Name: Shotgun Lipidomics van Knaagdier weefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Leer shotgun lipidomics voor toxikologisch onderzoek met massaspectrometrie in knaagdierweefsels. Deze methode kwantificeert meer dan 400 lipiden in 14 klassen binnen 10 minuten per monster.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen het onderzoeksteam bedanken en vooral de technische assistentie en ondersteuning van de bioonderzoeks- en aerosolteams van PMI R &D, Philip Morris International Research Laboratories Pte, erkennen. Ltd., Singapore, en PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Zwitserland. De auteurs bedanken Sam Ansari voor het beheer van de biobanking en erkennen de steun van Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy voor het bewerken van een concept van het manuscript.

Alle auteurs zijn medewerkers van Philip Morris International. Philip Morris International is de enige financieringsbron en sponsor van dit project.

Sigarettenrook (CS) wordt erkend als een belangrijke risicofactor geassocieerd met de ontwikkeling van chronische ontstekingsziekten van de longen, waaronder longcarcinoom, bronchitis en chronische obstructieve longziekte (COPD)1. Naast de longimpact speelt CS-blootstelling een belangrijke rol bij de ontwikkeling van andere ziekten zoals atherosclerotische coronaire hartziekte en perifere vaatziekten1. Hart- en vaatziekten zijn, samen met COPD, respectievelijk de eerste en derde belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd. Toxicologische risicobeoordelingsbenaderingen zijn van oudsher gebaseerd op het gebruik van diermodellen zoals knaagdieren. In vivo neus-only of full-body rat- en muismodellen worden vaak gebruikt voor het bestuderen van de langetermijneffecten van blootstelling aan CS.
Over het algemeen induceert 6 maanden blootstelling aan rook bijvoorbeeld histologische en functionele afwijkingen in muizenlongen die lijken op die van menselijke ziekten, waaronder emfyseem, luchtwegremodellering en pulmonale hypertensie, hoewel de veranderingen relatief mild zijn in vergelijking met die waargenomen bij langdurige menselijke rokers2. In zowel dierlijke als menselijke weefsels hebben studies een breed scala aan moleculaire veranderingen waargenomen als reactie op blootstelling aan CS, waaronder oxidatieve stressreacties, ontstekingen en structurele weefselveranderingen 3,4. Het is niet verrassend dat cs-blootstelling ook een verreikende impact heeft op het longlipidoom, inclusief effecten op oppervlakteactieve lipiden, lipidensignaleringsmediatoren en structurele lipiden 4,5,6.
Om de bulk lipideveranderingen geïnduceerd door de langdurige CS-blootstelling van muizenlongen te karakteriseren, voerden we een snelle en kwantitatieve shotgun directe infusie massaspectrometrie-analyse uit. Na de introductie van de shotgun lipidomics-methode in 20057, is deze methode effectief gebruikt om onze kennis over lipide cellulair metabolisme 8,9,10 uit te breiden in modelsystemen zoals gist11, Caenorhabditis elegans12 en Drosophila melanogaster13, evenals in een breed scala van zoogdiermonstertypen zoals cellijnen 14, 15,16 verschillende menselijke17,18 en knaagdierweefsels19,20 en lichaamsvloeistoffen21,22.
In de afgelopen decennia hebben studies de complexiteit van cellulaire reacties op veranderingen in de omgeving onthuld, waarbij duizenden onderling verbonden eiwitten, lipiden en metabolieten betrokken zijn. Dit heeft duidelijk gemaakt dat het gebruik van state-of-the-art analytische technieken essentieel is voor het verkrijgen van een diepgaand beeld van de moleculaire machines en voor het blootleggen van de volledige omvang van exogene fysiologische effecten. In deze context kunnen de uitgebreide, kwantitatieve lipide-vingerafdrukken geproduceerd door shotgun-lipidomics-benaderingen effectief bijdragen aan onze kennis over lipide cellulair metabolisme 8,9,10.
Met betrekking tot blootstelling aan CS als een risicofactor voor verschillende ziekten, zijn toxicologische risicobeoordelingsbenaderingen van oudsher gebaseerd op het gebruik van diermodellen zoals knaagdieren. Shotgun lipidomics MS biedt een snel, gevoelig en kwantitatief analytisch hulpmiddel voor het beoordelen van lipidoomverstoring in tal van monstertypen. Het unieke kenmerk van shotgun lipidomics is de geautomatiseerde directe injectie-analyse van een totaal lipide-extract - spiked met gelabelde interne normen - zonder chromatografische scheiding in een MS-instrument met hoge resolutie door gebruik te maken van een geleidende nanochip die een elektrospray-ionisatie (ESI) nanospray23 genereert.
De massa-tot-ladingsverhoudingsinformatie die tegelijkertijd wordt verkregen in de MS1-modus biedt de totale lipidenvoetafdruk van alle intacte endogene lipiden. Optioneel biedt de MS2/MS3-modus, waarin de bovenliggende lipidemoleculen worden gefragmenteerd en geanalyseerd, aanvullende structurele informatie. Data-analyse vereist gespecialiseerde software en omvat de deconvolutie van spectra en piektoewijzingen in gepoolde spectra die leiden tot lipide-identificatie en vermeende chemische structuuropheldering. Bovendien kan absolute kwantificering worden uitgevoerd door een gelabeld intern standaardmengsel te spiking dat ten minste één lipidenstandaard per lipideklasse van belang bevat. Over het algemeen kan ms-analyse die enkele minuten per monster duurt, met de huidige techniek de identificatie en kwantificering van maximaal 800 lipiden uit 14 lipidenklassen24 in knaagdierweefsels omvatten.

