Name: Een spin-tipverrijkingsstrategie voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer een dual-functionele titanium IMAC-methode voor gelijktijdige verrijking van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijk pancreasweefsel. Deze spin-tipstrategie verbetert detectie van post-translatiemodificaties voor biomarkeronderzoek naar diabetes en kanker.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door subsidiefinanciering van de NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 en R21AG065728) en Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B en SRA-2016-168-S-B). De hier gepresenteerde gegevens werden ook gedeeltelijk verkregen door steun van een NIH / NCATS UL1TR002373-prijs via het University of Wisconsin Institute for Clinical and Translational Research. De Orbitrap-instrumenten werden gekocht met de steun van een NIH shared instrument grant (NIH-NCRR S10RR029531) en office of the Vice Chancellor for Research and Graduate Education aan de University of Wisconsin-Madison. We willen ook de genereuze steun erkennen van de Orgaan- en Weefseldonatieorganisatie van de Universiteit van Wisconsin die de menselijke alvleesklier voor onderzoek heeft geleverd en de hulp van Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett en Prof. Jon Odorico voor het verstrekken van de monsters aan ons laboratorium. Ons onderzoeksteam wil in het bijzonder de families bedanken die weefsels hebben gedoneerd voor deze studie. L.L. erkent NIH-subsidie S10OD025084, een Pancreas Cancer Pilot-beurs van het Carbone Cancer Center van de Universiteit van Wisconsin (233-AAI9632), evenals een Vilas Distinguished Achievement Professorship en het Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship met financiering door de Wisconsin Alumni Research Foundation en de University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Toestemming werd verkregen voor het gebruik van pancreasweefsels voor onderzoek van de nabestaanden van de overledene en een toestemming van de University of Wisconsin-Madison Health Sciences Institutional Review Board werd verkregen. IRB-toezicht is niet vereist omdat het geen menselijke proefpersonen betreft zoals erkend door 45 CFR 46.102 (f).
LET OP: Voorzichtigheid is geboden bij het hanteren van de reagentia die in dit protocol worden gebruikt, waaronder zuren (mierenzuur, azijnzuur, trifluorazijnzuur), basen (ammoniumhydroxide) en cryogenen (vloeibare stikstof). Lees de veiligheidsinformatiebladen voor de gebruikte reagentia om vertrouwd te raken met de bijbehorende gevaren en de benodigde voorzorgsmaatregelen. Concentraties die worden aangeduid met percentages zijn volume/totaal volume (v/v) en worden verdund met water.
1. Cryoverpulvering, lysis en eiwitextractie van weefsel
<ol><li>Vul een dewar met vloeibare stikstof. Koel de delen van de weefselverpulverizer die in contact komen met de pancreasweefsels, namelijk de kamer, verpulverizer en herstellepel vooraf in een polystyreencontainer.</li>
	<li>Breng de bevroren stukjes weefsel over in de voorgekoelde monsterhouder en voeg een lepel vloeibare stikstof toe aan het weefsel.</li>
	<li>Plaats de vergruizer in de kamer en sla er vijf tot tien keer met een hamer op om het monster te verpletteren. Verwijder de verpulverizer uit de kamer en schraap het aanhangende weefselpoeder en de stukjes eraf.</li>
	<li>Voeg een lepel vloeibare stikstof toe aan de kamer als weefsels beginnen te smelten. Herhaal het verpulveringsproces totdat het monster een fijn poeder is zonder grote weefselbrokken. Verdeel de monsters in ongeveer 100 mg aliquots in voorgekoelde buizen.</li>
