Name: Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Leer gelijktijdige interferentiereflectie- en TIRF-microscopie voor dynamische microtubuli en fluorescerende eiwitten. Deze methode biedt labelvrije beeldvorming met hoge framerates voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken het lab van Thierry Emonet voor het delen van cleanroomapparatuur. We danken Yin-Wei Kuo voor het voorbereiden van de gezuiverde eGFP-kinesine die in deze studie wordt gebruikt. Y.T. erkent de steun van de Alexander von Humboldt Foundation via de Feodor Lynen Research Fellowship. Dit werk werd ondersteund door NIH Grant R01 GM139337 (aan J.H.).

1. Voorbereiding van stroomkamers
OPMERKING: Microfluïdische flowkamers worden geconstrueerd door polydimethylsiloxaan (PDMS) microkanalen te hechten aan een gereinigd en gefunctionaliseerd afdekglas. De microkanalen worden gegoten in een meestermal.
<ol><li>
Voorbereiding van PDMS-kanalen
	<ol>
<li>Bereid gereinigde en/of gefunctionaliseerde afdekglazen voor met een oppervlaktechemie die geschikt is voor de specifieke test die wordt afgebeeld. OPMERKING: Voor kinesinemotiliteitstests worden piranha-gereinigde silanized coverglazen gebruikt. Deze worden bereid zoals beschreven in Gell et. al.1 Als alternatief is een eenvoudigere procedure om afdekglazen in isopropanol te soniceren, gevolgd door methanol gedurende 3x 20 min cycli.</li>
		<li>Om een hoofdmal voor te bereiden, snijdt u stroken enkelzijdige stationaire tape tot de gewenste grootte van het stroomkanaal. Plak de stroken op de bodem van een petrischaaltje van 10 cm en schik ze naast elkaar met een afstand van ten minste 1 cm tussen de strips. OPMERKING: Als nauwkeurige kanaalafmetingen vereist zijn, kan de mal worden vervaardigd op siliciumwafers met behulp van fotolithografie14.</li>
		<li>Om het PDMS-polymeer te bereiden, combineert u het uithardingsmiddel en het basiselastomeer in een massaverhouding van 1:10. Meng gedurende 2 min. OPMERKING: Deze mengverhouding kan worden gevarieerd om de stijfheid van het polymeer af te stemmen. Een hogere verhouding van base tot uithardingsmiddel resulteert in een zachter polymeer.</li>
		<li>Ontgas het mengsel in een vacuümkamer totdat alle bubbels verdwijnen.</li>
		<li>Giet het mengsel op de hoofdvorm in een laag van ~ 0,5 cm dik en zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan.</li>
		<li>Bak het mengsel in een voorverwarmde oven op 70 °C gedurende 40 min. OPMERKING: Een langere uithardingstijd kan nodig zijn als het PDMS-blok dik is (>1 cm). Blijf in stappen van 5 minuten verwarmen totdat het volledig is uitgehard.</li>
		<li>Knip de gestructureerde gebieden van het polymeer uit. Pons gaten aan elk uiteinde van het kanaal met behulp van een PDMS-ponser. OPMERKING: In dit protocol is de gatdiameter ingesteld op 0,75 mm en kan deze worden aangepast aan de vereiste stroomsnelheden. PDMS-kanalen kunnen gedurende langere tijd in droge omgevingen worden opgeslagen, maar moeten vóór gebruik worden gereinigd.</li>
		<li>Reinig de gestructureerde kant van het PDMS-blok. Gebruik stationaire tape om grote deeltjes te verwijderen. Afspoelen met isopropanol en vervolgens methanol. Herhaal deze spoelingen 3x, spoel af met ultrapuur water en föhn het oppervlak.</li>
		<li>Plasma reinigt het PDMS met behulp van zuurstof- of luchtplasma. OPMERKING: In dit protocol wordt 18 W luchtplasma gebruikt.</li>
		<li>Plaats het plasma gereinigde PDMS op een goed gereinigd afdekglas en verwarm gedurende 15 minuten op een kookplaat bij 80 °C. OPMERKING: Epoxyhars kan op de zijkanten van het PDMS-blok worden aangebracht om het beter op het afdekglas te hechten.</li>
		<li>Plaats de op de juiste grootte zijnde polyethyleenbuizen met lage dichtheid (LDPE) in de gaten. Sluit de uitlaatslang aan op een spuit van 0,5 ml. OPMERKING: In dit protocol worden buizen met een binnendiameter van 0,023 inch aangesloten op het PDMS via een metalen adapter met een buitendiameter van 0,025 inch.</li>
		<li>Stroomoplossingen in de microkanalen door de inlaatbuis in de oplossing onder te dompelen en het vereiste volume met de spuit op te zuigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Optische installatie
<ol><li>
Modificatie van de microscoop (figuur 1)
	<ol>
<li>Wijzig een TIRF-microscoop om IRM-beeldvorming13 mogelijk te maken. Vervang de 50/50 (Reflectance (R)/Transmission (T)) beam splitter die in het filterwiel van de microscoop wordt gebruikt door een 10/90 (R/T) beam splitter.</li>
		<li>Plaats een beeldsplitser tussen de camera en de microscoop.</li>
		<li>Plaats in de filterkubus van de beeldsplitter een 10/90 (R/T) bundelsplitser. Plaats een 600 nm langdoorlaatfilter voor de gereflecteerde bundel en een geschikt fluorescentie-emissiefilter voor de uitgezonden bundel. OPMERKING: Beam splitters met verschillende R/T-verhoudingen kunnen worden gebruikt om de fracties van de IRM- en TIRF-emissielamp die worden opgevangen af te stemmen.</li>
		<li>Lijn de beeldsplitser uit volgens de specificaties van de fabrikant om de TIRF- en IRM-signalen op de camerachip ruimtelijk te scheiden. OPMERKING: Ruimtelijke scheiding van de signalen is vereist omdat het TIRF-signaal van typische fluoroforen veel zwakker is dan het IRM-signaal van een microtubuli en niet detecteerbaar zou zijn als de twee signalen over elkaar heen lagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Beeldvorming van dynamische microtubuli en enkele Kinesine-moleculen
<ol><li>Oppervlakte functionalisatie en passivering
	<ol>
<li>Stroom BRB80 buffer (80 mM Na-PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, getitreerd tot pH 7,8 met NaOH) in de reactiekamer.</li>
		<li>Stroom antibiotine oplossing verdund tot 0,025 mg/ml in BRB80 en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Was het kanaal met de BRB80.</li>
		<li>Stroom in F-127-oplossing (1% Pluronic F-127 (w/v) opgelost in BRB80 gedurende één nacht) en incubeer gedurende ten minste 20 minuten voor oppervlaktepassivering. OPMERKING: Als gemakkelijk te reinigen afdekglazen worden gebruikt in plaats van silanized coverglazen, passiveer dan met 2 mg / ml caseïne in BRB80 gedurende >20 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Was het kanaal met de BRB80.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding op beeldvorming
	<ol>
<li>Als temperatuurregeling vereist is, gebruikt u een objectieve verwarming en stelt u deze in op de juiste temperatuur. OPMERKING: In dit protocol worden alle experimenten uitgevoerd bij 28 °C.</li>
		<li>Plaats het monster op het microscoopstadium en schakel de epiilluminatielichtbron (>600 nm) in voor IRM-beeldvorming. OPMERKING: In dit protocol wordt een witte LED-lichtbron gebruikt met een 600 nm langdoorlaatfilter.</li>