<table><tbody><tr><td>1, 5, en 2 mL zelfklevende buizen</td><td>Eppendorf</td><td>30120086, 30120094</td><td></td></tr><tr><td>3 mm roestvrijstalen parels</td><td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr><tr><td>4,1 &micro;m mondstuk chip</td><td>Advion</td><td>HD-D-384</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>45754-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetaat</td><td>Honeywell</td><td>14267-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine standaard, 2 mg/mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>&nbsp;23209</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Honeywell</td><td>33065-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650498-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dichloormethaan</td><td>Honeywell</td><td>34856-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetaat</td><td>Honeywell</td><td>33211</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 wel plaatjes</td><td>Sigma</td><td>M9686</td><td></td></tr><tr><td>Heptaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34873-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>Muis gepoold plasma</td><td>BioIvt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muis SPLASH standaard</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>330710X</td><td>Interne standaard</td></tr><tr><td>Nunc 96-flat bodem wel transparante platen</td><td>VWR</td><td>62409-068</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof spatel</td><td>Sigma</td><td>Z560049-300EA</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford 1x Kleurstof reagens</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Serum verdunningsmiddel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5197</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur/software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td><td>Covaris</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Magneet hamer</td></tr><tr><td>Centrifuge 5427R</td><td>Eppendorf</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>ChipSoft 8.3</td><td>Advion Biosciences</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Software om methode en verwerving op de Triversa nanomate robot in te stellen</td></tr><tr><td>LipidXplorer 1.2.8.1</td><td>N/A</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Software om lipiden te identificeren</td></tr><tr><td>Peak By Peak</td><td>SpectroSwiss</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Software om.raw data van MS naar.mzml formaat te converteren</td></tr><tr><td>ProteoWizard</td><td>ProteoWizard</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Alternatieve (open source) software om.raw data van MS naar.mzml formaat te converteren</td></tr><tr><td>Q-Exactive MS</td><td>Thermo Fisher</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>High resolution orbitrap massaspectrometer</td></tr><tr><td>Qiagen Tissue Lyser II</td><td>Qiagen</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Weefsel lyser</td></tr><tr><td>SpeedVac SPD140DDA</td><td>Thermo Fisher</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Vacuum concentrator</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M nano plus</td><td>Tecan</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Plate reader</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermomixer</td></tr><tr><td>TriVersa Nanomate</td><td>Advion Biosciences</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Directe infusie nano-bron</td></tr><tr><td>Xcalibur 4.3</td><td>Thermo Scientific</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Software om methode en verwerving op de Q-Exactive MS in te stellen</td></tr></tbody></table>

