li>
		<li>Snijd het caudale deel van de schedel door de randen van de occipitale en interpariëtale botten om deze botstructuren te verwijderen die het cerebellum blootleggen (figuur 1E). OPMERKING: Het is belangrijk om de hersenstam en het ruggenmerg niet te beschadigen tijdens het snijden en verwijderen van de wervels.</li>
		<li>Isoleer de TNC (Sp5C) caudally ongeveer 13-16 mm van de bregma aan elke kant door het dorsolaterale deel van de hersenstam met een veerschaar door te knippen. Dompel de linker- en rechterkant TNC onder in SIF (figuur 1E-I). OPMERKING: De beschrijving komt overeen met volwassen ratten.</li>
		<li>Zaag de kop halverwege de spits om de schedel in tweeën te delen met behulp van een zaag (figuur 1J-L).</li>
		<li>Verwijder de hersenen voorzichtig zonder de dura mater aan te raken die met een spatel aan de schedel is bevestigd en snijd de trigeminuszenuw door waar deze de hersenstam binnendringt (figuur 1M-P).</li>
		<li>Om de TG te isoleren, snijdt u deze, inclusief de takken rond de visuele randen. Knip de mandibulaire tak af waar deze in het foramen ovale komt. Snijd de oogheelkundige en maxillaire takken die de schedel binnenkomen, omdat ze niet macroscopisch zijn verdeeld. Verwijder tijdens het ontleden van de TG de dura mater die de TG bedekt (figuur 1Q-T).</li>
		<li>Dompel de schedelhelften en de TG's onder in SIF.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid het muizenweefsel voor volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Verwijder huid en spieren rond het hoofd en de nek met een kleine schaar (figuur 2A-B).</li>
		<li>Open het ruggenmerg door een paar kleine scharen caudaal in het dorsale deel van de wervels in te brengen en verwijder het dorsale deel van de wervels om het ruggenmerg en de hersenstam bloot te leggen (figuur 2C). OPMERKING: Het is belangrijk om het ruggenmerg niet te beschadigen tijdens het snijden en verwijderen van de wervels.</li>
		<li>Snijd de schedel door de randen van de occipitale en interpariëtale botten om deze botstructuren te verwijderen die het cerebellum blootleggen (figuur 2D-F).</li>
		<li>Snijd vervolgens het pariëtale bot halverwege sagittaal en verwijder het bot om het cerebrum bloot te leggen (figuur 2G-I).</li>
		<li>Verwijder het cerebellum voorzichtig met een spatel om de hersenstam bloot te leggen (figuur 2J).</li>
		<li>Isoleer het TNC-bevattende deel van de hersenstam met een veerschaar (figuur 2K-N). Dompel de hersenstam met TNC onder in SIF (figuur 2O).</li>
		<li>Verwijder de hersenen en snijd de nervus trigeminus af waar deze de hersenstam binnendringt (figuur 2P-Q).</li>
		<li>Om de TG te isoleren, snijdt u deze, inclusief de takken rond de visuele randen. Knip de mandibulaire tak af waar deze in het foramen ovale komt. Snijd de oogheelkundige en maxillaire takken die de schedel binnenkomen, omdat ze niet macroscopisch zijn verdeeld. Verwijder tijdens het ontleden van de TG de dura mater die de TG bedekt (figuur 2R-S).</li>
		<li>Dompel DE TG's onder in SIF (figuur 2T).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Wassen
<ol><li>Was schedelhelften, TNC's en TG's in SIF gedurende 30 minuten terwijl u de SIF elke 5 minuten bij kamertemperatuur vervangt. OPMERKING: De wasstappen kunnen worden uitgevoerd terwijl het weefsel in plastic containers met een tule deksel wordt bewaard om eenvoudige SIF-uitwisseling mogelijk te maken (figuur 3A-B).</li>
	<li>Bereid het rattenweefsel voor volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Breng TNC-helften over naar afzonderlijke buisdoppen van microcentrifuges met 350 μL SIF (figuur 3C).</li>
		<li>Breng de TG's over naar buisdoppen van microcentrifuges - één TG per buisdop van de microcentrifuge met 350 μL SIF (figuur 3C).</li>
		<li>Plaats de schedelhelften op platforms gemaakt van klei of een 6-well kweekplaat en vul de schedel met 400 μL SIF (figuur 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid het muizenweefsel voor volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Breng de hersenstam met TNC over naar een microcentrifuge buisdop met 250 μL SIF (figuur 3D).</li>
		<li>Breng de twee TG's over naar een buisdop van een microcentrifuge met 250 μL SIF (figuur 3D). OPMERKING: Plaats twee TG's per buisdop van de microcentrifuge bij gebruik van weefsel van muizen.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats rattenschedels en microcentrifuge buisdoppen met ratten- en muizenweefsel in een bevochtigde incubator bij 37 °C. Vervang SIF met een pipet om de 5 minuten gedurende 20 minuten. OPMERKING: Het is belangrijk om het weefsel niet aan te raken bij het toevoegen en verwijderen van SIF.</li>
</ol>5. Drugstesten
<ol><li>Bepaal de basale CGRP-afgifteniveaus.<ol><li>Voeg na de laatste wasbeurt 250 μL SIF toe aan muis-TG en TNC. Voeg 350 μL toe aan rat TG en TNC en 400 μL aan elke rattenschedel.</li>
		<li>Verzamel na 10 minuten incubatie 200 μL van het monster in een microcentrifugebuis en voeg 50 μL 10x EIA-buffer toe (geleverd met de CGRP-enzymimmunoassaykit, zie Materiaaltabel) om meting van de basale CGRP-afgifte mogelijk te maken (stap 6). Gooi de resterende vloeistof weg. OPMERKING: De incubatietijd moet voor alle monsters hetzelfde zijn.</li>
		<li>Bewaar de monsters onmiddellijk bij -20 °C.</li>
		<li>Na bemonstering van basale CGRP-afgifteniveaus volgt u een van de drie methoden: (A) Enkelvoudige stimulatie (stap 5.2); (B) Concentratie-responsstimulatie (stap 5.3); en (C) Remming van stimulatie (stap 5.4) (figuur 4). OPMERKING: De gebruikte teststof en concentraties zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer een enkele stimulatie uit volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Voeg het testmiddel of medium toe aan het weefsel en laat het 10 minuten staan (volume: 250 μL voor muis TG en TNC, 350 μL voor ratten TG en TNC en 400 μL voor elke rattenschedel).</li>
		<li>Verzamel na 10 minuten incubatie 200 μL van het monster in een microcentrifugebuis met 50 μL 10x EIA-buffer. Gooi de resterende vloeistof weg en bewaar de monsters onmiddellijk bij -20 °C. OPMERKING: De incubatietijd moet voor alle monsters hetzelfde zijn.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer concentratie-responsstimulatie uit volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Verdun het testmiddel of medium tot de gewenste concentraties. Voeg de teststof toe in toenemende concentraties, te beginnen met de laagste concentratie. OPMERKING: De gebruikte teststof en concentraties zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek. Voor deze studie werden bijvoorbeeld 1 μM, 10 μM en 100 μM supercinnamaldehyde gebruikt.</li>
		<li>Voeg de laagste concentratie (1 μM voor dit onderzoek) van het testmiddel en het overeenkomstige medium toe aan twee identieke weefselpreparaten en incubeer gedurende 10 minuten (volume: 250 μL voor muizenweefsel, 350 μL voor rat TG en TNC en 400 μL voor elke rattenschedel).</li>
		<li>Verzamel na 10 minuten incubatie 200 μL van het monster in een microcentrifugebuis met 50 μL 10x EIA-buffer.</li>
		<li>Gooi de resterende vloeistof weg en voeg de op een na laagste concentratie (10 μM voor dit onderzoek) toe aan het weefsel.</li>
		<li>Bewaar de monsters onmiddellijk bij -20 °C.</li>
		<li>Herhaal deze procedure met de resterende concentraties (100 μM voor dit onderzoek).</li>
	</ol></li>
	<li>Voer remming van stimulatie uit volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Voeg de blokker of het medium toe aan het weefsel en incubeer gedurende 10 minuten (volume: 250 μL voor muizenweefsel, 350 μL voor ratten TG en TNC en 400 μL voor elke rattenschedel). OPMERKING: De gebruikte blokker en concentratie zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek. Zo werd 3 μM glibenclamide gebruikt voor het representatieve resultaat in figuur 5.</li>
		<li>Verzamel na 10 minuten incubatie een monster van 200 μL in een microcentrifugebuis met 50 μL 10x EIA-buffer. Gooi de resterende vloeistof weg en bewaar de monsters onmiddellijk bij -20 °C.</li>
		<li>Voeg de agonist of agonist + blokker (zie materiaaltabel) toe aan het weefsel en incubeer gedurende 10 minuten. OPMERKING: De gebruikte agonist, blokker en concentraties zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek. In deze studie werd 3 μM glibenclamide en 1 μM capsaïcine gebruikt, figuur 5.</li>