	<li>Bereid lysisbuffer met 4% natriumdodecylsulfaat (SDS), 150 mM NaCl en 25 mM Tris (pH = 7,4). Los één tablet protease- en fosfataseremmer op in 500 μL water voor een voorraad van 20x van elk. Voeg het vereiste volume van 20x voorraad van elke remmer toe aan de lysisbuffer voor een uiteindelijke concentratie van 1x.</li>
	<li>Voeg 600 μL lysisbuffer per 100 mg weefsel toe aan de buis en incubeer bij 95 °C in een verwarmingsblok gedurende 10 minuten met schudden bij 800 tpm. Haal de monsters uit het verwarmingsblok en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Soniceer de monsters met 60 W energie (20 kHz) gedurende 45 s met behulp van 15 s pulsen met een rust van 30 s ertussen. Pelleteer de monsters bij 3.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Voeg het supernatant toe aan een 5x precipitatieoplosmiddel, 300 μL lysisbuffer tot 1,5 ml precipitatieoplosmiddel, dat 50% aceton, 49,9% ethanol en 0,1% azijnzuur bevat. Koel 's nachts bij -20 °C.</li>
	<li>Pelleteer de monsters opnieuw op 3.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Was de pellet door te breken met een spatel en te mengen met dezelfde hoeveelheid precipitatie-oplosmiddel. Pellet nogmaals, de wasstap 2x herhalen.</li>
	<li>Pelleteer het monster bij 16.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Droog de monsterpellet gedurende 15 minuten aan de lucht in een zuurkast en bewaar bij -80 °C totdat het klaar is om verder te gaan.</li>
</ol>2. Eiwitvertering en ontzouting
<ol><li>Resuspendeer de eiwitpellet in 300 μL vers gemaakte digestiebuffer met 50 mM triethylammoniumbicarbonaat (TEAB) en 8 M ureum.</li>
	<li>Schat de eiwitconcentratie van de oplossing met behulp van een eiwittest volgens het protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Voeg aan het eiwit in de oplossing dithiothreitol (DTT) toe tot een uiteindelijke concentratie van 5 mM, meng en verlaag bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Voeg vervolgens jodoacetamide (IAZ) toe aan een eindconcentratie van 15 mM, meng en alkylaat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker. Doof alkylering door de toevoeging van DTT in hetzelfde volume als voorheen te herhalen en meng.</li>
	<li>Voeg LysC/trypsine toe in een verhouding tussen 1:100 enzym en eiwit en incubeer bij 37 °C gedurende 4 uur. Voeg vervolgens 50 mM TEAB toe om het ureum van 8 M te verdunnen dat wordt gebruikt om 1 M te <. Voeg trypsine toe in een verhouding van 1:100 enzym: eiwit en incubeer 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>Doof de spijsvertering met de toevoeging van trifluorazijnzuur (TFA) tot 0,3% v/v. Voor elke 1 mg starteiwit, conditioneer een ontzoutingspatroon (1 cc, 10 mg) met 1 ml acetonitril (ACN) en 3x met 1 ml van 0,1% TFA.</li>
	<li>Plaats het verteerde mengsel op de ontzoutingspatroon. Was het mengsel 3x met 1 ml van 0,1% TFA. Als de elutie langzaam is, oefen dan positieve druk uit, maar vermijd een debiet > één druppel per seconde.</li>
	<li>Elutepeptiden met 1 ml 60% ACN en 0,1% mierenzuur (FA) oplossing. Droog geëlueerde peptiden bij ongeveer 35 °C met behulp van een centrifugale vacuümconcentrator totdat het oplosmiddel volledig is verdampt.</li>
	<li>Resuspend peptiden in 300 μL water en schat peptideconcentraties met behulp van een peptide-assay volgens het protocol van de fabrikant. Deel de peptiden in 500 μg aliquots en droog volledig.</li>
</ol>3. ERLIC N-glycopeptide verrijking
OPMERKING: Exacte centrifugesnelheden en -tijden kunnen verschillen op basis van monsters en moeten worden geoptimaliseerd. Over het algemeen is 300 x g gedurende 2 minuten geschikt voor conditionering en wassen van het materiaal en 100 x g gedurende 5 minuten voor eluting.