		<li>Richt de microscoop op het monsteroppervlak. Zoek naar het juiste brandpuntsvlak in de buurt van de PDMS-oplossingsinterface. OPMERKING: In IRM zou de waterige binnenkant van het kanaal er veel helderder uit moeten zien dan het PDMS-polymeer.</li>
		<li>Kies een gezichtsveld in de buurt van het midden van het kanaal.</li>
		<li>Bereid een oplossing van 0,1 μm fluorescerende microbeads in BRB80 (dichtheid: 109 kralen/ml, wat overeenkomt met een 200-voudige verdunning voor de kralen die in dit protocol worden gebruikt).</li>
		<li>Stroom in ten minste één kanaalvolume van de microbead-oplossing.</li>
		<li>Monitor de reactie via IRM. Wacht tot de microbeads geleidelijk aan op het oppervlak "landen". Wanneer de gewenste dichtheid van microbeads is bereikt, spoelt u het teveel uit met BRB80.</li>
	</ol></li>
	<li>Groeiende gebiotinyleerde guanylyl 5'-α,β-methyleendifosfonaat (GMPCPP)-gestabiliseerde microtubulizaden
	<ol>
<li>Bereid in een centrifugebuis van 0,6 ml 50 μL van een oplossing met 1 mM GMPCPP, 1 mM MgCl2 en 2 μM gebiotinyleerde tubuline (5-10% etiketteringstoichiometrie) in BRB80. OPMERKING: De juiste etiketteringsstoichiometrie kan worden bereikt door biotinyleerde tubuline met hoge dichtheid te combineren met ongelabelde rundertubuline in de juiste verhouding.</li>
		<li>Incubeer de oplossing gedurende 5 minuten op ijs en incubeer vervolgens gedurende 12,5 minuten bij 37 °C. OPMERKING: De lengte van de zaden kan worden geregeld door de polymerisatietijd af te stemmen.</li>
		<li>Stop de polymerisatie door 100 μL kamertemperatuur BRB80 toe te voegen.</li>
		<li>Draai de oplossing in een ultracentrifuge bij kamertemperatuur (126.000 x g, 5 min). Gooi het supernatant weg met behulp van een pipet om niet-geplymeriseerde tubuline te verwijderen. OPMERKING: In dit protocol wordt een luchtaangedreven ultracentrifuge gebruikt.</li>
		<li>Voeg 200 μL BRB80 bij kamertemperatuur toe aan de pellet. Resuspend de pellet door voorzichtig maar grondig te pipetteren. Gebruik een pipet van 200 μL met een snijpunt om het afschuiven van de microtubuli te verminderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Groeiende dynamische guanosine difosfaat (GDP)-tubuline "uitbreidingen" OPMERKING: De zaden worden geïmmobiliseerd op het antibiotineoppervlak van het stroomkanaal. Dynamische GTP/GDP "uitbreidingen" zullen worden gekweekt vanaf de uiteinden van de geïmmobiliseerde zaden.<ol>
<li>Verdun de zaden 20x in BRB80. Laat de verdunde zaden in de reactiekamer stromen.</li>
		<li>Monitor de reactie via IRM. Wacht tot de zaden geleidelijk op het oppervlak "landen" en eraan binden. Wanneer de gewenste dichtheid van zaden is bereikt, spoelt u het teveel uit met BRB80.</li>
		<li>Bereid een microtubule-uitbreidingsmengsel: 12 μM ongelabelde tubuline, 1 mM GTP, 5 mM dithiothreitol (DTT) in BRB80-buffer.</li>
		<li>Stroom in ten minste één kanaalvolume van het uitbreidingsmengsel. Zorg ervoor dat de reactietemperatuur 28 °C is.</li>
		<li>Wacht tot de microtubule-extensies na verloop van tijd uit de zaden groeien. OPMERKING: De steady-state lengte wordt meestal bereikt in minder dan 20 minuten.</li>
		<li>Gebruik de dynamische microtubuli voor beeldvorming. Voeg fluorescerende MAPs toe en visualiseer deze op de microtubuli, zoals beschreven in stap 3.5 voor kinesine-1. OPMERKING: Omdat de microtubuli oppervlaktegebonden zijn, zijn ze gemakkelijk zichtbaar door TIRF.</li>
	</ol></li>
	<li>Kinesinemotiliteitstest OPMERKING: Deze stap beschrijft een protocol voor het visualiseren van beweeglijk groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld kinesine-1 op krimpende microtubuli. Een afgeknotte rat kinesine-1-constructie gefuseerd met eGFP (rKin430-eGFP) werd uitgedrukt en gezuiverd, zoals eerder beschreven15,16.<ol>
<li>Motiliteitsbuffer bereiden: 1 mM ATP en 0,2 mg/ml caseïne in BRB80.</li>
		<li>Verdun kinesine-eGFP in motiliteitsbuffer tot 10 nM.</li>
		<li>Bereid een 2x zuurstof aaseteroplossing om oxidatieve fotobleaching tegen te gaan (80 mM glucose, 80 mg/ml glucoseoxidase, 32 mg/ml catalase, 0,2 mg/ml caseïne, 20 mM DTT) aangevuld met 2 mM ATP.</li>
		<li>Combineer 10 delen zuurstofvanger, 9 delen BRB80 en 1 deel 10 nM kinesine-eGFP voor een uiteindelijke kinesineconcentratie van 0,5 nM. OPMERKING: Het totale volume moet minstens 1,5 keer groter zijn dan het kanaalvolume.</li>
		<li>Stel de beeldinstellingen in op de microscoopsoftware. OPMERKING: In dit protocol worden video's opgenomen met 10 fps met een belichtingstijd van 100 ms. De laserintensiteit is ~0,05 kW/cm2.</li>
		<li>Begin met het afbeelden en laat de kinesine-oplossing in de kamer stromen.</li>
		<li>Nadat de meting is voltooid, neemt u een korte (~ 5 s) video op waarin het podium langzaam wordt vertaald in een cirkelvormige of laterale beweging. Gebruik de mediane projectie van deze video als achtergrondafbeelding en trek deze af van de onbewerkte metingen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Beeldverwerking en -analyse
OPMERKING: Beeldverwerking werd uitgevoerd met behulp van NIH ImageJ2 (imagej.nih.gov/ij/). Er is een macro ontwikkeld om het splitsen en uitlijnen van de TIRF- en IRM-kanalen te automatiseren. Voor deze macro moet de GaussFit_OnSpot plug-in worden geïnstalleerd (beschikbaar op de ImageJ plugins repository).
<ol><li>Maak vanuit de achtergrondopname een mediane projectie in ImageJ door op Image | Stapels | Z-project.</li>
	<li>Trek de mediane achtergrondprojectie af van de onbewerkte afbeeldingsgegevens door op Proces | Beeldcalculator. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de optie "32-bits (float) resultaat" aanvinkt.</li>
	<li>Kies voor beeldregistratie een verzameling microbeads in de buurt van de microtubule van belang en gebruik ze om de TIRF- en IRM-afbeeldingen uit te lijnen.</li>
	<li>Gebruik voor elke kraal in deze verzameling het meerpuntsselectiegereedschap om de geschatte locatie in het TIRF-kanaal en vervolgens de overeenkomstige locatie in het IRM-kanaal te markeren. OPMERKING: Als er bijvoorbeeld twee kralen (1 en 2) zijn, heeft de meerpuntsselectie vier punten in de volgende volgorde: (1) kraal 1 in TIRF, (2) kraal 1 in IRM, (3) kraal 2 in TIRF, (4) kraal 2 in IRM.</li>
	<li>Voer de meegeleverde ImageJ-macro (ImageSplitterRegistration.ijm) uit. OPMERKING: Dit automatiseert de volgende stappen: i) het schatten van de centrale locatie van elke kraal door het passen op een Gauss; ii) voor elke kraal, het berekenen van de verplaatsingsvector die het centrum in het TIRF-kanaal scheidt van het centrum in het IRM-kanaal; iii) het gemiddelde van deze verplaatsingsvector over alle kralen; iv) het opsplitsen van de TIRF- en IRM-kanalen in afzonderlijke beelden; v) het vertalen van het TIRF-beeld met de gemiddelde verplaatsingsvector berekend in iii; vi) het overlappen van de TIRF- en IRM-afbeeldingen in een meerkanaals .tiff bestand.</li>
</ol>