		<li>Verzamel na 10 minuten incubatie een monster van 200 μL in een microcentrifugebuis met 50 μL 10x EIA-buffer. Gooi de resterende vloeistof weg en bewaar de monsters onmiddellijk bij -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer een positieve controle uit voor het experiment.<ol><li>Voeg indien van toepassing een positieve controle (bijv. 1-10 μM capsaïcine, zie materiaaltabel) toe aan het weefsel aan het einde van het protocol en verzamel een monster van 200 μL in een microcentrifugebuis met 50 μL 10x EIA-buffer na een incubatietijd van 10 minuten. OPMERKING: Het is voordelig om een positieve controle op te nemen om ervoor te zorgen dat de opstelling en weefsels functioneren. Capsaïcine 48,49,50 of de depolariserende stimulus van kalium (40-60 mM KCl)46,47,49 worden routinematig gebruikt om de afgifte van CGRP uit het trigeminovasculaire systeem te veroorzaken. 40-60 mM KCl SIF wordt bereid als SIF, behalve dat NaCl op equimolar basis wordt omgewisseld voor KCl.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Analyse van CGRP-concentraties
<ol><li>Meet de hoeveelheid CGRP die vrijkomt met behulp van een enzymimmunoassay (EIA) -kit volgens het protocol van de fabrikant (zie materiaaltabel).</li>
	<li>Meet de optische dichtheid bij 410 nm met behulp van een plaatfotometer. Als een andere CGRP EIA-kit wordt gebruikt, meet u de optische dichtheid op de golflengte die is aangegeven in het protocol van de fabrikant. OPMERKING: Monsters moeten worden verdund om overeen te komen met de standaardcurve.</li>
	<li>Voer gegevensanalyse uit.<ol><li>Presenteer de gegevens als absolute concentraties of normaliseer naar de basale CGRP-afgifte van het specifieke weefsel.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De beschreven methode werd ontwikkeld na studies die het belang van CGRP in de pathofysiologie van migraine aantonen. Het is zeer geschikt voor het onderzoeken van de mechanismen die betrokken zijn bij het vrijkomen van CGRP uit het trigeminovasculaire systeem, wat cruciaal is voor pijnsignalering in het hoofdgebied. De hoeveelheid CGRP die in dit model wordt verkregen, meet rechtstreeks de CGRP-afgifte van de trigeminuszenuwen die dura mater, TG en TNC innerveren. De hoeveelheid CGRP-afgifte is kwantitatief groter45,54 dan de afgifte gemeten in plasma na thermocoagulatie bij mensen, trigeminusstimulatie bij kat 39,55,56 en tijdens migraineaanvallen23. Een verklaring zou kunnen zijn dat CGRP verdund en afgebroken wordt in het bloed54. Er moet echter worden opgemerkt dat directe stimulatie met chemicaliën superieur kan zijn aan pathofysiologische activering. Verdere voordelen zijn dat het mogelijk is om de afgifte van drie verschillende plaatsen in het trigeminovasculaire systeem te lokaliseren en dat het kan worden gebruikt in combinatie met farmacologische manipulatie en in weefsel van genetisch gemodificeerde knaagdieren.
De laatste tijd richten veel preklinische knaagdiermodellen zich op systemische toediening van stoffen en daaropvolgende pijn- of migrainegerelateerde uitlezingen met behulp van von Frey-tests 57,58, grimassen 59,60,61 of lichtaversie 62,63,64. Deze methoden zijn nuttig bij het begrijpen van de pijnverwekkende en pijnstillende eigenschappen van verschillende stoffen. Deze benaderingen geven echter geen informatie over specifieke betrokken doelweefsels. In de huidige methode is het trigeminovasculaire systeem verdeeld in drie structuren: de dura mater, TG en TNC. Dit maakt lokale blootstelling van elke structuur en de beoordeling van de plaats van werking van een specifieke stof mogelijk. Dit werd gebruikt in een studie uit 2011, waar de rol van voltage-gated calciumkanalen bij ratten werd onderzocht, en de remming van deze kanalen bleek anders te zijn in de drie structuren van de trigeminovasculaire route47. Bij het ontleden van structuren van het zenuwstelsel is axotomie onvermijdelijk. Van axotomie is aangetoond dat het de transcriptie van verschillende genen verandert65. Deze transcriptionele veranderingen zijn te traag om de resultaten van deze methode te beïnvloeden, maar veranderingen in fosforylering kunnen niet worden uitgesloten in vergelijking met in vivo situaties46. Hoewel neuropeptiden zoals CGRP worden gevormd in de cel soma, zijn de afgifte en werking van neuropeptiden meestal op de centrale of perifere zenuwterminals. Studies van intacte neuronen, inclusief terminals, zijn dus interessant bij het bestuderen van de afgifte van neuropeptiden. Daarom zijn methoden voor het bestuderen van culturen van neuronen uit geïsoleerde ganglia vastgesteld om te dienen als een model van de terminals. Neuronale celculturen zijn echter onderhevig aan verschillende problemen, omdat mechanische dissociatie neuronen in een cultuur kan vernietigen46. Het langere tijdsbestek dat gepaard gaat met het kweken van cellen laat deze methode gevoelig voor transcriptomische veranderingen als gevolg van axotomie en kweekomstandigheden65. Bovendien hebben de toevoeging van groeifactoren en het kweken op oppervlaktecoatings neuronale eigenschappen als zender- en receptorexpressie veranderd 66,67,68,69. Deze problemen worden vermeden bij het bestuderen van vers geïsoleerde intacte ganglia in plaats van neuronale celculturen.
Een uitdaging bij de ex vivo CGRP-afgiftemethode is de precieze dissectie van het weefsel dat nodig is voor reproduceerbare resultaten. Vooral nauwkeurige dissectie van de TNC is een uitdaging omdat dit een structuur in de hersenstam is zonder zichtbare grenzen. Bovendien is de dura mater kwetsbaar en moet het verwijderen van de hersenen zorgvuldig worden uitgevoerd om een intacte structuur te garanderen. Deze obstakels kunnen resulteren in verschillende weefselgrootte en dus variërende basale en stimulatie-geïnduceerde CGRP-niveaus. Deze variatie kan echter worden verklaard door normalisatie naar de basale CGRP-afgifte. Er moet ook worden opgemerkt dat bij het isoleren van de TNC van muizen het hele onderste deel van de hersenstam wordt geïsoleerd en niet het meer specifieke TNC-bevattende deel zoals bij ratten wordt gedaan. Over het algemeen kan het een voordeel zijn om rattenweefsel te gebruiken, omdat dit het mogelijk maakt om de CGRP-afgifte van dura mater en de nauwkeurigere dissectie van de TNC te meten. Bovendien maakt de grootte van het weefsel ook het gebruik van een rat als voertuigcontrole mogelijk, aangezien één rat resulteert in twee schedelhelften, twee TG's en twee TNC's waarbij een stuk van het weefsel wordt gebruikt voor stofstimulatie en de andere voor het voertuig. Bij het gebruik van muizen zijn twee dieren nodig voor één experiment, omdat beide TG's in één monster worden samengevoegd en de TNC's worden ontleed als één hersenstam. Daarom worden twee TG's en een hersenstam gebruikt voor stofstimulatie en worden twee TG's en een hersenstam van een andere muis gebruikt voor voertuigbesturing. Dit resulteert in het gebruik van twee keer zoveel muizen in vergelijking met ratten om hetzelfde aantal replicaties te verkrijgen. Om het aantal gebruikte muizen te verminderen, is een methode voorgesteld om de CGRP-afgifte uit hersenstamsegmenten te meten49. Het is een voordeel dat de methode is aangepast om het gebruik van muizen mogelijk te maken. Dit maakt het gebruik van veel reeds beschikbare transgene muizenstammen mogelijk, een handig hulpmiddel voor het bestuderen van bijvoorbeeld signaalroutes. Een positieve controle aan het einde van een experiment moet worden opgenomen om ervoor te zorgen dat het weefsel dat in het experiment wordt gebruikt CGRP kan vrijgeven. De positieve controle zou TRPV1-agonist capsaïcine of de depolariserende stimuluskalium (KCl) kunnen zijn, waarvan is gebleken dat CGRP vrijkomt uit het trigeminovasculaire systeem bij zowel muizen als ratten 46,47,48,49,50. Bovendien is de methode ook aangepast om de afgifte van andere relevante peptiden te meten als hypofyse-adenylaatcyclase-activerend peptide (PACAP) - een ander peptide van groot belang binnen migraineonderzoek70.
De methode biedt een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van CGRP-afgifte van specifieke doelweefsels bij ratten en muizen. Het is een relatief snelle methode die problemen in verband met het kweken van neuronen voorkomt. Het methodeprotocol kan eenvoudig worden aangepast om de concentratie-responsrelatie of remming van een respons door verschillende farmacologische verbindingen te bestuderen. De ex vivo CGRP-afgiftemethode is een van de verschillende preklinische methoden die nuttig zijn voor het bestuderen van de rol van CGRP en andere mechanismen die verband houden met CGRP-afgifte in migrainepathofysiologie.