<ol><li>Weeg ongeveer 3 mg watten af en verpak deze in een lege pipetpunt van 200 μL (spinpunt; zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Breng sterk anionenwisselingsverrijkingsmateriaal over in een buis en voeg 200 μL 0,1% TFA per 10 mg materiaal toe. Gebruik voor de verrijking van 500 μg peptiden 15 mg van het materiaal. Activeer het materiaal door gedurende 15 minuten te schudden.</li>
	<li>Plaats met behulp van een buisadapter de spinpunt over een buis van 2 ml en voeg voldoende drijfmest toe aan de punt voor 15 mg materiaal. Verwijder de vloeistof door in een benchtopcentrifuge te draaien.</li>
	<li>Conditioneer het materiaal door 3x te centrifugeren met 200 μL ACN. Herhaal de drievoudige conditionering met 100 mM ammoniumacetaat (NH4Ac), 1% TFA en 80% ACN/0,1% TFA (laadbuffer).</li>
	<li>Resuspendeer 500 μg peptidemonsters in ongeveer 200 μL laadbuffer en stroom door de spin-tip. Herlaad de doorstroom 2x om volledige binding te garanderen.</li>
	<li>Was het materiaal door 5x te centrifugeren met 200 μL van 80% ACN/0,1% TFA en vervolgens 2x met 200 μL van 80% ACN/0,1% FA.</li>
	<li>Eluteer de peptiden door te centrifugeren met 200 μL van elk van de volgende: 50% ACN / 0,1% FA (E1); 0,1% FA (E2); 0,1% TFA (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).</li>
	<li>Was het materiaal door 2x te centrifugeren met 200 μL van 80% ACN/5% NH4OH. Eluteer de resterende peptiden met 200 μL van 10% NH4OH (E5).</li>
	<li>Droog alle eluties volledig met behulp van een centrifugale vacuümconcentrator bij ongeveer 35 °C.</li>
	<li>Voer het ontzouten van de basiselution (E5) uit met behulp van een ontziltingstip volgens het protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Droog de elutie van de ontziltingspunt met behulp van een centrifugaalvacuümconcentrator bij ongeveer 35 °C tot volledigheid.</li>
</ol>4. Ti(IV)-IMAC fosfopeptide verrijking
OPMERKING: Exacte centrifugesnelheden en -tijden kunnen verschillen op basis van monsters en moeten worden geoptimaliseerd. Over het algemeen is 300 x g gedurende 2 minuten geschikt voor conditionering en wassen van het materiaal en 100 x g gedurende 5 minuten voor eluting.
<ol><li>Weeg ongeveer 3 mg watten en verpak het in een lege pipetpunt van 200 μL (spin-tip).</li>
	<li>Breng Ti-IMAC fosfopeptideverrijkingsmateriaal over in een buis en voeg 200 μL 0,1% TFA per 10 mg materiaal toe. Gebruik voor de verrijking van 500 μg peptiden 10 mg materiaal.</li>
	<li>Plaats met behulp van een buisadapter de spin-tip over een buis van 2 ml en voeg voldoende slurry toe aan de tip voor 10 mg materiaal. Verwijder de vloeistof door in een benchtopcentrifuge te draaien.</li>
	<li>Conditioneer het materiaal met 200 μL van 40% ACN/3% TFA met dezelfde centrifuge-instellingen als hierboven beschreven. Resuspend peptide monsters in 200 μL van 40% ACN/3% TFA en stroom door de spin-tip. Laad de doorstroom twee keer opnieuw om een completere binding te garanderen.</li>
	<li>Was het materiaal door te centrifugeren met 200 μL 50% ACN, 6% TFA en 200 mM NaCl-oplossing, gevolgd door 2x in 200 μL van 30% ACN en 0,1% TFA-oplossing te wassen.</li>
	<li>Elute peptiden met 200 μL van 10% NH4OH. Droog de elutie volledig onder vacuüm. Voer ontzouting uit met behulp van een ontziltingstip volgens het protocol van de fabrikant. Droog de elutie van de ontzoutingspunt onder vacuüm tot volledigheid.</li>
</ol>5. Dual-functionele Ti(IV) gelijktijdige verrijking
OPMERKING: Exacte centrifugesnelheden en -tijden kunnen verschillen op basis van monsters en moeten worden geoptimaliseerd. Over het algemeen is 300 x g gedurende 2 minuten geschikt voor conditionering en wassen van het materiaal en 100 x g gedurende 5 minuten voor eluting.