<ol><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7%3A+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Kuo, Y. -W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spastin+is+a+dual-function+enzyme+that+severs+microtubules+and+promotes+their+regrowth+to+increase+the+number+and+mass+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).</li>
<li>Hinrichs, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+protein+diffuses+along+the+microtubule+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tau protein diffuses along the microtubule lattice.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).</li>
<li>Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herding+of+proteins+by+the+ends+of+shrinking+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%3A%22%5BJournal%5D)">Herding of proteins by the ends of shrinking polymers.</a> arXiv:. , (2021).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+dynamics+of+breakage+of+fluorescent+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules.</a> Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).</li>
<li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li>
<li>Taylor, R. W., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+RW+%22Interferometric+scattering+%28iSCAT%29+microscopy+and+related+techniques.+in+Label-free+super-resolution+microscopy%22">Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy</a>. Astratov, V. , Springer. Cham. 25-65 (2019).</li>
<li>Young, G., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+scattering+microscopy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interferometric scattering microscopy).</a> Annual Review of Physical Chemistry. 70 (1), 301-322 (2019).</li>
<li>Koch, M. D., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+and+bending+analysis+of+microtubules+by+ROCS+microscopy+and+optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping.</a> Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).</li>
<li>Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+single+microtubule+dynamics+using+spatial+light+interference+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy.</a> ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).</li>
<li>Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+high-speed+wide-field+imaging+of+single+microtubules+using+interference+reflection+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy.</a> Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).</li>
<li>Mahamdeh, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+interference+reflection+microscopy+for+label-free%2C+high-speed+imaging+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520(2019).</li>
<li>Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microfabrication in biology and medicine.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 1, 401-425 (1999).</li>
<li>Rogers, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF1D+is+a+fast+non-processive+kinesin+that+demonstrates+novel+K-loop-dependent+mechanochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry.</a> The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).</li>
<li>Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fractional+steps+in+cargo+movement+by+the+collective+operation+of+kinesin-1+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).</li>
<li>Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+microtubules+and+associated+proteins+by+Simultaneous+Interference-Reflection+and+Total-Internal-Reflection-Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy.</a> arXiv. , (2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Het bestuderen van de regulatie van microtubule-dynamica door microtubule-geassocieerde eiwitten (MAPs) vereist vaak gelijktijdige beeldvorming van microtubuli en MAPs. Fluorescentiemicroscopietechnieken zoals TIRF worden meestal voor dit doel gebruikt. Ze worden echter beperkt door de nadelen van fluorescentiebeeldvorming, waaronder fotobleaching, fotoschade en de noodzaak van fluorofooretikettering. Labelvrije methoden, zoals IRM, zijn geschikt voor het visualiseren van microtubuli, maar zijn niet in staat om afzonderlijke fluoroforen in beeld te brengen. Dit protocol combineert labelvrije IRM-beeldvorming en TIRF-microscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en MAPs.
De IRM-opstelling maakt gebruik van een LED-verlichtingsbron gefilterd tot >600 nm, terwijl de TIRF-opstelling een 488 nm-laser gebruikt. We gebruikten een goedkope plaatbundelsplitter om het verlichtingslicht op het monster te reflecteren en het verzamelde signaal naar de detector te sturen (figuur 1). Een bundelsplitser met 10% reflectie en 90% transmissie werd gekozen om het verlies van het signaal met één molecuul te minimaliseren. Het verlies van 90% in de lichtintensiteit van de verlichting wordt gecompenseerd door het vermogen van de verlichtingslaser en LED te verhogen. 
Spectrale scheiding van de signalen werd bereikt met behulp van een 90/10 (R/T) bundelsplitser en twee spectrale filters (long-pass 600 nm voor IRM en band-pass 535/50 nm voor TIRF). De spectraal gescheiden IRM- en TIRF-signalen worden geprojecteerd op twee helften van een enkele camerachip met behulp van een beeldsplitserassemblage. Het gebruik van een 90/10 beam splitter offert 90% van het IRM-signaal op, maar dit wordt gecompenseerd door de intensiteit van de LED-verlichtingsbron te verhogen. Een dichroïsche spiegel zou hier ook kunnen worden gebruikt om de IRM- en TIRF-signalen efficiënter te scheiden. Fluorescerende microbeads die in de assays zijn opgenomen, maken een nauwkeurige uitlijning van de TIRF- en IRM-beelden mogelijk en dienen als referentie voor het scherpstellen van het doel.
Het meest kritische optische element in dit protocol is het hoge numerieke diafragma (NA) objectief. Dit is niet alleen essentieel om totale interne reflectie te bereiken, maar ook om de efficiëntie van de collectie en het beeldcontrast te maximaliseren. De kwaliteit van de verkregen afbeeldingen hangt ook af van de netheid van het glasoppervlak en de verwerving van een duidelijke achtergrondafbeelding om te corrigeren voor niet-uniforme verlichting en statische kenmerken te verwijderen. Voor IRM-beeldvorming raden we aan om verlichting met een lange golflengte (>600 nm) te gebruiken om de fotoschade van microtubuli en eiwitten te minimaliseren. Dit is vooral belangrijk als een witte LED-lichtbron wordt gebruikt, in welk geval een long-pass filter moet worden meegeleverd om UV-licht te verwijderen. 
Dit protocol maakt labelvrije, snelle beeldvorming van dynamische microtubuli en gelijktijdige hoge-resolutie visualisatie van fluorescerende MAPs17 mogelijk. Vergeleken met de filterkubusschakeltechniek, die afwisselt tussen het vastleggen van afbeeldingen van microtubuli en MAPs, is deze opstelling in staat tot veel hogere framesnelheden omdat deze niet afhankelijk is van de fysieke rotatie van een filterkubus. In vergelijking met tweekleurige TIRF-beeldvormingstechnieken maakt deze techniek gebruik van een minder veeleisende optische opstelling en omzeilt de noodzaak van fluorofooretikettering van microtubuli. De primaire beperkingen van deze opstelling zijn te wijten aan de TIRF-beeldvorming van de MAPs; de framesnelheid wordt beperkt door de belichtingstijd van een fluorofoor en fotobleaching van fluoroforen blijft een mogelijkheid. Niettemin verbetert dit protocol de bestaande technieken omdat het TIRF alleen gebruikt wanneer dat nodig is (d.w.z. om MAPs te visualiseren, maar geen microtubuli) en de hoogst mogelijke snelheid bereikt binnen de grenzen van TIRF. Verdere verbeteringen zijn alleen mogelijk als zowel de microtubuli als de MAPs worden gevisualiseerd via een interferometrische techniek, maar dit vereist het labelen van MAPs met metalen nanodeeltjes, wat zijn beperkingen en experimentele uitdagingen heeft.
Om de mogelijkheden van deze techniek te demonstreren, hebben we tegelijkertijd twee snelle dynamische processen gevisualiseerd via IRM en TIRF: de krimp van een microtubuli en het lopen van een fluorescerend kinesinemolecuul. Deze techniek is eerder gebruikt om de snelle diffusie van spastine op krimpende microtubuli te visualiseren5. Naast deze toepassing op MAPs en microtubuli, kan dit protocol worden gebruikt om enkele fluorescerende moleculen tegelijkertijd te visualiseren met elke macromoleculaire structuur die massief genoeg is om te worden gevisualiseerd via IRM, zoals een celmembraan of actinefilament.

Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopie wordt vaak gebruikt voor de visualisatie van enkele fluorescerende moleculen. In vergelijking met epifluorescentiebeeldvorming bereikt TIRF superieure achtergrondonderdrukking, waardoor lokalisatie met hoge resolutie en tracking van enkele fluoroforen mogelijk is. Om deze reden is TIRF de voorkeursmethode voor het visualiseren van fluorescerend gelabelde microtubule-geassocieerde eiwitten en wordt het vaak gebruikt om microtubuli in beeld te brengen 1,2.
Om de regulatie van microtubuledynamica door MAPs te onderzoeken, is het vaak nodig om zowel microtubuli als MAPs tegelijkertijd in beeld te brengen. De meeste bestaande methoden voor dit doel zijn duur of lijden aan technische nadelen. Simultane tweekleurige TIRF vereist bijvoorbeeld twee excitatielasers en twee camera's. Naast de hoge kosten levert de behoefte aan aparte camera's framesynchronisatie en beeldregistratieproblemen op. Deze behoefte kan worden omzeild als een roterende filterkubus wordt gebruikt om fysiek te schakelen tussen excitatielasers in opeenvolgende frames3. In zo'n opstelling kan een enkele camerachip worden gebruikt en wisselen de frames af tussen beelden van microtubuli en MAPs. Deze techniek wordt echter beperkt door de snelheid van de filterwissel, die de framesnelheid doorgaans beperkt tot minder dan 0,5 frames per seconde3 (fps). Een dergelijke framesnelheid is onvoldoende om snelle dynamische processen op te lossen, zoals de krimp van een microtubuli met een snelheid tot 500 nm/s, het lopen van een kinesine met een snelheid in de orde van grootte van 800 nm/s, of de diffusie van een MAP die optreedt met diffusiecoëfficiënten van meer dan 0,3 μm2/s4. Dit is met name problematisch bij het volgen van de relatieve posities van twee bewegende doelen in elk kanaal, zoals de positie van een MAP ten opzichte van de positie van een bewegende microtubule tip5.
Naast deze optische beperkingen vereist tweekleurige TIRF-microscopie dat MAPs en microtubuli worden gelabeld met verschillende fluoroforen waarvan de emissiespectra voldoende gescheiden zijn. Fluorescerende etikettering van tubuline kan de microtubule-dynamiek6 veranderen en het fotobleachen van fluoroforen beperkt de beeldvormingssnelheid7. Vanwege deze problemen zijn labelvrije beeldvormingstechnieken ontwikkeld om microtubuli te visualiseren. Deze omvatten interferometrische verstrooiingsmicroscopie (iSCAT)8,9, rotating-coherent-scattering microscopie (ROCS)10, spatial light interference microscopy (SLIM)11 en interference reflection microscopy (IRM)12,13. Deze technieken maken snelle labelvrije beeldvorming van microtubuli mogelijk zonder de nadelen van fluorescentiebeeldvorming, maar ze kunnen niet worden gebruikt om afzonderlijke MAPs te visualiseren.
Van deze labelvrije technieken onderscheidt IRM zich door zijn lage kosten en zijn bescheiden eisen aan instrumentatie. We hebben onlangs een protocol gepresenteerd voor het combineren van IRM met een commerciële TIRF-microscoop, waardoor microtubuli en fluorescerende MAPs in afwisselende frames kunnen worden afgebeeld 3,13. Dit artikel presenteert een protocol voor het wijzigen van deze opstelling om tegelijkertijd TIRF- en IRM-beelden vast te leggen op een enkele camerachip. Dit omvat de toevoeging van een goedkope bundelsplitser in het excitatiepad om het monster tegelijkertijd te verlichten met een TIRF-laser en een IRM LED-lichtbron. Een gemodificeerde commerciële beeldsplitter wordt gebruikt om de TIRF- en IRM-signalen spectraal te scheiden en te projecteren op afzonderlijke helften van dezelfde camerachip. We maken ook gebruik van een microfluïdisch systeem dat de snelle uitwisseling van reagentia tijdens beeldvorming mogelijk maakt. Dit protocol beschrijft hoe deze opstelling kan worden gebruikt om dynamische microtubuli en MAPs in beeld te brengen. Het vermogen van het apparaat wordt gedemonstreerd door de eerste visualisatie van kinesine-1-eiwitten te presenteren die op krimpende microtubuli lopen, die wordt vastgelegd met een framesnelheid van 10 s-1.

