Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Het belang van deze methode is dat het labelvrije microtubuli tegelijkertijd met fluorescerend gelabelde eiwitten met hoge framesnelheden mogelijk maakt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoudige implementatie en minimale eisen aan optische componenten. Het omzeilt ook de noodzaak van fluoro-4-etikettering van microtubuli.

Bereid om te beginnen het PDMS-polymeer voor door het uithardingsmiddel en het basiselastomeer in een massaverhouding van 1:10 te combineren. Meng ze twee minuten en ontgas het mengsel vervolgens in een vacuümkamer totdat alle bubbels verdwijnen. Giet het mengsel daarna op de hoofdvorm in een laag van ongeveer 0,5 centimeter dik, zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan en bak het mengsel gedurende 40 minuten in een voorverwarmde oven op 70 graden Celsius.

Snijd vervolgens de gestructureerde gebieden van het polymeer uit en pons gaten aan elk uiteinde van het kanaal met behulp van een PDMS-ponser. Reinig later de gestructureerde kant van het PDMS-blok. Spoel vervolgens driemaal met isopropanol en methanol gevolgd door ultrapuur water en föhn het oppervlak.

Vervolgens reinigt plasma het PDMS met zuurstof- of luchtplasma en plaatst het plasmagezuiverde PDMS op een goed gereinigd afdekglas. Verwarm het op een hete plaat op 80 graden Celsius gedurende 15 minuten. Steek polyethyleenbuizen van de juiste grootte in de gaten en sluit de uitlaatslang aan op een spuit van 0,5 milliliter.

Laat de oplossingen vervolgens in de microkanalen stromen door de inlaatbuis in de oplossing onder te dompelen en het vereiste volume met de spuit te trekken. Plaats het monster op het microscooppodium en schakel de epi-verlichtingslichtbron in voor IRM-beeldvorming. Als u de microscoop wilt scherpstellen, zoekt u naar het juiste brandpuntsvlak in de buurt van de PDMS-oplossingsinterface en kiest u een gezichtsveld in de buurt van het midden van het kanaal.

Bereid vervolgens een 0,1-micromolaire oplossing van fluorescerende microbeads in BRB80 en stroom in ten minste één kanaalvolume van de microbead-oplossing. Monitor de reactie via IRM of TIRF. Wanneer de gewenste dichtheid van microbeads is bereikt, spoelt u het teveel uit met BRB80.

Laat verdunde zaden in de reactiekamer stromen en controleer de reactie via IRM. Wanneer de gewenste dichtheid van zaden is bereikt, spoelt u het teveel uit met BRB80. Bereid vervolgens een microtubule-uitbreidingsmengsel met 12-micromolair ongelabeld tubuline, één-millimolair GTP, vijf-millimolar DTT in BRB80-buffer.

Stroom vervolgens ten minste één kanaalvolume van het uitbreidingsmengsel in en zorg ervoor dat de reactietemperatuur 28 graden Celsius is. Stel om te beginnen de beeldinstellingen in op de microscoopsoftware. Start de beeldvorming en laat de kinesine-oplossing in de kamer stromen.

Visualiseer vervolgens de GFP gelabelde kinesine 1 onshrinking microtubuli. Nadat de meting is voltooid, neemt u een korte video op waarin het podium langzaam wordt vertaald in een cirkelvormige of laterale beweging. De mediane projectie van deze video zal dienen als achtergrondafbeelding en zal worden afgetrokken van de onbewerkte metingen.

Maak een mediane projectie in ImageJ van de achtergrondopname door op Afbeelding te klikken. Selecteer vervolgens de optie Stapels en klik op Z Project. Trek vervolgens de mediane achtergrondprojectie af van de onbewerkte afbeeldingsgegevens door op Verwerken te klikken en selecteer vervolgens de optie Beeldcalculator terwijl u ervoor zorgt dat u de 32-bits floatresultaatoptie aanvinkt.

Kies voor beeldregistratie een verzameling microbeads in de buurt van de microtubule van belang en gebruik ze om de TIRF- en IRM-afbeeldingen uit te lijnen. Gebruik voor elke kraal in deze verzameling het meerpuntsselectiegereedschap om de geschatte locatie in het TIRF-kanaal en vervolgens de overeenkomstige locatie in het IRM-kanaal te markeren. Voer vervolgens de meegeleverde ImageJ-macro uit.

Microbeads verschijnen als donkere vlekken in het IRM-kanaal aan de rechterkant en als heldere vlekken in het TIRF-kanaal aan de linkerkant. De uitlijningsprocedure legt de twee kanalen op de juiste manier over elkaar door een selectie kralen te lokaliseren. Een kymograaf van EGFP-gelabelde kinesinemoleculen die naar de krimpende uiteinden van microtubuli lopen, werd ook verkregen met behulp van dit protocol.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om hoge numerieke diafragmadoelstellingen te kiezen om totale interne reflectie te bereiken en ook om de verzamelefficiëntie en het beeldcontrast te maximaliseren. Deze methode kan worden gebruikt voor hoge resolutie beeldvorming van enkele fluorescerende moleculen tegelijkertijd binnen de macromoleculaire structuur die massief genoeg is om te worden gevisualiseerd door IRM, zoals celmembraan of actinefilament. Dit protocol biedt ook een eenvoudig aanpasbare procedure voor gelijktijdige beeldvorming met elke combinatie van IRM, TIRF en epifluorescentie.