<ol><li>Weeg ongeveer 3 mg watten en verpak het in een lege spin-tip.</li>
	<li>Breng ongeveer 1 g Ti(IV)-IMAC-materiaal over in een buis. Voeg 0,1% TFA toe aan een bekende concentratie materiaal, bijvoorbeeld 20 mg/200 μL (materiaal kan in deze suspensie bij 4 °C worden bewaard).</li>
	<li>Voeg voor verrijking van 500 μg peptiden voldoende drijfmest toe aan een spin-tip om 20 mg materiaal over te brengen. Was de spin-tip door te centrifugeren met 200 μL van 0,1% TFA.</li>
	<li>Resuspendeer de monsters in 200 μL laad-/wasmiddel (80% ACN en 3% TFA) en stroom door de spin-tip. Herlaad de doorstroom 2x.</li>
	<li>Was de centrifugeer 6x door te centrifugeren met 200 μL laad-/wasmiddel. Was de spin-tip met 200 μL 80% ACN/0,1% FA-oplossing.</li>
	<li>Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 60% ACN/0,1% FA (E1) en 40% ACN/0,1% FA (E2). Analyseer elke elutie afzonderlijk.</li>
	<li>Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 20% ACN / 0,1% FA en 0,1% FA. Combineer de twee ellutionen en analyseer als één monster (E3).</li>
	<li>Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 mM NaCl; en 30% ACN/0,1% TFA. Combineer deze ellutions en analyseer als één (E4) na ontzouting met behulp van een verpakte punt.</li>
	<li>Conditioneer het materiaal tot een basis-pH met 200 μL van 90% ACN/2,5% NH4OH voor 3x. Gooi deze wasbeurten weg.</li>
	<li>Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 60% ACN/10% NH4OH (E5) en 40% ACN/10% NH4OH (E6). Analyseer deze ellutions afzonderlijk na ontzouting met behulp van een verpakte punt.</li>
	<li>Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 20% ACN/10% NH4OH; 10% ACN/10% NH4OH; en 10% NH4OH. Combineer deze ellutions en analyseer als één (E7) na ontzouting met behulp van een verpakte punt.</li>
	<li>Droog alle eluties volledig onder vacuüm.</li>
</ol>6. Nano-flow omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (nRPLC-MS)
OPMERKING: MS-methoden voor gegevensverzameling en -analyse zijn divers en daarom wordt slechts één voorgestelde LC-MS-pijplijn (en de bijbehorende parameters) hier in de volgende stappen beschreven. Monsters die zijn gegenereerd met behulp van de eerder geschetste monstervoorbereidings- en verrijkingsstappen kunnen worden geanalyseerd met behulp van andere instrumentele opstellingen, inclusief het gebruik van in de handel verkrijgbare chromatografische kolommen, mits voldoende gegevenskwaliteit.
<ol><li>Trek en verpak een 15 cm lang capillair (75 μm binnendiameter) met behulp van C18-materiaal zoals beschreven in19. Bereid mobiele fase A (0,1% FA in water) en mobiele fase B (0,1% FA in ACN) voor.</li>
	<li>Reconstitueer verrijkte peptidemonsters in 15 μL van 3% mobiele fase B. Laad 2 μL van het monster (~ 13% monstervolume) rechtstreeks op de kolom. Analyseer elk monster in technisch duplicaat.</li>
	<li>Elutepeptiden met een gradiënt van 3% naar 30% mobiele fase B gedurende 90 minuten bij een stroomsnelheid van 0,3 μL/min. Was de kolom met 75% B gedurende 8 minuten gevolgd door 95% B gedurende 8 minuten en eindig de methode met evenwicht op 3% B gedurende 12 minuten.</li>
	<li>Bedien de massaspectrometer in de positieve ionmodus met behulp van gegevensafhankelijke acquisitie van de bovenste 20 pieken met de volgende parameters: spuitspanning 2 kV; MS1-detectie in LC/MS van 400-2.000 m/z bij een resolutie van 120.000, 2E5 AGC-doel (automatic gain control), maximale injectietijd van 100 ms, 30% RF-lens, quadrupole-isolatie met 1,6 m/z-venster , voor laadtoestanden 2-8 en onbepaald, en dynamische uitsluiting van 30 s; MS2-detectie in de LC/MS met behulp van getrapte HCD-fragmentatie bij 22%, 30% en 38%, vaste eerste massa 120 m/z bij 30.000 resolutie, 5E4 AGC-doel en 2,5E4 minimale intensiteitsvereiste.</li>
</ol>7. Gegevensanalyse van de lidstaten
OPMERKING: Een pijplijn voor gegevensanalyse met behulp van twee verschillende software om dezelfde gegevensset te analyseren, wordt hier gepresenteerd. Fosforylering en glycosylatie kunnen tegelijkertijd worden doorzocht met behulp van een enkele software in plaats van twee afzonderlijke software zoals hier beschreven, hoewel over het algemeen de zoektijd van software evenredig is met de zoekruimte, d.w.z. het aantal beschouwde PTM's. Om deze reden worden twee verschillende software gebruikt parallel aan de zoektocht naar glycopeptiden en fosfopeptiden.
