Een spin-tipverrijkingsstrategie voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels

De dual-functionele Titanium geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie strategie kan zowel N-glycopeptiden als fosfopeptiden in dezelfde workflow verrijken, waardoor biomoleculaire informatie uit dezelfde analyse toeneemt. Het belangrijkste voordeel van deze verrijking is twee scheidingsmechanismen, die de gelijktijdige scheiding van N-glycopeptiden en fosfopeptiden in afzonderlijke fracties mogelijk maken voor downstream massaspectrometrie-analyse. Het gebruik van deze verrijkingsmethode kan de detectie van glycosylering en fosforylering in complexe biologische monsters zoals pancreasweefsels verbeteren in de richting van de ontdekking van ziektebiomarkers zoals bij diabetes en kanker.

Omdat deze methode afhankelijk is van spintips en centrifugatie, is het belangrijk om de centrifugatiesnelheid te regelen en ervoor te zorgen dat monsters vrij zijn van deeltjes om verstopping te voorkomen. Om te beginnen, koel de delen van de weefselverpulverizer die in contact komen met de pancreasweefsels, namelijk de kamer, verpulverer en herstellepel, samen met eventuele spatels, vooraf af in een polystyreencontainer. Breng vervolgens weefselstukken over in de voorgekoelde monsterhouder en voeg een vloeibare stikstof toe aan het weefsel totdat ze zijn bevroren.

Nadat u de vergruizer in de kamer hebt geplaatst, slaat u deze vijf tot tien keer met een hamer om het monster te verpletteren, verwijder vervolgens de vergruizer uit de kamer en schraapt u het aanhangende weefselpoeder en de stukken af. Voeg vervolgens een lepel vloeibare stikstof toe aan de kamer als weefsels beginnen te smelten en herhaal het verpulveringsproces totdat een fijn poeder is verkregen en deel de monsters in ongeveer 100 milligram aliquots in voorgekoelde buizen. Los na het bereiden van de lysisbuffer één tablet elk van protease en fosfataseremmer op in 500 microliter water, voor een voorraad van 20 keer de gewenste eindconcentratie, en voeg het vereiste volume voorraad van elke remmer toe aan de lysisbuffer om de uiteindelijke remmerconcentraties te bereiken.

Na het toevoegen van 600 microliter lysisbuffer aan de buis, incubeer je bij 95 graden Celsius in het verwarmingsblok gedurende 10 minuten met schudden bij 800 RPM, verwijder dan de monsters uit het verwarmingsblok en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Soniceer vervolgens de monsters op 60 Watt energie gedurende 45 seconden, met behulp van 15 seconden pulsen met een rust van 30 seconden ertussen, en pelleteer de monsters op 3000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Voeg het supernatant toe aan vijf keer het volume precipitatieoplosmiddel.

Bijvoorbeeld, 300 microliter lysisbuffer tot 1,5 milliliter precipitatie-oplosmiddel met 50% aceton, 49,9% ethanol en 0,1% azijnzuur, en koel dan 's nachts af bij 80 graden Celsius. Pelleteer de monsters opnieuw op 3000 maal G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant, was de pellet vervolgens door te breken met een spatel en meng met dezelfde hoeveelheid precipitatie-oplosmiddel. Na het centrifugeren droogt u de monsterpellet gedurende 15 minuten aan de lucht in een zuurkast en bewaart u deze bij 80 graden Celsius totdat u klaar bent om verder te gaan.

Suspensie eerst de eiwitpellet opnieuw in 300 microliter vers gemaakte digestiebuffer met 50 millimolar triethylammoniumbicarbonaatbuffer en acht molaire ureum. Voeg aan het eiwit in oplossing dithiothreitol toe aan een uiteindelijke concentratie van vijf millimolar, meng en verlaag bij kamertemperatuur gedurende een uur en voeg vervolgens jodoacetamide toe aan een uiteindelijke concentratie van 15 millimolar. Meng en alkylaat op kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker.