Migraine is een neurologische aandoening die volgens de WHO naar schatting meer dan 1 miljard mensen treft en wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van invaliditeit is1. Migraine heeft dus een aanzienlijke impact op zowel patiënten als de samenleving. Ondanks het recente klinische succes van CGRP-antagoniserende geneesmiddelen, heeft een groot deel van de patiënten verbeterde behandelingsopties nodig 2,3,4,5. Opheldering van migraine pathofysiologie die leidt tot nieuwe effectieve behandelingen is vereist. Signalering binnen het trigeminovasculaire systeem bestaande uit de hersenvliezen, trigemminale ganglia (TG) en trigemminale nucleus caudalis (TNC) is centraal voor migraine pathofysiologie 6,7.
Het 37 aminozuur neuropeptide calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) werd voor het eerst ontdekt in de vroege jaren 1980 toen Amara en collega's aantoonden dat het primaire RNA-transcript van het calcitonine-gen kon worden verwerkt om mRNA-codering voor CGRP te geven naast calcitonine 8,9. Het daaropvolgende onderzoek suggereerde een verband met migraine pathofysiologie10. CGRP is een neurotransmitter met krachtige vaatverwijdende eigenschappen 11,12,13,14,15,16,1 7, en het is wijd verspreid in het centrale en perifere zenuwstelsel 13,14,18,19,20,21,22 . De betrokkenheid van CGRP bij migraine werd onderstreept met de ontdekking van verhoogde CGRP-niveaus in de extracerebrale circulatie tijdens migraineaanvallen bij mensen23, en dat infusie van CGRP migraine-achtige pijn veroorzaakt bij patiënten24. Twee jaar later werd de eerste proof-of-concept studie van de effectiviteit van de CGRP-antagonist olcegepant bij de behandeling van migraine gepubliceerd25.
CGRP is overvloedig aanwezig in het trigeminovasculaire systeem zoals aangetoond in de TG21,26, sensorische zenuwvezels die de dura mater 27,28,29 en TNC30 innerveren. In het trigeminovasculaire systeem wordt CGRP gevonden in de kleine tot middelgrote neuronen van de TG, in niet-gemyeliniseerde C-vezels, en wordt uitgedrukt in bijna 50% van de neuronale populatie van de TG. De CGRP-receptor komt voornamelijk tot expressie in grotere neuronen en wordt aangetroffen in gemyeliniseerde Aδ-vezels 31,32. CGRP komt vrij uit neuronen bij chemische of elektrische stimulatie33,34. Studies van pathways die leiden tot de afgifte van CGRP en de locatie van deze activering zijn cruciaal om migraine pathofysiologie te begrijpen. In de afgelopen 5 decennia hebben preklinische studies bijgedragen aan het verkrijgen van uitgebreide kennis over migraine-gerelateerde signalering en hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van nieuwe behandelingen35. Veel methoden die rekening houden met de vasculaire en neurogene betrokkenheid zijn aangepast en toegepast in migraineonderzoek. In vivo en in vitro modellen van arteriële reacties op biologische verbindingen of farmacologische behandelingen 17,36,37, en elektrische zenuwstimulatie 38,39 kunnen worden genoemd. Bovendien kunnen geactiveerde neuronen in de TNC worden gedetecteerd door c-Fos-expressie 40,41,42 en elektrofysiologische opnames in dit gebied 43,44. Beide methoden meten nociceptieve signalen die vanuit het hoofd naar de hersenen worden verzonden, bijvoorbeeld dura mater. Het gebruik van slechts één preklinisch model geeft niet het volledige beeld van migraine pathofysiologie. Daarom is het belangrijk om verschillende modellen te combineren die zoveel mogelijk aspecten van migraine pathofysiologie bestrijken. De verdere ontwikkeling van nieuwe modellen zal verschillende aspecten van migrainemechanismen omvatten en op termijn zal het mysterie van migrainepathofysiologie worden blootgelegd.
Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd van de CGRP-afgiftemethode, ex vivo uitgevoerd in geïsoleerde TG en TNC van muizen na chemische stimulatie. CGRP-afgifte kan ook worden bestudeerd in de dura mater van ratten. Zo wordt in het experimentele protocol voor ratten dura mater samen met TG en TNC beschreven. De basis voor de CGRP-releasemethode werd voor het eerst beschreven in 1999, waar Ebersberger en collega's baanbrekend onderzoek deden en ontdekten dat CGRP vrijkwam uit dura mater na chemische en elektrische stimulatie van durarale afferente stoffen bij ratten45. Later werd deze aanpak uitgebreid naar CGRP-release van de TG46 en de TNC47. Vervolgens werd de methode aangepast om toe te passen op TG en TNC bij muizen. Tot nu toe is de CGRP-afgifte van de dura mater een uitdaging geweest bij muizen.