<ol><li>Verwerk onbewerkte gegevensbestanden met behulp van de juiste software (zie Materiaalopgave).<ol>
<li>Zoek spectra tegen de UniProt menselijke (of geschikte soortspecifieke) database. Stel carbamidomethylatie van Cys in als een vaste modificatie. Stel het maximum aantal gemiste enzymatische decolleté's in op twee.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zoek in de onbewerkte gegevensbestanden met behulp van commerciële software (zie Tabel met materialen) naar glycopeptiden die moeten worden geanalyseerd20. Gebruik een 10 ppm precursor massatolerantie en een 0,01 Da fragment massatolerantie met een minimale peptidelengte van vier residuen.<ol>
<li>Zoeken met behulp van de software-embedded N-glycan database uitgebreid met typische mannose-6-fosfaat (M6P) glycanen, waaronder HexNAc (2) Hex (4-9) Fosfo (1-2), HexNAc (3-4) Hex (4-9) Fosfo (1-2), HexNAc (2) Hex (3-4) Phospho (1) en HexNAc (3) Hex (3-4) Phospho (1).</li>
		<li>Stel N-glycosylatie in als een veel voorkomende wijziging. Stel de maximale totale modificaties per peptide spectrale match (PSM) in als één veel voorkomende en twee zeldzame.</li>
		<li>Stel de volgende variabele modificaties in: oxidatie van Met (zeldzaam), deamidatie bij Asn en Gln (zeldzaam) en fosforylering bij Ser, Thr en Tyr (vaak). Stel de volgende identificatiefilters in: score cut-off > 150, |log prob| > 1 en delta mod score > 10.</li>
		<li>Exporteer en analyseer zoekresultaten op de tabbladen Eiwitten en Peptidegroep.</li>
		<li>Screen handmatig de identificaties die M6P-glycanen bevatten op de aanwezigheid van het fosfohex oxoniumion (243 m/z) in de MS/MS-spectra en verwijder vals-positieve identificaties, die dit diagnostische ion niet bevatten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zoek in de onbewerkte gegevensbestanden met behulp van een open-source software (zie Tabel van materialen) naar fosfopeptiden die moeten worden geanalyseerd21. Gebruik een 20 ppm first search peptide tolerantie en een 4,5 ppm main search peptide tolerantie.<ol>
<li>Stel het maximum aantal modificaties per peptide in op 5. Stel PSM en protein false discovery rate (FDR) in op 1% en minimale peptidelengte op 7 residuen.</li>
		<li>Stel variabele modificaties in als oxidatie bij Met, N-terminale eiwitacetylering en fosforylering bij Ser, Thr en Tyr. Analyseer zoekresultaten met behulp van de modificationSpecificPeptides-bestanden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bepaal het aantal identificaties van PTM's op het niveau van eiwitten, peptiden en modificaties.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, L. M., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteoform%3A+a+single+term+describing+protein+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteoform: a single term describing protein complexity.</a> Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).</li>
<li>Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteins+and+glycoproteomics+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).</li>
<li>Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+mass+spectrometry-based+glycomic+and+glycoproteomic+studies+of+pancreatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases.</a> Frontiers in Chemistry. 9, 707387(2021).</li>
<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+post-translational+modification+statistics%3A+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90(2011).</li>
<li>Alpert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic-interaction+chromatography+for+the+separation+of+peptides%2C+nucleic+acids+and+other+polar+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds.</a> Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).</li>
<li>Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pragmatic+guide+to+enrichment+strategies+for+mass+spectrometry-based+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029(2020).</li>
<li>Low, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widening+the+bottleneck+of+phosphoproteomics%3A+Evolving+strategies+for+phosphopeptide+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment.</a> Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).</li>
<li>Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+workflow+for+simultaneous+analyses+of+phosphopeptides+and+glycopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides.</a> ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+workflow+for+global%2C+glyco-%2C+and+phospho-proteomic+analysis+of+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).</li>
<li>Tang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+preparation+of+bifunctional+adsorbents+for+efficiently+enriching+N-glycopeptides+and+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides.</a> Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).</li>
<li>Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promising+nanoprobe+based+on+hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+and+immobilized+metal+affinity+chromatography+for+capture+of+glycopeptides+and+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides.</a> Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).</li>
<li>Glover, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+intact+sialylated+glycopeptides+and+phosphorylated+glycopeptides+from+IMAC+enriched+samples+by+EThcD+fragmentation%3A+Toward+combining+phosphoproteomics+and+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).</li>