<table><tbody><tr><td>10/90 (R/T) beam splitter</td><td>Thorlabs</td><td>BSN10R</td><td>Vlak gesplitste straalsplitter gebruikt in het excitatiestraalpad</td></tr><tr><td>90/10 (R/T) beam splitter</td><td>Thorlabs</td><td>BSX10R</td><td>Vlak gesplitste straalsplitter gebruikt in de beeldsplitter</td></tr><tr><td>Anti-biotine antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3640</td><td>Wordt gebruikt om het oppervlak te functioneren voor het binden van biotinyleren microtubuli</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FLAAS</td><td>Wordt gebruikt voor het bereiden van de motiliteitsbuffer</td></tr><tr><td>Band-pass filter</td><td>Newport</td><td>HPM535-50</td><td>Hard-coated band-pasfilter wordt gebruikt in de beeldsplitter om het GFP-signaal te beeld</td></tr><tr><td>Biotinyleren tubuline</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333P-A</td><td>Wordt gebruikt om microtubuli-zaden aan het oppervlak van het stromingskanaal te binden</td></tr><tr><td>Caseïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8654</td><td>Caseïne wordt gebruikt om niet-specifieke interacties te blokkeren</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td>Wordt gebruikt voor het bereiden van de zuurstofverwijderingsoplossing</td></tr><tr><td>Desiccator kamer</td><td>Southern Labware</td><td>55207</td><td>Desiccator wordt gebruikt om de hars te ontgassen</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>Wordt gebruikt voor het bereiden van de zuurstofverwijderingsoplossing</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Wordt gebruikt voor het bereiden van de BRB80-buffer</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>Wordt gebruikt voor het bereiden van de zuurstofverwijderingsoplossing</td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7016</td><td>Wordt gebruikt voor het bereiden van de zuurstofverwijderingsoplossing</td></tr><tr><td>GMPCPP nucleotiden</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td>Wordt gebruikt voor de polymerisatie van gestabiliseerde microtubuli</td></tr><tr><td>Beeldsplitter</td><td>Teledyne-Photometrics Imaging</td><td>OptoSplit II</td><td>Een beeldsplitter wordt gebruikt om de beelden ruimtelijk te splitsen. Zorg er bij het kopen voor dat het compatibel is met de microscoop</td></tr><tr><td>ImajeJ2</td><td>NIH</td><td></td><td>ImageJ2 wordt gebruikt voor beeldanalyse</td></tr><tr><td>Kinesine</td><td></td><td></td><td>bereid in huis (zie verwijzingen in tekst)</td></tr><tr><td>LDPE-buis</td><td>Thomas Scientific</td><td>9565S22</td><td>Niet-toxisch, polyethyleen met lagere dichtheid met microboring wordt gebruikt voor vloeistofoverdracht</td></tr><tr><td>LED-lichtbron</td><td>Lumencor</td><td>Lumencor sola-lichtmotor</td><td>Wordt gebruikt voor IRM-beeldvorming</td></tr><tr><td>Long-pass filters</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0600</td><td>Hard-coated long pass-filters. Een wordt gebruikt als excitatiefilter, de andere wordt gebruikt in de beeldsplitter om het IRM-signaal te beeld</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td>Wordt gebruikt voor het bereiden van de BRB80-buffer</td></tr><tr><td>Microscoop objectiefverwarming</td><td>okolab</td><td>H401-T-DUAL-BL</td><td>Wordt gebruikt om de monsterstemperatuur constant te houden door het objectief te verwarmen</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td>Een omgekeerde microscoop die wordt gebruikt in de experimenten</td></tr><tr><td>Na-PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2949</td><td>Wordt gebruikt voor het bereiden van de BRB80-buffer</td></tr><tr><td>Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Olie objectief</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>Het beeldvormende objectief heeft 1.49 numerieke apertuur</td></tr><tr><td>PDMS en uithardingsmiddel</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Sylgard 184 (24236-10)</td><td>Wordt gebruikt voor het construeren van de stromingskanalen</td></tr><tr><td>PDMS-ponser</td><td>World Precision Instruments LLC</td><td>504529</td><td>Wordt gebruikt om een gat in de PDMS te ponsen</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>DPC-32G</td><td>De luchtplasma wordt gebruikt om organische verontreiniging van het PDMS-oppervlak te verwijderen</td></tr><tr><td>Poloxamer 407 (commerciële naam Pluronic F-127)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2443</td><td>Wordt gebruikt voor passivatie van het kanaaloppervlak om niet-specifieke binding te minimaliseren</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td>Wordt gebruikt voor het bereiden van de BRB80-buffer</td></tr><tr><td>Gestabiliseerde microtubuli</td><td></td><td></td><td>bereid in huis (zie verwijzingen in tekst)</td></tr><tr><td>Tabel-ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>340400</td><td>Wordt gebruikt om microtubuli-zaden te laten ronddraaien</td></tr><tr><td>TetraSpeck-kralen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T7279</td><td>Wordt gebruikt als referentie voor het uitlijnen van beelden</td></tr><tr><td>Zyla 4.2 camera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2</td><td>Wetenschappelijke CMOS-camera met specificaties: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixelgrootte) met een kwantumefficiëntie van 72% en een dynamisch bereik van 16 bit</td></tr></tbody></table>

gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Verschillende technieken zijn gebruikt voor de directe visualisatie van cytoskeletale filamenten en de bijbehorende eiwitten. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopie heeft een hoge signaal-achtergrondverhouding, maar lijdt aan fotobleaching en fotoschade van de fluorescerende eiwitten. Labelvrije technieken zoals interferentiereflectiemicroscopie (IRM) en interferometrische verstrooiingsmicroscopie (iSCAT) omzeilen het probleem van fotobleaching, maar kunnen afzonderlijke moleculen niet gemakkelijk visualiseren. Dit artikel presenteert een protocol voor het combineren van IRM met een commerciële TIRF-microscoop voor de gelijktijdige beeldvorming van microtubule-geassocieerde eiwitten (MAPs) en dynamische microtubuli in vitro. Dit protocol maakt snelle observatie mogelijk van MAPs die interageren met dynamische microtubuli. Dit verbetert bestaande tweekleurige TIRF-opstellingen door zowel de noodzaak van microtubule-etikettering als de noodzaak van verschillende extra optische componenten, zoals een tweede excitatielaser, te elimineren. Beide kanalen worden op dezelfde camerachip weergegeven om problemen met beeldregistratie en framesynchronisatie te voorkomen. Deze opstelling wordt gedemonstreerd door het visualiseren van enkele kinesinemoleculen die op dynamische microtubuli lopen.

