Intravitale widefield fluorescentiemicroscopie van pulmonale microcirculatie bij experimenteel acuut longletsel met behulp van een vacuümgestabiliseerd beeldvormingssysteem

Dit protocol beschrijft in detail de chirurgische voorbereiding en het gebruik van een vacuümgestabiliseerd systeem om pulmonale leukocytenadhesie en capillaire perfusie in vivo in beeld te brengen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het stabiele intravitale beeldvorming met hoge resolutie van de intacte spiegelende long mogelijk maakt met minimaal fysiek trauma. Bereid om te beginnen het beeldvormingsvenster voor door een dunne laag vacuümvet aan de bovenkant van de buitenste ring toe te dienen en tegelijkertijd verontreiniging van het vacuümkanaal te voorkomen.

Plaats een schone 8-millimeter glazen afdekplaat op het raam en druk zachtjes naar beneden om een afdichting te creëren. Sluit het beeldvenster aan op een vacuümpomp die is uitgerust met een digitale manometer en die 50 tot 60 millimeter kwikconstante zuigkracht kan leveren. Laat een lengte glasvezelkabel door een 20-gauge endotracheale canule gaan en dompel de punt onder in lidocaïne HCL.

Breng na anesthesie een gemodificeerde otoscoop in, zodat de bovenste snijtanden binnen de opening in het speculum passen. Pas de scope en tongpositie aan totdat de epiglottis en de stembanden duidelijk zichtbaar zijn. Steek de glasvezelkabel door de opening in het speculum en gebruik kleine cirkelvormige bewegingen om de kabel tussen de stembanden te passeren, gebruik vervolgens de glasvezelkabel als gids en schuif de canule voorzichtig in de luchtpijp om de muis te intuberen.

Na het starten van de ventilatie met 1,5% isofluraan, bevestigt u de diepte van de anesthesie door te testen op pedaalreflex. Bevestig de canule aan de snuit met medische tape. Gebruik labeling tape om de rechter voorpoot op de positie van negen uur aan het verwarmingskussen te bevestigen en de linker achterpoot caudaal uit te strekken en vast te zetten op de zes uur positie.

Span met behulp van een doektape de linker voorpoot lichtjes uit tot de positie van 12 uur en bevestig het andere uiteinde van de tape aan de bovenkant van het intravitale microscopieplatform en breng vervolgens een rectale temperatuursonde en pootpulsoximeter aan om de vitale functies tijdens het experiment te bewaken. Om de muis voor te bereiden op een operatie, steriliseert u de thorax en de buik met een 70% alcoholdoekje en brengt u een lichte laag minerale olie aan om het haar aan de linkerkant van de muis te bevochtigen. Maak een kleine incisie aan de onderkant van de ribbenkast om de onderliggende spierlaag bloot te leggen, verleng vervolgens de initiële incisie en gebruik stompe dissectie om de ribbenkast bloot te leggen.

Pak met behulp van een hemostatische tang het ontleedde epitheel- en vetweefsel vast en plaats het operatiegebied vrij. Om leukocyten en bloedstroom fluorescerend te labelen, dient u een bolus van 2,5 milliliter per kilogram Rhodamine 6G en FITC-albumine toe via de staartader. Gebruik een getande tang om de rib onmiddellijk inferieur te maken aan de positie van de basis van de long aan het einde van de inspiratie.

Trek de tang iets terug om de rib weg te trekken van de long en snijd vervolgens de rib door om een pneumothorax te induceren. Verleng de incisie zijdelings in beide richtingen en zorg ervoor dat u de long niet aanraakt. Pak de op een na hoogste rib vast met een stompe tang en trek je iets terug om de long van de borstwand af te laten vallen.

Als de long niet loslaat, druk de borstwand dan lichtjes tegen de long om ervoor te zorgen dat de long zich hecht aan het onderliggende borstvlies en dus gemakkelijker wegvalt. Ga door met de oorspronkelijke incisie uiteindelijk tot het borstbeen en craniaal totdat de top van de long wordt blootgesteld. Gebruik katoenen applicators en gaas om eventuele bloedingen te verzachten.