shotgun lipidomics van knaagdier weefsels

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Lipiden spelen een vitale rol als essentiële componenten van alle prokaryote en eukaryote cellen. Constante technologische verbeteringen in massaspectrometrie hebben lipidomics tot een krachtig analytisch hulpmiddel gemaakt voor het monitoren van weefsellipidoomsamenstellingen in zowel homeostatische als ziektetoestanden. Dit artikel presenteert een stap-voor-stap protocol voor een shotgun lipidenanalysemethode die de gelijktijdige detectie en kwantificering van een paar honderd moleculaire lipidesoorten in verschillende weefsel- en biofluïde monsters bij hoge doorvoer ondersteunt. Deze methode maakt gebruik van geautomatiseerde nano-flow directe injectie van een totaal lipide-extract met gelabelde interne standaarden zonder chromatografische scheiding in een hoge-resolutie massaspectrometrie-instrument. Uitgaande van submicrogramhoeveelheden knaagdierweefsel duurt de MS-analyse 10 minuten per monster en bestrijkt tot 400 lipiden uit 14 lipidenklassen in longweefsel van muizen. De hier gepresenteerde methode is zeer geschikt voor het bestuderen van ziektemechanismen en het identificeren en kwantificeren van biomarkers die wijzen op vroege toxiciteit of gunstige effecten in knaagdierweefsels.