De optische opstelling is geschematiseerd in figuur 1. Zowel IRM-verlichting als TIRF-excitatielicht worden via een 10/90 (R/T) bundelsplitter (BS1) op de achteropening van het objectief (100x, NA: 1,49) gericht. Het uitgezonden signaal gaat door dezelfde bundelsplitser (BS1) en wordt via een spiegel (M1) naar de beeldsplitser gereflecteerd. De componenten van de beeldsplitser (ingesloten met stippellijnen in figuur 1) scheiden de IRM- en TIRF-signalen via een 90/10 (R/T) bundelsplitser (BS2) samen met geschikte spectrale filters. Ten slotte worden de gesplitste beelden op de camerachip geprojecteerd voor visualisatie. De uitlijning van de beeldsplitser is zodanig dat de TIRF- en IRM-signalen op afzonderlijke helften van de chip worden geprojecteerd.
In een goed uitgelijnde microscoop moet het camerabeeld een half gesplitst beeld weergeven, zoals weergegeven in figuur 2. Oppervlaktegebonden microtubuli moeten gemakkelijk zichtbaar zijn in het IRM-kanaal13 en fluorescerende kinesine moet zichtbaar zijn in het TIRF-kanaal.
De microbeads die worden gebruikt om de twee kanalen uit te lijnen en te registreren, verschijnen als heldere vlekken in de TIRF-afbeeldingen en donkere vlekken in de IRM-afbeeldingen. Hoewel de kralen zichtbaar zijn in de onbewerkte gegevens, verbetert achtergrondaftrekken het contrast aanzienlijk (figuur 2). De achtergrondafbeelding die voor de aftrekking wordt gebruikt, is de temporele mediaan van een video die is opgenomen met een bewegende fase. Zoals beschreven in het protocol, werd de uitlijning van afbeeldingen uitgevoerd door een verzameling kralen in de buurt van het gewenste gebied te selecteren en de meegeleverde macro uit te voeren (imageSplitterRegistration.ijm). De macro past de punten aan op Galliërs en lijnt de afbeeldingen uit door de gemiddelde afstand tussen de middelpunten van de passen in elk kanaal te minimaliseren. Dit proces is weergegeven in figuur 2, die een goede uitlijning van de fluorescerende microbeads laat zien (groen in het TIRF-kanaal, zwart in het IRM-kanaal).
Ten slotte worden de mogelijkheden van deze gelijktijdige beeldvormingsopstelling gedemonstreerd door enkele kinesinemoleculen te observeren die naar de krimpende uiteinden van microtubuli lopen. Figuur 3 toont een kymograaf van eGFP-gelabelde kinesinemoleculen (groen) die op een krimpende microtubuli (grijs) lopen. Ook wordt een reeks snapshots gepresenteerd van de opname waaruit de kymograaf is gegenereerd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van de optische opstelling voor gelijktijdige IRM- en TIRF-beeldvorming van kinesinemotiliteit. Epiilluminatie van een LED-lichtbron gaat door het diafragmamembraan en bereikt de 10/90 (R/ T) beam splitter (BS1). De bundelsplitser reflecteert gedeeltelijk het rode IRM-verlichtingslicht en het 488 nm TIRF-excitatielicht tot aan het objectief om het monster te verlichten. Het signaal van het monster wordt door hetzelfde doel verzameld en naar de beeldsplitsingsassemblage geleid, waar IRM- en TIRF-beelden ruimtelijk worden gescheiden door de 90/10 (R/ T) bundelsplitser (BS2). De signalen worden vervolgens spectraal gefilterd voordat ze de camerachip bereiken. Afkortingen: IRM = interferentie reflectie microscopie; TIRF = totaal-interne-reflectie-fluorescentie; LED = lichtgevende diode; ITIRF = TIRF-verlichting; IGFP = GFP fluorescentie; Iinc = IRM verlichting; Iref = verstrooid licht op het glas/water grensvlak; Iscat = verstrooid licht van de microtubuli; IIRM = IRM signaal (Interferentie van Iref en Iscat); R/T = gereflecteerd/uitgezonden; LP600: langdoorlaatfilter (600 nm); DM = dichroïsche spiegel; BS1 en BS2 = bundelsplitsers 1 en 2; M1, M2, M3, M4 = spiegels; BP535/50 = bandpas (535/50 nm); GFP = groen fluorescerend eiwit; GMPCPP = guanylyl 5'-α,β-methyleendifosfonaat; BBP = guanosinedifosfaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig02.jpg"> Figuur 2: Achtergrondaftrekken en afbeeldingsuitlijning. De TIRF-beelden (linkerhelft) en IRM-beelden (rechterhelft) verschijnen tegelijkertijd op twee helften van dezelfde camerachip (camerabeeld). Temporele mediane achtergrondaftrekking verhoogt het contrast van de kralen (afbeelding met afgetrokken achtergrond), die donker lijken in IRM en helder in TIRF-afbeeldingen. IRM- en TIRF-afbeeldingen worden uitgelijnd door vertaling (rechts) op basis van de lokalisatie van geselecteerde kralen (witte rechthoeken). Schaalbalken = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig03.jpg"> Figuur 3: Kymograaf en snapshots van Kinesins' beweging tijdens microtubule krimp. De kymograaf (links) toont eGFP-kinesine-1 (groen) lopend naar het pluseinde van de microtubuli (donkergrijs). Snapshots uit de bijbehorende tijdreeks worden getoond (rechts). Witte pijlen tonen enkele kinesine-1-moleculen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
ImageSplitterRegistratiebestand: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/ImageSplitterRegistration.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Het belang van deze methode is dat het labelvrije microtubuli tegelijkertijd met fluorescerend gelabelde eiwitten met hoge framesnelheden mogelijk maakt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoudige implementatie en minimale eisen aan optische componenten. Het omzeilt ook de noodzaak van fluoro-4-etikettering van microtubuli.Bereid om te beginnen het PDMS-polymeer voor door het uithardingsmiddel en het basiselastomeer in een massaverhouding van 1:10 te combineren. Meng ze twee minuten en ontgas het mengsel vervolgens in een vacuümkamer totdat alle bubbels verdwijnen. Giet het mengsel daarna op de hoofdvorm in een laag van ongeveer 0,5 centimeter dik, zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan en bak het mengsel gedurende 40 minuten in een voorverwarmde oven op 70 graden Celsius.Snijd vervolgens de gestructureerde gebieden van het polymeer uit en pons gaten aan elk uiteinde van het kanaal met behulp van een PDMS-ponser. Reinig later de gestructureerde kant van het PDMS-blok. Spoel vervolgens driemaal met isopropanol en methanol gevolgd door ultrapuur water en föhn het oppervlak.Vervolgens reinigt plasma het PDMS met zuurstof- of luchtplasma en plaatst het plasmagezuiverde PDMS op een goed gereinigd afdekglas. Verwarm het op een hete plaat op 80 graden Celsius gedurende 15 minuten. Steek polyethyleenbuizen van de juiste grootte in de gaten en sluit de uitlaatslang aan op een spuit van 0,5 milliliter.Laat de oplossingen vervolgens in de microkanalen stromen door de inlaatbuis in de oplossing onder te dompelen en het vereiste volume met de spuit te trekken. Plaats het monster op het microscooppodium en schakel de epi-verlichtingslichtbron in voor IRM-beeldvorming. Als u de microscoop wilt scherpstellen, zoekt u naar het juiste brandpuntsvlak in de buurt van de PDMS-oplossingsinterface en kiest u een gezichtsveld in de buurt van het midden van het kanaal.Bereid vervolgens een 0,1-micromolaire oplossing van fluorescerende microbeads in BRB80 en stroom in ten minste één kanaalvolume van de microbead-oplossing. Monitor de reactie via IRM of TIRF. Wanneer de gewenste dichtheid van microbeads is bereikt, spoelt u het teveel uit met BRB80.Laat verdunde zaden in de reactiekamer stromen en controleer de reactie via IRM. Wanneer de gewenste dichtheid van zaden is bereikt, spoelt u het teveel uit met BRB80. Bereid vervolgens een microtubule-uitbreidingsmengsel met 12-micromolair ongelabeld tubuline, één-millimolair GTP, vijf-millimolar DTT in BRB80-buffer.Stroom vervolgens ten minste één kanaalvolume van het uitbreidingsmengsel in en zorg ervoor dat de reactietemperatuur 28 graden Celsius is. Stel om te beginnen de beeldinstellingen in op de microscoopsoftware. Start de beeldvorming en laat de kinesine-oplossing in de kamer stromen.Visualiseer vervolgens de GFP gelabelde kinesine 1 onshrinking microtubuli. Nadat de meting is voltooid, neemt u een korte video op waarin het podium langzaam wordt vertaald in een cirkelvormige of laterale beweging. De mediane projectie van deze video zal dienen als achtergrondafbeelding en zal worden afgetrokken van de onbewerkte metingen.Maak een mediane projectie in ImageJ van de achtergrondopname door op Afbeelding te klikken. Selecteer vervolgens de optie Stapels en klik op Z Project. Trek vervolgens de mediane achtergrondprojectie af van de onbewerkte afbeeldingsgegevens door op Verwerken te klikken en selecteer vervolgens de optie Beeldcalculator terwijl u ervoor zorgt dat u de 32-bits floatresultaatoptie aanvinkt.Kies voor beeldregistratie een verzameling microbeads in de buurt van de microtubule van belang en gebruik ze om de TIRF- en IRM-afbeeldingen uit te lijnen. Gebruik voor elke kraal in deze verzameling het meerpuntsselectiegereedschap om de geschatte locatie in het TIRF-kanaal en vervolgens de overeenkomstige locatie in het IRM-kanaal te markeren. Voer vervolgens de meegeleverde ImageJ-macro uit.Microbeads verschijnen als donkere vlekken in het IRM-kanaal aan de rechterkant en als heldere vlekken in het TIRF-kanaal aan de linkerkant. De uitlijningsprocedure legt de twee kanalen op de juiste manier over elkaar door een selectie kralen te lokaliseren. Een kymograaf van EGFP-gelabelde kinesinemoleculen die naar de krimpende uiteinden van microtubuli lopen, werd ook verkregen met behulp van dit protocol.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om hoge numerieke diafragmadoelstellingen te kiezen om totale interne reflectie te bereiken en ook om de verzamelefficiëntie en het beeldcontrast te maximaliseren. Deze methode kan worden gebruikt voor hoge resolutie beeldvorming van enkele fluorescerende moleculen tegelijkertijd binnen de macromoleculaire structuur die massief genoeg is om te worden gevisualiseerd door IRM, zoals celmembraan of actinefilament. Dit protocol biedt ook een eenvoudig aanpasbare procedure voor gelijktijdige beeldvorming met elke combinatie van IRM, TIRF en epifluorescentie.