<table><tbody><tr><td>6-well culture plate</td><td>NUNC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Merck</td><td>1.02382.1000</td><td>Voor SIF-buffer</td></tr><tr><td>Caps voor plastic containers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>536617</td><td></td></tr><tr><td>Capsaïcine</td><td>Merck</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>CGRP-kits</td><td>AH Diagnostics</td><td>A05482.96</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Strandm&oslash;llen</td><td>4.6</td><td>Voor carbogen-gassing van SIF</td></tr><tr><td>Delicate Bone Trimmer</td><td>Fine Science Tools</td><td>16109-14</td><td></td></tr><tr><td>Glibenclamide</td><td>Tocris</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>Voor SIF-buffer</td></tr><tr><td>Guillotine voor ratten</td><td>Scandidact</td><td>NS-802</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat heptahydraat</td><td>Merck</td><td>M5921</td><td>Voor SIF-buffer</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes + deksels/doppen</td><td>VWR</td><td>700-5239</td><td></td></tr><tr><td>Mini Haakse zaag</td><td>BAHCO</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>O2</td><td>Strandm&oslash;llen</td><td>4.5</td><td>Voor carbogen-gassing van SIF</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Glostrup apotheek</td><td>NA</td><td>Magistraal recept</td></tr><tr><td>Kunststof containers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>536455</td><td></td></tr><tr><td>Plate fotometer - Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>NA</td><td>Infinite M200 is uit productie. Een Infinite 200 PRO is beschikbaar bij Tecan. Software: SW Magellan v.6.3</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Merck</td><td>P9333</td><td>Voor SIF-buffer</td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Allgaier Instruments</td><td>307-156-170</td><td></td></tr><tr><td>Kleine schaar</td><td>Allgaier Instruments</td><td>04-520-115</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Merck</td><td>S6014</td><td>Voor SIF-buffer</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Merck</td><td>S9888</td><td>Voor SIF-buffer</td></tr><tr><td>Natriumdiwaterstoffosfaat monohydraat</td><td>Merck</td><td>1.06346.1000</td><td>Voor SIF-buffer</td></tr><tr><td>Natriumgluconaat</td><td>Merck</td><td>S2054</td><td>Voor SIF-buffer</td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Bochem Lab Supply</td><td>3018</td><td></td></tr><tr><td>Feder schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck</td><td>84097</td><td>Voor SIF-buffer</td></tr><tr><td>Supercinnamaldehyde</td><td>Merck</td><td>S3322</td><td></td></tr><tr><td>Tulle (stoffen)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Gekocht in de lokale stoffenwinkel</td></tr></tbody></table>