Hier, als representatieve resultaten, presenteren we gegevens die illustreren hoe shotgun lipidomics kunnen worden gebruikt om de effecten van CS op de longen van muizen te bestuderen. Het shotgun lipidenanalyseprotocol werd met succes toegepast voor een in vivo studie voor vergelijkende analyse van twee groepen monsters: longweefsels ontleed van negen vrouwelijke Apoe-/− muizen blootgesteld aan CS (3R4F-groep; positieve controle) en een gelijk aantal muizen onder frisse luchtomstandigheden (schijngroep) als negatieve controle verzameld na 3 maanden, 4 maanden en 6 maanden blootstellingstijdpunten. De dieren werden onder gefilterde en geconditioneerde verse lucht gehouden bij 22 °C ± 2 °C temperatuur en 55% ± 15% luchtvochtigheid en gevoed met een gamma-bestraald pelletdieet. Het lichtregime werd gehandhaafd op 12 uur per dag. Per kooi werden maximaal acht muizen gehuisvest. 3R4F-referentiesigaretten voor de blootstellingsbehandeling werden gekocht van de Universiteit van Kentucky om de 3R4F CS-aerosol (600 μg totale deeltjes TPM / L-aerosol) te genereren voor een doelblootstellingsconcentratie gelijk aan 28 μg nicotine / L.CS rook van 3R4F-sigaretten werd geproduceerd met behulp van 30-poorts roterende rookmachines volgens Phillips et al.27 . Op basis van het Health Canada Intensive Smoking Protocol werden 55 ml pufvolume, één trekje per 30 s en 100% blokkering van ventilatiegaten toegepast op 3R4F-sigaretten om voldoende blootstelling te bieden. Alle aanvullende details over de onderzoeksopzet zijn eerder gemeld27,28.
In totaal werden ~400 moleculaire lipidesoorten uit de 14 meest voorkomende lipidenklassen geïdentificeerd en gekwantificeerd (figuur 3). De totale genormaliseerde lipidenconcentratie per klasse was licht verhoogd voor de PE-, PEO-, PC-, PCO-, PI- en PG-lipidenklassen en er werd enige downregulatie waargenomen voor SM-, LPE- en PA-lipiden (figuur 3A), terwijl er geen verschil te zien was voor TAGs en PS. Interessant is dat verhoogde niveaus van PCO- en PEO-plasmalogenlipiden in de CS-groep zijn gemeld in ontstekingscellen29 . Een van de intracellulaire functies van plasmalogen lipiden is antioxiderende activiteit. Onder blootstelling aan reactieve zuurstof (ROS) en stikstofsoorten (RNS) werd selectieve oxidatie van plasmalogenen in vergelijking met diacylfosfolipiden gemeld30. De enyl-etherbinding in de chemische structuur van plasmalogenen is gevoelig voor radicale aanvallen op oxidatieve stress31. De belangrijkste producten van radicale aanval zijn gehydroxyleerde eicosatetetraeenzuren, 2-monoacylglycerolfosfolipiden, pentadecanol, mierenzuren, α-hydroxyaldehyden van verschillende ketenlengtes, 1-formyl-2-arachidonoylglycerofosfolipide en lysofosfolipiden.
Deze resultaten tonen aan dat, onder de moleculaire kenmerken op basis van de totale molecuulformule, 100-120 verbindingen significant werden beïnvloed door CS-blootstelling (figuur 3D). De gedetailleerde deconvolutie van de MS2-fragmentatie-informatie en de normalisatie van de fragmentsignaalintensiteiten maakten het mogelijk om de totale hoeveelheid van elk geconjugeerd vetzuur (FA) in elke lipidenklasse (figuur 3E) te benaderen en deze gegevens te vergelijken tussen blootgestelde en controlegroepen. Een duidelijke afname van zowel volledig verzadigde VA's als die met slechts enkele onverzadigingen, meestal in de context van lyso-lipiden, werd waargenomen. Daarentegen waren meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA) in de samenstelling van PC-, PE- en PG-fosfolipidenklassen verhoogd in de CS-groep voor alle tijdspunten. De extreme gevallen van PC en PG geconjugeerd met eicosapentaanzuur (EPA) en docosahexaeenzuur (DHA) werden uitsluitend gedetecteerd in de 3R4F CS-blootstellingsgroep (figuur 3E, rode kleur).