<li>Alpert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrostatic+repulsion+hydrophilic+interaction+chromatography+for+isocratic+separation+of+charged+solutes+and+selective+isolation+of+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides.</a> Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterion+optimization+dramatically+improves+selectivity+for+phosphopeptides+and+glycopeptides+in+electrostatic+repulsion-hydrophilic+interaction+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography.</a> Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+sweet+spot+in+ERLIC+mobile+phase+for+simultaneous+enrichment+of+N-Glyco+and+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).</li>
<li>Tabang, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pancreatic+extracellular+matrix+protein+post-translational+modifications+via+electrostatic+repulsion-hydrophilic+interaction+chromatography+coupled+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Omics%22%5BJournal%5D)">Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry.</a> Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-functional+Titanium%28IV%29+immobilized+metal+affinity+chromatography+approach+for+enabling+large-scale+profiling+of+protein+Mannose-6-Phosphate+glycosylation+and+revealing+its+predominant+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates.</a> Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-functional+Ti%28IV%29-IMAC+material+enables+simultaneous+enrichment+and+separation+of+diverse+glycopeptides+and+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides.</a> Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).</li>
<li>Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+method+for+packing+high+resolution+C18+RP-nano-HPLC+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380(2021).</li>
<li>Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Byonic%3A+advanced+peptide+and+protein+identification+software%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Byonic: advanced peptide and protein identification software.</a> Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Perez-Riverol, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PRIDE+database+and+related+tools+and+resources+in+2019%3A+improving+support+for+quantification+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data.</a> Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metascape+provides+a+biologist-oriented+resource+for+the+analysis+of+systems-level+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets.</a> Nature Communications. 10 (1), 1523(2019).</li>
<li>Zacharias, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HILIC+and+ERLIC+enrichment+of+glycopeptides+derived+from+breast+and+brain+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells.</a> Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).</li>
<li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+enrichment+methods+for+intact+N-+and+O-linked+glycopeptides+using+strong+anion+exchange+and+hydrophilic+interaction+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography.</a> Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).</li>
<li>Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPQuest%3A+A+spectral+library+matching+algorithm+for+site-specific+assignment+of+tandem+mass+spectra+to+intact+N-glycopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides.</a> Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).</li>
<li>Liu, M. -Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGlyco+2.0+enables+precision+N-glycoproteomics+with+comprehensive+quality+control+and+one-step+mass+spectrometry+for+intact+glycopeptide+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification.</a> Nature Communications. 8 (1), 438(2017).</li>
<li>Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-Pair+Search+with+MetaMorpheus+for+O-glycopeptide+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization.</a> Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).</li>
<li>Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-heterogeneity%3A+Evaluating+and+describing+the+diversity+in+glycosylation+between+sites+on+the+same+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010(2021).</li>
<li>Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+histone+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The language of histone crosstalk.</a> Cell. 142 (5), 682-685 (2010).</li>
<li>Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+post-translational+modification+crosstalk+with+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129(2021).</li>
<li>Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+between+O-GlcNAcylation+and+phosphorylation%3A+Roles+in+signaling%2C+transcription%2C+and+chronic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

De dual-functionele Ti(IV)-IMAC strategie is nuttig voor de gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit hetzelfde monster in een enkele monstervoorbereidingsworkflow. Erlic-gebaseerde methoden hebben ook aangetoond dat ze gelijktijdige verrijking van PTM's uitvoeren. Beide strategieën zijn eerder gebruikt voor diepe dekking in PTM-analyses 14,18. Door de dual Ti-methode aan te passen aan het verminderen van de incubatietijd van monsters door ge...