ex vivo | afgifte van calcitonine-gengerelateerd peptide uit het trigeminovasculaire systeem bij knaagdieren

Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents

Calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) werd voor het eerst ontdekt in de jaren 1980 als een splice variant van het calcitonine gen. Sinds de ontdekking is zijn rol in de pathofysiologie van migraine goed ingeburgerd, eerst door zijn krachtige vaatverwijdende eigenschappen en vervolgens door zijn aanwezigheid en functie als neurotransmitter in het sensorische trigeminovasculaire systeem. Het migraine-provocerende vermogen van CGRP gaf ondersteuning aan de farmaceutische industrie om monoklonale antilichamen en antagonisten te ontwikkelen die het effect van CGRP remmen. Een nieuw behandelingsparadigma is effectief gebleken bij de profylactische behandeling van migraine. Een van de nuttige hulpmiddelen om migrainemechanismen verder te begrijpen, is het ex vivo model van CGRP-afgifte uit het trigeminovasculaire systeem. Het is een relatief eenvoudige methode die met verschillende farmacologische hulpmiddelen kan worden gebruikt om kennis te verwerven om nieuwe effectieve migrainebehandelingen verder te ontwikkelen. Het huidige protocol beschrijft een CGRP-afgiftemodel en de techniek om het effect van farmacologische middelen op de hoeveelheid CGRP die vrijkomt uit het trigeminovasculaire systeem bij knaagdieren te kwantificeren. Er wordt een procedure gegeven die de experimentele aanpak beschrijft, van euthanasie tot het meten van eiwitniveaus. De essentiële isolatie van het trigeminus ganglion en de trigeminuskern caudalis van zowel muizen als ratten en de bereiding van rat dura mater worden in detail beschreven. Verder worden representatieve resultaten van beide soorten (ratten en muizen) gepresenteerd. De techniek is een belangrijk hulpmiddel om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij migraine pathofysiologie door gebruik te maken van verschillende farmacologische verbindingen en genetisch gemodificeerde dieren.