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> Figuur 1: Plaatindeling voor monsterverdeling in de Bradford-test. Blanco- en standaardmonsters worden in drievoud geplaatst in kolommen 1-3; Onbekende monsters worden in tweevoud geplaatst in kolommen 4-11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> Figuur 2: Plaatindeling van de 96-well microtiterplaat voor shotgun massaspectrometrie analyse. De verdeling van blanco, standaard, onbekende en QC-monsters voor acquisitie in de positieve ionisatiemodus wordt aan de linkerkant van de plaat in kaart gebracht (kolommen 1-6); Alle monsters voor de negatieve ionisatiemodus worden rechts geplaatst (kolommen 7-12). Afkortingen: pos = positief; QC = kwaliteitscontrole; neg = negatief; TB = totaal blanco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> Figuur 3: Shotgun lipidomics analyse van muizenlongen blootgesteld aan sigarettenrook. Apoe-/− -muizen werden blootgesteld aan CS van de 3R4F-referentiesigaret of frisse lucht (schijn). (A) Concentraties van de lipidenklasse en het aantal lipidensoorten per klasse. Voor elke klasse staat het aantal gekwantificeerde lipidensoorten tussen haakjes. Gemiddelde en 95% betrouwbaarheidsintervallen voor elke lipidenklasse, afzonderlijk voor elk blootstellingstype (geaggregeerd over drie tijdspunten). (B) Vulkaanplots met de effectgrootte (log2-voudige verandering) en significantie (-log10 FDR-gecorrigeerde p-waarde) van de gekwantificeerde lipidesoorten voor de 3R4F CS versus schijnvergelijking op de drie tijdstippen. Significant verhoogde lipiden zijn geel gemarkeerd; significant verlaagde lipiden zijn gemarkeerd in cyaan (FDR-gecorrigeerde p-waarde < 0,05). (C) Differentiële abundantie van de 25 lipidesoorten met de grootste absolute gemiddelde vouwveranderingen. Log2-vouwveranderingen voor de 3R4F CS versus schijnvergelijking zijn kleurgecodeerd en statistische significantie wordt aangegeven: *: FDR-gecorrigeerde p-waarde < 0,01; X: Voor FDR gecorrigeerde p-waarde < 0,05. (D) Vergelijkingspunten. Correlatiecoëfficiënten voor de vouwveranderingsvergelijkingen zijn kleurgecodeerd en het aantal gedeelde differentieel overvloedige lipiden wordt aangegeven (totale aantallen in de marges). Cirkeldiagrammen tonen het percentage gedeelde differentieel overvloedige lipiden met dezelfde richting van verandering (FC-teken). Asterisk duidt op een significante overlapping van de differentieel overvloedige lipiden. (E) Differentiële abundantie van geconjugeerde VA's per lipidenklasse. Heatmap zoals in paneel C voor geconjugeerde vetzuren met significante abundantieverschillen tussen 3R4F en schijnblootstelling in alle drie de tijdspunten (FDR-gecorrigeerde p-waarde < 0,05). De hoeveelheid van elk vetzuur per lipidenklasse werd geschat op basis van de MS2-intensiteiten van de vetzuurfragmenten. Afkortingen: CS = sigarettenrook; FDR = false discovery rate; FC = vouwwissel; FA = vetzuren; PC = fosfatidylcholine; PS = fosfatidylserine; TAG = triacylglycerol; SM = sfingomyeline; PEO = plasmalogen fosfatidylethanolamine; PE = fosfatidylethanolamine; PG = fosfatidylglycerol; PI = fosfatidylinositol; DAG = diacylglycerol; SE = sterol/cholesterylesters; PCO = plasmalogenfosfatidylcholine; LPC = lysofosfatidylcholine; LPE = lysofosfatidylethanolamine; PA = fosfatidisch zuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>BSA-eindconcentratie (mg/ml)</td>
			<td>BSA-oplossing bij 2 mg/ml (μL)</td>
			<td>Ammoniumbicarbonaatbuffer (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 van 0,125 mg/ml oplossing</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Verdunningsschema van de interne BSA-standaard voor de kalibratiecurve voor de Bradford-test. Afkorting: BSA = runderserumalbumine.
Aanvullende informatie: MFQL-bestanden die worden gebruikt voor lipidXplorer-lipidenidentificatie. Het .zip pakket bestaat uit de afzonderlijke vereiste MFQL-bestanden, elk met de naam volgens dit patroon: <lipidenklasse afkorting>_<ionisatiemodus>_MS2.mfql (bijvoorbeeld PE_neg_MS2.mfql). De bestandsnamen voor gelabelde interne standaardidentificatie bevatten de D7(D9)-tag in de <lipidenafkorting> (bijvoorbeeld PED7_neg_MS2.mfql). Deze MFQL-bestanden worden gebruikt om de hoeveelheid deuterium in de interne standaard te verifiëren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Shotgun massaspectrometrie-gebaseerde lipidomics levert een gevoelige kwantitatieve momentopname van een breed spectrum van lipidenklassen tegelijkertijd in een enkele meting van verschillende knaagdierweefsels.