Verhoog de ribbenkast om de intercostale bloedvaten op het dorsale aspect van de thoracale holte bloot te leggen, zorg ervoor dat de long niet wordt beschadigd, dichtschroei het meest inferieure intercostale vat in de buurt van de wervelkolom en snijd vervolgens de aangrenzende rib door. Craniaal bewegen en uiteindelijk een herhaald patroon van cauterisatie en snijden gebruiken om een deel van ongeveer één bij twee centimeter van de ribbenkast te snijden. Om u voor te bereiden op beeldvorming, brengt u het intravitale microscopieplatform over naar het microscoopstadium en plaatst u het beeldvormingsvenster direct boven de blootgestelde long.

Gebruik de micromanipulator om het beeldvormingsvenster voorzichtig te laten zakken totdat het zich hecht aan het longoppervlak en het stabiliseert. Om de pulmonale microcirculatie te visualiseren, gebruikt u een breedveldfluorescentiemicroscoop uitgerust met een 20x objectief en standaard FITC- en Rhodamine-filtersets. Gebruik een zwart-wit CCD-camera om de video's met optimaal contrast op te nemen.

Identificeer met behulp van de FITC-filterset een pulmonale locatie op basis van het convergente patroon van de bloedstroom en neem een video van 30 seconden op met de locatie in focus, herhaal vervolgens de opname in hetzelfde gezichtsveld met behulp van de Rhodamine-filterset om leukocyten te visualiseren. Om een pulmonale arteriele te lokaliseren, gebruikt u de FITC-filterset om een vat met een divergent patroon van de bloedstroom te identificeren en een video van 30 seconden op te nemen. Herhaal de opname in hetzelfde gezichtsveld met behulp van de Rhodamine-filterset om leukocyten te visualiseren.

Om de interessante capillaire gebieden te lokaliseren, gebruikt u de FITC-filterset om een gebied van longblaasjes en haarvaten te identificeren dat niet door grotere vaten wordt doorsneden en neemt u een video van 30 seconden op. Herhaal de opname in hetzelfde gezichtsveld met behulp van de Rhodamine-filterset om leukocyten te visualiseren. Deze video toont FITC-beeldvorming van de bloedstroom binnen een pulmonale locatie zoals aangegeven door de groene pijl.

Rhodamine beeldvorming maakt visualisatie van leukocyten op dezelfde locatie mogelijk met twee adherente leukocyten aangegeven door de rode pijlen. Deze methoden werden ook toegepast om dezelfde verschijnselen en pulmonale arteriëlen en capillaire regio's van belang te visualiseren. Om de kwantificering van microcirculatieparameters aan te tonen, werden muizen behandeld met intranasale LPS om longontsteking te induceren.

Leukocytenhandel in pulmonale locaties wordt hier getoond met geschetste gebieden die de geanalyseerde endotheelgebieden vertegenwoordigen bij naïeve en met LPS behandelde muizen. Leukocytenadhesie en rollen waren verhoogd bij met LPS behandelde muizen. Leukocytenhandel in pulmonale arterialen wordt hier getoond met geschetste gebieden die de geanalyseerde endotheelgebieden vertegenwoordigen bij naïeve en met LPS behandelde muizen.

De adhesie van leukocyten was hoger bij met LPS behandelde muizen. Deze figuur toont de adhesie van leukocyten in pulmonale haarvaten bij naïeve en met LPS behandelde muizen. De adhesie van leukocyten bleek hoger te zijn bij met LPS behandelde muizen versus naïeve.

Deze figuur toont perfusie van pulmonale haarvaten bij naïeve en met LPS behandelde muizen. Functionele capillaire dichtheid bleek lager te zijn bij met LPS behandelde muizen versus naïef. Er zijn veel uitdagende aspecten van dit protocol.

Het optimaliseren van de positionering van de muis op het platform is een eenvoudige stap die de chirurgische en beeldvormende stappen veel reproduceerbaarder kan maken. Deze procedure is aanpasbaar aan een breed scala aan studieparameters en microscopiebenaderingen. Daarom moet het verder onderzoek naar pulmonale microcirculatie in zowel gezonde als zieke toestanden vergemakkelijken.