Deze techniek is een hulpmiddel om de CGRP-gerelateerde moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij migraine te onderzoeken. Het heeft het voordeel dat het de CGRP-afgifte van verschillende niveaus van het trigeminovasculaire systeem beoordeelt en kan zowel op wildtype als transgene muizen en ratten worden toegepast in combinatie met verschillende farmacologische verbindingen. Hier worden concentratie-respons- en blokkeringsexperimenten van ratten en concentratieresponsresultaten van wildtype en transgene muizen gepresenteerd.
De CGRP-afgiftemethode werd gebruikt om het effect van de KATP-kanaalremmer glibenclamide op de CGRP-afgifte van TG en dura mater bij vrouwelijke spontane trigeminusallodynische (STA) ratten te bestuderen. Ten eerste werd de optimale concentratie capsaïcine gevonden met behulp van een concentratie-respons studieontwerp. Blootstelling aan capsaïcine veroorzaakte een significante CGRP-afgifte van dura mater en TG in vergelijking met het medium (figuur 5). In de dura mater werd de maximale afgifte van CGRP gevonden bij 1 μM capsaïcine en in TG werd de maximale CGRP-afgifte gevonden bij 10 μM capsaïcine (figuur 5A-B). Op basis van de concentratie-responsexperimenten werd 1 μM capsaïcine en 3 μM glibenclamide gebruikt voor het blokkeren van experimenten. Glibenclamide vertoonde geen effect op de basale CGRP-afgifte van dura mater (P = 0,441) en TG (P = 0,881) bij analyse met een eenrichtings-ANOVA51. Glibenclamide verminderde significant de capsaïcine-geïnduceerde CGRP-afgifte in dura mater met 40% (P = 0,031) en TG met 39% (P = 0,003) in vergelijking met capsaïcine met het medium wanneer geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA (figuur 5C-D)51.
Bij muizen werd het protocol gebruikt om de betrokkenheid van het transiënte receptorpotentiaal ankyrine 1 (TRPA1) ionkanaal te onderzoeken in een GTN-muismodel van migraine, waarbij GTN-geïnduceerde overgevoeligheid volledig afhankelijk was van TRPA1-kanalen. De TRPA1-agonist supercinnamaldehyde (SCA) bleek CGRP op een dosisafhankelijke manier vrij te geven aan de TG met 1 μM, 10 μM en 100 μM SCA, wat resulteerde in 9% (P = 0,23), 51% (P = 0,011) en 69% (P = 0,0097) verhoogde afgifte van CGRP in vergelijking met het voertuig, respectievelijk wanneer geanalyseerd met tweeweg ANOVA. Deze afgifte was afwezig in TG van Trpa1 nulmuizen waar blootstelling aan 1 μM, 10 μM en 100 μM SCA resulteerde in 11% (P > 0,99), -13% (P > 0,99) en 9% (P = 0,97) procent verandering in de afgifte van CGRP in vergelijking met het voertuig, respectievelijk wanneer geanalyseerd met tweeweg ANOVA. De daaropvolgende stimulatie met 10 μM capsaïcine (positieve controle) laat zien dat alle weefselmonsters CGRP kunnen afgeven (figuur 6)50.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig01.jpg"> Figuur 1: Stapsgewijze dissectie van weefsel van ratten. De (A-T) details worden verstrekt in de protocolsectie (stap 3.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig02.jpg"> Figuur 2: Stapsgewijze dissectie van weefsel van muizen. De (A-T) details worden verstrekt in de protocolsectie (stap 3.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig03.jpg"> Figuur 3: Wassen en incubatie van knaagdierweefsel. (A-B) Vers geïsoleerd weefsel in plastic containers met SIF. De containers zijn bedekt met tule om SIF eenvoudig te kunnen verwisselen. (C) Rattenweefsel - Twee schedelhelften met dura mater die de binnenvoeringen van de schedel bedekken, geplaatst op een 6-well kweekplaat. De rechter en linker trigeminuskern caudalis in afzonderlijke microcentrifuge buisdeksels (bovenste rij deksels). De twee trigeminus ganglia in individuele microcentrifuge buisdeksels (onderste rij deksels). (D) Muizenweefsel - De trigeminuskern caudalis-bevattend deel van de hersenstam in een apart microcentrifuge buisdeksel (boven). Twee trigeminus ganglia van muizen bevinden zich in één microcentrifuge buisdeksel (onderkant). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig04.jpg"> Figuur 4: Studieontwerpen voor CGRP-release. Drie verschillende protocollen voor het uitvoeren van CGRP-release-experimenten. Geneesmiddelen moeten worden verdund in synthetische interstitiële vloeistof (SIF). (A) Eenmalige stimulatie. (B) Concentratie-respons stimulatie. (C) Remming van een stimulatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig05.jpg"> Figuur 5: Glibenclamide remt capsaïcine-geïnduceerde CGRP-afgifte van rat dura mater en trigeminus ganglion. CGRP-niveaus van trigeminus ganglion en dura mater geïsoleerd van vrouwelijke spontane trigeminus allodynische (STA) ratten (215-318 g) oorspronkelijk afkomstig van de Thomas Jefferson University52 werden gemeten met commerciële menselijke CGRP EIA-kits. (A-B) CGRP-afgifte uit (A) dura mater en (B) trigeminus ganglion na toenemende concentraties capsaïcine (10 nM, 100 nM, 1 μM en 10 μM) (n = 4). Gegevens worden gepresenteerd als individuele punten en werden geanalyseerd met tweerichtings-ANOVA. p < 0,0001 (C-D) niveaus van CGRP vrijgekomen uit (C) dura mater en (D) trigeminus ganglion na 10 minuten blootstelling aan het medium, 3 μM glibenclamide (glib), 1 μM capsaïcine en 1 μM capsaïcine + 3 μM glib (n = 6-11). Gegevens worden gepresenteerd als individuele punten en gemiddelde waarden en werden geanalyseerd met eenrichtings-ANOVA. *vergeleken met voertuig. #capsaïcine vergeleken met capsaïcine + glib. #P < 0,05, ** en ##P < 0,01, ****P < 0,0001. De analyses werden gevolgd met de meervoudige vergelijkingstest van Bonferroni. Voor alle tests werd een significant niveau van α = 0,05 gebruikt. Dit cijfer is overgenomen uit Christensen et al. 51. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig06.jpg"> Figuur 6: SCA-blootstelling resulteert in TRPA1-afhankelijke CGRP-afgifte van trigeminus ganglion bij muizen. CGRP-niveaus die vrijkomen uit trigeminus ganglion geïsoleerd uit WT en Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 mannelijke muizen (8-10 weken) werden gemeten met CGRP EIA-kits van ratten na blootstelling aan supercinnamaldehyde (SCA) bij 1 μM, 10 μM en 100 μM en capsaïcine bij 10 μM als een positieve controle (n = 6). Gegevens van elke muis worden gepresenteerd als afzonderlijke punten en balken geven de gemiddelde waarden aan. Statistieken: Vergelijking tussen SCA en medium bij elke concentratie en tussen basale en positieve controle werd uitgevoerd met een tweerichtings herhaalde ANOVA. Een significant niveau van α = 0,05. *P < 0,05, **P < 0,01. Dit cijfer is overgenomen uit Christensen et al. 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Het huidige protocol beschrijft het ex vivo calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) release model en de strategie om het effect van farmacologische middelen op de hoeveelheid CGRP vrij te maken van het trigeminovasculaire systeem bij knaagdieren te kwantificeren.

Ex Vivo | Afgifte van calcitonine-gengerelateerd peptide uit het trigeminovasculaire systeem bij knaagdieren

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) was first discovered in the 1980s as a splice variant from the calcitonin gene. Since its discovery, its role in ...