Voeg vervolgens Lys-C / Trypsin toe in een verhouding van 1 tot 100 enzym/eiwit en incubeer bij 37 graden Celsius in een incubator gedurende vier uur en voeg vervolgens 50 millimolaire triethylammoniumbicarbonaatbuffer toe om het acht molaire ureum dat wordt gebruikt tot minder dan één kies te verdunnen. Na toevoeging van trypsine in een verhouding van 1 tot 100 enzym/eiwit, incubeer je 's nachts bij 37 graden Celsius in een incubator en doof je vervolgens de spijsvertering met de toevoeging van trifluorazijnzuur. Voor elke milligram starteiwit, conditioneer een ontziltingspatroon met één milliliter acetonitril en driemaal met één milliliter 0,1% trifluorazijnzuur, laad vervolgens het verteerde mengsel op de ontziltingspatroon en was het mengsel driemaal met één milliliter 0,1% trifluorazijnzuur.

Vervolgens eluteer peptiden met behulp van een milliliter van 60% acetonitril en 0,1% mierenzuuroplossing, en droog vervolgens geëlueerde peptiden op ongeveer 35 graden Celsius met behulp van een centrifugale vacuümconcentrator totdat het oplosmiddel volledig is verdampt. Nadat u de peptiden opnieuw in water hebt gesuspendeerd, schat u de peptideconcentraties met behulp van een peptidetest volgens het protocol van de fabrikant, deelt u de peptiden vervolgens in aliquots van 500 microgram en droogt u volledig. Weeg ongeveer drie milligram watten en verpak het in een lege spintip.

Voeg na het overbrengen van één gram titanium geïmmobiliseerd metaalaffiniteitschromatografiemateriaal in een buis toe, 0,1% trifluorazijnzuur aan een bekende concentratie materiaal. Nadat u voldoende drijfmest aan een spinpunt hebt toegevoegd om 20 milligram materiaal over te brengen, wast u de spinpunt door te centrifugeren met 200 microliter 0,1% trifluorazijnzuur. Suspensieer de monsters opnieuw in 200 microliter laad-/wasmiddel en stroom door de spinpunt.

Na het wassen van de spinpunt door centrifugatie met laad- / wasmiddel, wast u de spinpunt met 200 microliter 80% acetonitril 0,1 mierenzuuroplossing, elueert u vervolgens de peptiden met 200 microliter E1 en E2 en analyseert u elke elutie afzonderlijk. Herhaal het elutieproces met behulp van E3- en E4-oplosmiddelen en combineer de juiste elutiefracties vóór de downstreamanalyse. Voordat u de eluties bij een basis-pH uitvoert, conditioneert u het materiaal driemaal met behulp van 200 microliter 90% acetonitril in 2,5% ammoniumhydroxide, elueert u de peptiden vervolgens met 200 microliter E5- en E6-oplosmiddelen en analyseert u deze eloplossingen afzonderlijk na ontzouting met behulp van een verpakte punt.

Eluuteer vervolgens de peptiden met 200 microliter verschillende concentraties acetonitril en ammoniumhydroxide. Combineer daarna deze eloplossingen en analyseer als één monster, E7, na ontzouting met behulp van een verpakte punt. Geannoteerde high-confidence MS/MS-spectra van N-geglycosyleerde en gefosforyleerde peptiden werden verkregen met een rijke fragmentatie van precursoren, waardoor het vertrouwen in de identificatie toenam, zoals toegewezen door de database-zoeksoftware.

Peptide-identificaties werden gevonden uit monsters verrijkt met behulp van de dual-functionele Titanium geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie spintipmethode over elke elutiedractie. De meerderheid van glycopeptiden elueren in de eerste vier fracties, terwijl de meerderheid van fosfopeptiden elueren in de laatste drie fracties, waardoor potentiële interferenties in ionisatie worden verminderd. De glycoproteomics-resultaten van de dual titanium-methode werden vergeleken met een Ehrlich-glycopeptide-only verrijking, wat aantoont dat verhoudingen van elk type glycan na binning in zes categorieën op basis van hun samenstellingen, vergelijkbaar zijn tussen beide methoden.

Fosfoproteomics resultaten van de dual titanium methode werden vergeleken met een conventionele geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie fosfopeptide-only verrijking of met behulp van beide methoden. De meerderheid van de gefosforyleerde aminozuren werden geïdentificeerd als serine en threonine, met ongeveer 1% gefosforyleerde tyrosine. Het goed construeren van de spinpunt is belangrijk om een soepele elutie te garanderen.

Steek het katoen stevig in de punt, zodat het verrijkingsmateriaal bovenop het katoen kan worden verpakt. We hebben de dual-functionele titanium IMAC-methode gebruikt voor gelijktijdige karakterisering van glycosylering en fosforylering in de meeste weefsels en het SARS-CoV-2 spike-eiwit.