Shotgun Lipidomics van Knaagdier weefsels

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Het gepresenteerde protocol maakt het mogelijk om een breed scala aan lipiden in dierlijk weefsel te kwantificeren. Het is een eenvoudig hulpmiddel om lipidemechanismen te bestuderen en ook om biomarkers te identificeren die vroege toxiciteit in diermodellen aangeven. De methode levert een kwantitatief profiel van meer dan 400 moleculaire lipiden in 14 verschillende lipidenklassen in een breed scala aan monstermatrices met een trendtijd van 10 minuten per monster.Om te beginnen, verdun centrifuge aliquot 1 supernatant tweemaal de concentratie met ammoniumbicarbonaat buffer. Na het bereiden van de runderserumalbuminestandaardcurve, vortex de standaardbuizen en centrifugeer de buizen op 18, 200 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur. Van de standaardbuizen die eerder zijn voorbereid, brengt u 6 microliter elk van de blanco, standaarden en monsters over naar een 96-well platbodemplaat.Voeg vervolgens 250 microliter van het Bradford-reagens toe aan elke put met behulp van een meerkanaals pipet en meng. Meet na 5 minuten incuberen de absorptie op een golflengte van 595 nanometer met behulp van een plaatlezer. Bereid 2 milliliter buizen met 100 microliter ammoniumbicarbonaatoplossing in elke buis van de totale blanco en interne standaard blanco en bewaar alle monsters op ijs.Bereid kwaliteitscontrolemonsters voor, rekening houdend met het feit dat er één kwaliteitscontrolemonster tussen elke set van 10 monsters wordt geplaatst. Voeg 10 microliter gepoold menselijk plasma toe aan buisjes van 2 milliliter en prik vervolgens 10 microliter interne standaardoplossing in alle interne standaard blanco, kwaliteitscontrole- en studiemonsters. Voeg 300 microliter van min 20 graden Celsius butanol methanolmengsel toe aan elk monster en schud op 450 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op thermomixer.Voeg vervolgens 300 microliter heptaanethylacetaatmengsel toe en schud gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op 450 g op de thermomixer, voeg vervolgens 300 microliter 1% ascetisch zuurmengsel toe en schud gedurende 5 minuten bij 450 g bij kamertemperatuur op de thermomixer. Centrifugeer op 2.800 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en breng 360 microliter van de bovenste fase over naar een nieuwe 2-milliliter zelfvergrendelingsbuis met het label 2. Na het toevoegen van 320 microliter heptaanethylacetaat aan de waterfasebuis met het label 1, schud u gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op de thermomixer bij 450 g en centrifugeert u vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 2.800 g bij kamertemperatuur, zoals eerder aangetoond.Breng 320 microliter van de bovenste fase over en combineer ze met de fractie uit de vorige stap in buis 2. Voeg op dezelfde manier 250 microliter heptaanethylacetaat toe aan de waterfase in buis 1 en schud gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 450 g op de thermomixer. Nogmaals, centrifugeer op 2.800 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, breng vervolgens 200 microliter van de bovenste fase over en combineer deze met de fracties van de vorige stappen in buis 2.Verdampen tot droogheid bij 35 graden Celsius in een vacuümconcentrator en opnieuw oplossen in 300 microliter MS-mengoplossing. Draai elke buis gedurende 5 seconden om ervoor te zorgen dat alles is opgelost en centrifugeer op 18, 200 g gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius. Breng een aliquot van 50 microliter over in de microliterplaat voor positieve ionisatiemodusanalyse en verdun met 50 microliter MS-mengoplossing.Nogmaals, verdun met 80 microliter MS-mix en breng een aliquot van 20 microliter over in de MTP-plaat voor analyse van negatieve ionisatiemodus. Wikkel de plaat in met folie en houd op 4 graden Celsius voor de analyse. Kalibreer een MS zowel in positieve als negatieve modus in overeenstemming met de instructies van de fabrikant 5 dagen of minder vóór de analyse.Installeer de nanobron voor directe infusie vooraf, zorg ervoor dat deze goed is uitgelijnd tegen het overdrachtscapillair van de MS en een 4,1 micrometer nozzle-chip in de chiphouder en controleer vervolgens de parameters voor positieve en negatieve infusie die overeenkomt met een gasdruk van 1,25 psi, bronspanning van 1,1 kilovolt, 5 microliter monsterinjectievolume, uitgangscontactsluiting Rel1 gedurende 2,5 seconden, 5 minuten levertijd, plaatkoeling bij 4 graden Celsius, vervolgens de temperatuurregelaar instellen en een nieuwe