Eiwit posttranslationele modificaties (PTM's) spelen een belangrijke rol bij het moduleren van eiwitstructuren en bijgevolg hun functies en downstream biologische processen. De diversiteit van het menselijke proteoom neemt exponentieel toe als gevolg van de combinatorische variabiliteit die wordt geboden door verschillende PTM's. Verschillende varianten van eiwitten uit hun canonieke sequenties zoals voorspeld door het genoom staan bekend als proteoformen, en veel proteoformen komen voort uit PTM's1. Het bestuderen van proteoforme diversiteit in gezondheid en ziekte is de afgelopen jaren een onderzoeksgebied van groot belang geworden 2,3.
De studie van proteoformen en meer specifiek PTM's met grote diepgang is gemakkelijker geworden door de ontwikkeling van op massaspectrometrie (MS) gebaseerde proteomics-methoden. Met behulp van MS worden analyten geïoniseerd, gefragmenteerd en geïdentificeerd op basis van de m/z van fragmenten. Verrijkingsmethoden zijn vaak nodig vanwege de lage relatieve abundantie van PTM's in vergelijking met niet-gemodificeerde vormen van eiwitten. Hoewel de analyse van intacte eiwitten en hun PTM's, top-down analyses genoemd, meer routine zijn geworden, is de enzymatische vertering van eiwitten en de analyse van hun componentpeptiden in bottom-up analyses nog steeds de meest gebruikte route voor PTM-analyse. De twee meest bestudeerde PTM's, en de twee meest voorkomende PTM's in vivo, zijn glycosylering en fosforylering4. Deze twee PTM's spelen een belangrijke rol in celsignalering en -herkenning en zijn dus belangrijke wijzigingen om te karakteriseren in ziekteonderzoek.
De chemische eigenschappen van verschillende PTM's bieden vaak routes naar verrijking van deze PTM's op eiwit- en peptideniveaus voorafgaand aan de analyse. Glycosylering is een hydrofiele PTM vanwege de overvloed aan hydroxylgroepen op elke monosaccharide. Deze eigenschap kan worden gebruikt om glycopeptiden te verrijken in hydrofiele interactiechromatografie (HILIC), die meer hydrofiele glycopeptiden kan scheiden van de hydrofobe niet-gemodificeerde peptiden5. Fosforylering voegt het fosfaatgedeelte toe, dat negatief geladen is, behalve bij zure pH. Vanwege deze lading kunnen verschillende metaalkationen, waaronder titanium, worden gebruikt om fosfopeptiden aan te trekken en te binden, terwijl niet-gefosforyleerde soorten worden weggespoeld. Dit is het principe van geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC). Verdere discussies over deze en andere verrijkingsstrategieën voor glycosylering en fosforylering zijn te vinden in recente beoordelingen 6,7.