simultaneous-interference-reflection-total-internal-reflection

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie is een krachtige aanpak van de structuren te observeren in de buurt van het celoppervlak bij hoge contrast en temporele resolutie. We laten zien hoe TIRF kan worden gebruikt om eiwitten dynamiek te studeren aan de cortex van de celwand-ingesloten bacteriën en schimmels cellen.

Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

This video describes TIRF, a total internal reflection microscopy-based technique to visualize actin and microtubule polymerization dynamics. The method allows the high-resolution imaging of actin and microtubule coupling dynamics in real-time, which is essential for understanding cellular crosstalks.

TIRF Microscopy to Visualize Actin and Microtubule Coupling Dynamics

In this video, we describe the interference reflection microscopy (IRM) technique to visualize microtubules growing on a coverslip surface in the presence of a suitable buffer. Upon illumination with incident light, the coverslip-buffer interface and buffer-microtubule interface reflect light, which combines to create an interference pattern, enabling the visualization of microtubules as high-contrast images against a bright background.

Interference Reflection Microscopy for Label-Free Visualization of Microtubule Dynamics

Source: Winkle, C. C., et al. Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for visualizing exocytic events in cortical neurons. A pH-sensitive green fluorescent protein (GFP) marker fluoresces upon vesicle fusion, with selective TIRF excitation capturing membrane-proximal exocytosis in time-lapse imaging.

Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Visualization of Exocytic Events 

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Dit protocol is een leidraad voor het implementeren van interferentie reflectie microscopie op een standaard fluorescentiemicroscoop voor etiket-vrije, hoog-contrast, High-Speed beeldvorming van microtubuli met behulp van in vitro oppervlakken assays.

Implementatie van interferentie reflectie microscopie voor etiket vrije, High-Speed beeldvorming van microtubuli

Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.

Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

Hier presenteren we een protocol voor het reconstitueren van microtubulibundels in vitro en het direct kwantificeren van de krachten die erin worden uitgeoefend met behulp van gelijktijdige optische vangmethoden en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Deze test maakt het mogelijk om op nanoschaal de krachten en verplaatsingen te meten die worden gegenereerd door eiwitensembles binnen actieve microtubulinetwerken.

Direct meten van krachten binnen gereconstitueerde actieve microtubulibundels

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Leer gelijktijdige interferentiereflectie- en TIRF-microscopie voor dynamische microtubuli en fluorescerende eiwitten. Deze methode biedt labelvrije beeldvorming met hoge framerates voor celbiologisch onderzoek.

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten (Video) | JoVE Journal

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Meer video's verkennen