plaat maken. Voor de positieve modus controleert en stemt u de software af of de MS-methode is ingesteld met een capillaire temperatuur van 250 graden Celsius en het RF-niveau van de S-lens op 65,0. Open in Xcalibur-software de positieve methode en controleer of de MS-acquisitie met volledige scan is ingesteld van nul tot 1 minuut in het bereik van 550 tot 1.000 m / z met een resolutie van 140.000 met geautomatiseerde versterkingsregeling van 1 miljoen en een maximale injectietijd van 50 milliseconden.Pas een slotmassa van 680,48022 toe. Controleer of de gegevensonafhankelijke MS/MS-acquisitiemethode is ingesteld tussen het tijdsbereik van 1 en 5 minuten met een resolutie van 17.500 met een vaste eerste massa van 250 m/z. Controleer of de geautomatiseerde versterkingsregeling voor MS2 is ingesteld op 100.000 en een maximale injectietijd op 64 milliseconden, een botsingsenergie van 20 NCE, het isolatievenster op 1 m/z en of een inclusiemassalijst van 398 tot 1.100 m/z wordt gebruikt met een massastap van 1 Dalton.Controleer voor de acquisitie in de negatieve modus of de MS-methode is ingesteld met de capillaire temperatuur op 250 graden Celsius in het RF-niveau van de S-lens op 65,0 in het MS-tunebestand. Controleer vervolgens in Xcalibur-software of de volledige scanacquisitiemodus is ingesteld van nul tot 1 minuut bij een resolutie van 140.000 voor het bereik van 400 tot 940 m / z, geautomatiseerde versterkingsregeling van 1 miljoen, maximale injectietijd van 200 milliseconden en een vergrendelingsmassa van 526.46262. Controleer of de MS2-acquisitie in DIA-modus is ingesteld tussen 1 en 5 minuten van de run met een resolutie van 17.500 met een vaste eerste massa van 150 m/z, geautomatiseerde versterkingsregeling van 100.000, 64 milliseconden maximale injectietijd en 35 NCE aan botsingsenergie met behulp van de inclusiemassalijst van 400 tot 940 met een massastap van 1 Dalton.Maak de analysevolgordewachtrij in Xcalibur-software in de positieve modus en activeer deze, maak vervolgens de sequentie in ChipSoft-software en start de analyse terwijl u wacht tot de monsteracquisitie wordt geactiveerd door een contactsluitingssignaal afkomstig van de directe infusierobot voor elk monster. Wanneer de analyse in de positieve modus is voltooid, maakt u de analysevolgordewachtrij in Xcalibur-software in de negatieve modus en activeert u deze, maakt u vervolgens de reeks in ChipSoft-software en start u de analyse terwijl u wacht tot de monsteracquisitie wordt geactiveerd door een contactsluitingssignaal afkomstig van de directe infusierobot voor elk monster. De totale genormaliseerde lipidenconcentratie werd geïdentificeerd en gekwantificeerd uit de 14 meest voorkomende lipidenklassen, die licht verhoogd was voor de PE-, PEO-, PC-, PCO-, PI- en PG-lipidenklassen en er werd enige neerwaartse regulatie waargenomen voor SM-, LPE- en PA-lipiden.Terwijl er geen verschil te zien was voor TAGs en PS. Deze resultaten tonen ook aan dat, onder de moleculaire kenmerken op basis van de totale molecuulformule, 100 tot 120 verbindingen significant werden beïnvloed door blootstelling aan sigarettenrook. De deconvolutie van de MS2-fragmentatie en normalisatie van de fragmentsignaalintensiteiten maakte de geschatte definitie mogelijk van de totale hoeveelheid van elk geconjugeerd vetzuur in elk lipideglas en vergelijking van deze gegevens tussen blootgestelde en controlegroepen. Een afname van volledig verzadigde en weinig onverzadigde vetzuren werd waargenomen, terwijl de meervoudig onverzadigde vetzuren in de samenstelling van PC-, PE- en PG-fosfolipidenklassen gedurende alle tijdspunten verhoogd waren in de sigarettenrookgroep.De extreme gevallen van PC en PG geconjugeerd met eicosapentaeenzuur en docosahexaeenzuur werden uitsluitend gedetecteerd in de 3R4F CS-blootstellingsgroep. Pipetteren van het monster en QC-monster moet worden gedaan met low-band tips en om nauwkeurig te zijn, wat betekent dat de tips tussen elk monster moeten worden gecontroleerd. Het pipetteren van de interne standaardoplossing is van cruciaal belang en moet nauwkeurig zijn.De oplossing van 1 op 1 dichloormethaan methanol moet met zorg worden behandeld en een niet-weekmaker met tips moet worden gebruikt om te voorkomen dat plastic polymeren in de monsters zitten. De uiteinden moeten tussen elk monster worden vervangen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Het doel van deze paper is te presenteren een stapsgewijze procedure voor het verzamelen van verschillende witte vetweefsel van muizen, de vet monsters te verwerken en extraheren van RNA.