Deze methode is een hulpmiddel om mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij het vrijkomen van CGRP uit het trigeminus vasculaire systeem. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de mogelijkheid om het trigeminus vasculaire systeem in drie verschillende plaatsen te verdelen en de afgifte van de CGRP binnen elke afzonderlijke site te beoordelen. De procedure wordt gedemonstreerd door mijzelf en Inger Jansen-Olesen, een senior wetenschapper uit onze groep.Bereid om te beginnen het rattenweefsel voor door de huid en de spier rond het hoofd en de nek met een schaar te verwijderen. Gebruik vervolgens een bottentrimmer en een schaar om de onderkaken van het hoofd te scheiden. Stel nu het ruggenmerg en de hersenstam bloot door een bottrimmer caudaal in het dorsale deel van de wervels in te brengen en te verwijderen.Snijd vervolgens het caudale deel van de schedel door de randen van de occipitale en interpariëtale botten om deze botstructuren te verwijderen, waardoor het cerebellum wordt blootgesteld. Om de TNC caudally ongeveer 13 tot 16 millimeter van de bregma aan elke kant te isoleren, knipt u het dorsolaterale deel van de hersenstam met een veerschaar. Dat wordt gevolgd door het onderdompelen van de linker- en rechterkant TNC in SIF.Snijd vervolgens de kop midsaggitally om de schedel in tweeën te verdelen met behulp van een zaag. Verwijder nu voorzichtig de hersenen zonder de dura mater aan te raken die met een spatel aan de schedel is bevestigd. Om de TG te isoleren, snijdt u deze inclusief de takken rond de visuele randen met de mandibulaire tak die de foramen ovale binnengaat en de oogheelkundige en maxillaire takken die de schedel binnendringen.Dompel vervolgens de schedelhelften en de TG's onder in SIF. Om het muizenweefsel voor te bereiden, verwijdert u de huid en de spier rond het hoofd en de nek met een schaar. Stel nu het ruggenmerg en de hersenstam bloot door een schaar caudaal in het dorsale deel van de wervels in te brengen en te verwijderen.Snijd vervolgens het caudale deel van de schedel door de randen van de occipitale en interpariëtale botten om deze botstructuren te verwijderen die het cerebellum blootstellen. Snijd het pariëtale bot midsaggitaal en verwijder het bot om het cerebrum bloot te leggen. Verwijder voorzichtig het cerebellum om de hersenstam bloot te leggen met behulp van een spatel.Isoleer de TNC die een deel van de hersenstam bevat met een veerschaar, gevolgd door het onderdompelen van de hersenstam in SIF. Verwijder nu voorzichtig de hersenen met behulp van een spatel en snijd de trigeminuszenuw af waar deze de hersenstam binnenkomt. Om de TG te isoleren, snijdt u het inclusief de takken rond de visuele randen met de mandibulaire tak waar het de foramen ovale en oogheelkundige en maxillaire takken binnenkomt die de schedel binnendringen.Dompel vervolgens TG's onder in SIF. Voor eenvoudige uitwisseling van SIF, voeg een toldeksel toe aan de plastic containers en begin met het wassen van het ratten- en muizenweefsel in SIF gedurende 30 minuten door SIF elke vijf minuten te vervangen. Na 30 minuten wassen op kamertemperatuur, breng rat TNC-helften en rat TG's over naar afzonderlijke microcentrifuge buisdoppen met 350 microliter SIF.Breng de muizenherstam met TNC over naar een microcentrifuge buisdop met 250 microliter SIF. Breng ten slotte de twee muis-TG's over naar een microcentrifugebuisdop met 250 microliter SIF. Plaats de schedelhelften van de rat op een kweekplaat met zes putten en vul de schedel met 400 microliter SIF.Plaats rattenschedels in microcentrifuge buisdoppen met ratten- en muizenweefsel in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius. Vervang SIF met een pipet om de vijf minuten gedurende 20 minuten zonder het weefsel aan te raken. Bereid microcentrifugebuizen voor op monsterverzameling door middel van de juiste etikettering.Voeg vervolgens 50 microliter 10 sterkte EIA-buffer toe aan elke microcentrifugebuis. Bereid vervolgens de oplossing van de teststof en de voertuigoplossing door in SIF voor alle concentraties te verdunnen. Voeg na de laatste wasbeurt 250 microliter SIF toe aan muis-TG en TNC, 350 microliter SIF aan rat-TG en TNC en 400 microliter SIF aan elke rattenschedel.Verzamel na 10 minuten incubatie 200 microliter van het monster in een vooraf gelabelde microcentrifugebuis met 50 microliter EIA-buffer met 10 sterktes om meting van de basale CGRP-afgifte mogelijk te maken. Gooi de resterende vloeistof weg en bewaar de monsters onmiddellijk bij min 20 graden Celsius. Voeg de teststof in toenemende concentraties toe aan het overeenkomstige medium, te beginnen met de laagste concentratie, en incubeer gedurende 10 minuten.Verzamel na 10 minuten incubatie 200 microliter van het monster in een vooraf gelabelde microcentrifugebuis met 50 microliter EIA-buffer met 10 sterktes. Gooi de resterende vloeistof weg en voeg de op een na laagste concentratie toe aan het weefsel. Bewaar de monsters onmiddellijk bij min 20 graden Celsius en herhaal deze procedure met de resterende concentratie.Om een positieve controle voor het experiment uit te voeren, voegt u de positieve controle toe aan het weefsel aan het einde van het protocol. Verzamel na een incubatietijd van 10 minuten een monster van 200 microliter in een microcentrifugebuis met 50 microliter EIA-buffer met 10 sterktes. De concentraties CGRP die vrijkomen in de verzamelde monsters worden gemeten met behulp van een EIA-kit, terwijl de instructies van de fabrikant bij de EIA-kit worden gevolgd.Bij de rat veroorzaakte blootstelling aan capsaïcine een significante CGRP-afgifte van dura mater en TG in vergelijking met het medium. In de dura mater werd de maximale afgifte van CGRP gevonden bij één micromolaire capsaïcine. En in TG werd de maximale CGRP-afgifte gevonden bij 10 micromolaire capsaïcine.Bij analyse met een eenrichtings-ANOVA vertoont glibenclamide geen effect op de basale CGRP-afgifte van dura mater en TG. Glibenclamide verminderde de door capsaïcine geïnduceerde CGRP-afgifte in dura mater aanzienlijk met 40% en TG met 39% in vergelijking met capsaïcine met het medium wanneer geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA. Het transiënte receptorpotentieel Ankyrin-1-agonist super cinnamaldehyde bleek CGRP op een concentratieafhankelijke manier vrij te geven van de TG met respectievelijk 1, 10 en 100 micromolair super cinnamaldehyde, wat resulteert in 9% 52% en 69% verhoogde afgifte van CGRP in vergelijking met respectievelijk het voertuig wanneer geanalyseerd met tweeweg ANOVA. De verhoogde afgifte van CGRP was afwezig in TG van de transiënte receptor potentiële Ankyrin-1 knock-out muizen waar blootstelling aan 1, 10 en 100 micromolaire super cinnamaldehyde resulterend in 11% minus 13% en 9% verandering in de afgifte van CGRP in vergelijking met voertuig respectievelijk wanneer geanalyseerd met twee-weg ANOVA.Het is belangrijk om voorzichtig te zijn om het weefsel niet aan te raken tijdens het verzamelen van monsters en om precies te zijn bij het timen van de incubatietijd voor alle monsters. Als er adequate ELISA-kits beschikbaar zijn, is het mogelijk om deze procedure toe te passen om de afgifte van andere peptiden in het trigeminus vasculaire systeem te meten.