Muis adipeus weefsel verzameling en verwerking voor RNA analyse

Dit artikel presenteert een modulair protocol voor weefsellipideomica en transcriptomica, en plasmalipideomica in neurologische ziektemuismodellen gericht op lipiden die ten grondslag liggen aan ontsteking en neuronale activiteit, membraanlipiden, stroomafwaartse boodschappers en mRNA-coderende enzymen / receptoren die ten grondslag liggen aan de lipidefunctie. Bemonsterings-, monsterverwerkings-, extractie- en kwantificeringsprocedures worden beschreven.

Lipidomics en Transcriptomics bij neurologische aandoeningen

Het doel van dit protocol is om fluorescerend gelabelde liposomen te synthetiseren en flowcytometrie te gebruiken om in vivo lokalisatie van liposomen op cellulair niveau te identificeren.

Voorbereiding, toediening en beoordeling van in vivo weefselspecifieke cellulaire opname van fluorescerende kleurstof-gelabelde liposomen

Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.

Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters

Dit artikel biedt drie eenvoudige en toegankelijke testen voor het beoordelen van het lipidemetabolisme bij muizen.

Beoordeling van de lipidenbehandelingscapaciteit van het hele lichaam bij muizen

Gedetailleerd protocol en drie Python-scripts zijn voorzien voor het bedienen van een open-source robotisch vloeistofverwerkingssysteem om semi-geautomatiseerde eiwitmonstervoorbereiding uit te voeren voor massaspectrometrie-experimenten, met betrekking tot wasmiddelverwijdering, eiwitvertering en peptide-ontzoutingsstappen.

Shotgun Proteomics Sample Processing geautomatiseerd door een open-source labrobot

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de juiste monstervoorbereiding voor lipide- en metabolietanalyse in kleine weefsels, zoals de Drosophila-hersenen , met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie beeldvorming.

Monstervoorbereiding voor snelle lipidenanalyse in drosophila-hersenen met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie massaspectrometrie beeldvorming

Triglyceride lipolyse in adipocyten is een belangrijk metabolisch proces dat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren en glycerol. Hier bieden we een gedetailleerd protocol om basale en gestimuleerde lipolyse te meten in adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen.

Het meten van de snelheid van lipolyse in ex vivo muizenvetweefsel en primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro

Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van in vivo vierdimensionale echografie en ex vivo massaspectrometriebeeldvorming om biomechanische en biomoleculaire veranderingen in het cardiovasculaire systeem van muizen te beoordelen. Deze techniek wordt toegepast om cardiale remodellering te analyseren bij chirurgisch geïnduceerd myocardinfarct en vasculaire veranderingen bij ouder wordende dieren.

Multimodale studie van cardiovasculaire remodellering bij muizen: vierdimensionale echografie en massaspectrometriebeeldvorming

Gemodificeerde Northern blotting methode voor het meten N6 -methyladenosine (m 6 A) veranderingen in RNA wordt beschreven. De huidige methode kan wijzigingen in diverse RNA's en controles onder verschillende experimentele ontwerpen te detecteren.

Een methode voor het meten van RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Wijzigingen in cellen en weefsels

Leer shotgun lipidomics voor toxikologisch onderzoek met massaspectrometrie in knaagdierweefsels. Deze methode kwantificeert meer dan 400 lipiden in 14 klassen binnen 10 minuten per monster.

Shotgun Lipidomics van Knaagdier weefsels

Meer video's verkennen