ex-vivo-release-calcitonin-gene-related-peptide-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Shannonhouse, J., et al.In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia. J. Vis. Exp. (2023).The video demonstrates an in vivo calcium imaging technique to monitor neuronal activity in the dorsal root ganglia (DRG) of a transgenic mouse. DRG neurons express a calcium indicator that increases fluorescence intensity upon binding to calcium. Mechanical or thermal stimuli applied to a hind paw generate action potentials that...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse

Hier presenteren we een protocol om ruimtelijke correlatie van calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP)-immunoreactieve zenuwvezels en bloedvaten in de schedel dura mater te visualiseren met behulp van immunofluorescentie en fluorescerende histochemie met respectievelijk CGRP en falloïdine. Bovendien was de oorsprong van deze zenuwvezels retrograde getraceerd met een fluorescerende neurale tracer.

Visualiseren van de Calcitonine Gen-Gerelateerde Peptide Immunoreactieve Innervation van de Rat Cranial Dura Mater met Immunofluorescentie en Neural Tracing

Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI) maken een robuuste analyse op populatieniveau van sensorische neuronsignalering mogelijk. Hier hebben we een nieuwe benadering ontwikkeld die in vivo GECI-visualisatie van de activiteit van trigeminusganglia-neuronen bij ratten mogelijk maakt.

In-vivo Calciumbeeldvorming van sensorische neuronen in het trigeminusganglion van de rat

Deze studie presenteert een chirurgische manipulatie om de T-DRG bloot te leggen bij verdoofde muizen voor in vivo calciumbeeldvorming, samen met synchrone ECG-opnames. Deze methode is een geavanceerd hulpmiddel voor het bestuderen van perifere elektrische zenuwstimulatie en thoracale viscerale orgaaninputs, evenals hun interacties op het primaire sensorische niveau.

In vivo thoracale dorsale wortelganglia (DRG) calciumbeeldvorming en ECG-registratie voor het bestuderen van perifere zenuwstimulatie

Dit protocol beschrijft in vivo GCaMP-calciumbeeldvorming van intacte trigeminusganglion (TG)-neuronen. Deze beschrijving omvat TG-blootstellingschirurgie, in vivo confocale microscopiebeeldvorming van TG-neuronen, toepassing van somatische stimuli tijdens microscopische beeldvorming van TG-neuronen en analyse van in vivo GCaMP-calciumbeeldvormingsgegevens.

In vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte trigeminusganglia

Deze methode beschrijft de generatie van organotypische cerebellaire culturen en het effect van bepaalde apoptotische stimuli op de levensvatbaarheid van de verschillende cerebellaire celtypen.

Organotypische Cerebellaire culturen: apoptotische uitdagingen en Detectie

We beschrijven hier een methode voor biopsying olfactorische slijmvlies van de rat en mens neusholten. Deze biopten kunnen worden gebruikt voor zowel het identificeren van moleculaire afwijkingen in de hersenen ziekten of isoleren van multipotente volwassen stamcellen die gebruikt kunnen worden voor mobiele transplantatie in diermodellen van de hersenen trauma / ziekte.

Isoleren neus Olfactorische stamcellen van Knaagdieren of mensen

In dit rapport presenteren we een volledig geautomatiseerd en zeer veelzijdig systeem dat in staat gelijktijdig testen van multi-cognitief gedrag en het opnemen van neuronale activiteiten voor knaagdieren.

Een Volledig geautomatiseerd en zeer veelzijdige systeem voor het testen van meerdere cognitieve functies en opnemen Neuronale Activiteiten in Knaagdieren

Wordt een techniek beschreven voor het in grote lijnen het openen van de bloed-hersen barrière in de muis met behulp van microbellen en ultrageluid. Met deze techniek kan mangaan worden toegediend aan de hersenen van muizen. Omdat mangaan is een MRI-contrastmiddel dat zich ophoopt in gedepolariseerd neuronen, deze aanpak maakt beeldvorming van neuronale activiteit.

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel geworden voor gebruik in gedragsneurowetenschappelijke experimenten. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp en de installatie van lasersystemen en biedt een volledig protocol voor het uitvoeren van meerdere en gelijktijdige in vivo optogenetische stimulaties die compatibel zijn met de meeste gedragstestparadigma's bij knaagdieren.

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

Leer een ex vivo model om CGRP-afgifte uit het trigeminovasculaire systeem van knaagdieren te meten. Deze methode onderzoekt farmacologische effecten op pijnmechanismen en migraine.

Ex Vivo | Afgifte van calcitonine-gengerelateerd peptide uit het trigeminovasculaire systeem bij knaagdieren

Meer video's verkennen