Relatief grote hoeveelheden uitgangspeptidemateriaal (0,5 mg of meer) zijn vaak nodig voor verrijkingsprotocollen vanwege de lage stoichiometrie van PTM's op peptiden. In scenario's waarin deze hoeveelheid monster mogelijk niet gemakkelijk kan worden verkregen, zoals tumorkernbiopsie of cerebrospinale vloeistofanalyses, is het nuttig om gemakkelijke workflows te gebruiken die resulteren in maximale biomoleculaire informatie. Recente strategieën ontwikkeld door ons laboratorium en anderen hebben de gelijktijdige en parallelle analyse van glycosylering en fosforylering benadrukt met behulp van dezelfde PTM-verrijkingsworkflow 8,9,10,11,12. Hoewel de chemische eigenschappen van deze twee PTM's kunnen verschillen, kunnen deze PTM's in meerdere stappen worden geanalyseerd vanwege de innovatieve scheidingstechnieken en gebruikte materialen. Elektrostatische repulsie-hydrofiele interactiechromatografie (ERLIC) overlays bijvoorbeeld scheidingen op basis van hydrofiele interacties tussen analyten en de mobiele fase met lading-ladingsinteracties tussen analyten en het stationaire fasemateriaal 13,14,15,16. Bij zure pH kan de aantrekkingskracht van gefosforyleerde peptiden naar de stationaire fase hun retentie en scheiding van niet-gemodificeerde peptiden verbeteren. Materiaal bestaande uit Ti(IV) geïmmobiliseerd op hydrofiele microsferen kan worden gebruikt voor HILIC en IMAC-gebaseerde elutie om fosfopeptiden en neutrale, zure en mannose-6-gefosforyleerde glycopeptidente scheiden 17,18. Deze strategie staat bekend als dual-functionele Ti(IV)-IMAC. Het gebruik van deze strategieën voor het verrijken van meerdere PTM's in één workflow kan analyses van potentiële PTM-overspraakinteracties toegankelijker maken. Bovendien zijn de totale hoeveelheid monster en tijdsvereisten minder dan de conventionele verrijkingsmethoden wanneer ze parallel worden uitgevoerd (d.w.z. HILIC en IMAC op afzonderlijke monsteraliquots).
Om de dual-functionele Ti (IV) -IMAC-strategie voor gelijktijdige analyse van eiwitglycosylering en fosforylering te demonstreren, hebben we deze toegepast om postmortale menselijke pancreasweefsels te analyseren. De alvleesklier produceert zowel spijsverteringsenzymen als regulerende hormonen, waaronder insuline en glucagon. De pancreasfunctie is aangetast bij pancreasaandoeningen. Bij diabetes wordt de regulatie van de bloedsuikerspiegel beïnvloed, wat leidt tot hogere glucosespiegels in het bloed. Bij pancreatitis is een ontsteking het gevolg van autovertering van het orgaan3. Veranderingen in PTM-profielen, waaronder glycosylering en fosforylering, kunnen, zoals vaak het geval is, resulteren in andere ziekten.
Hier beschrijven we een protocol voor een op spin-tip gebaseerde gelijktijdige verrijkingsmethode, gebaseerd op een dual-functionele Ti (IV) -IMAC-strategie, voor N-glycopeptiden en fosfopeptiden afgeleid van eiwitten geëxtraheerd uit pancreasweefsel. Het protocol omvat eiwitextractie en -vertering, verrijking, MS-gegevensverzameling en gegevensverwerking, zoals te zien is in figuur 1. Representatieve gegevens uit deze studie zijn beschikbaar via ProteomeXchange Consortium met identifier PXD033065.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63735/63735fig01.jpg"> Figuur 1: Workflow voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels. Weefsels worden eerst gecryopiseerd tot een fijn poeder voordat eiwit wordt geëxtraheerd met behulp van het wasmiddel natriumdodecylsulfaat (SDS). Eiwitten worden vervolgens onderworpen aan enzymatische spijsvertering. De resulterende peptiden worden gealiquoteerd voorafgaand aan verrijking met behulp van dual-functionele Ti(IV)-IMAC. Ruwe gegevens worden verzameld met behulp van nanoschaal omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (nRPLC-MS) en worden geanalyseerd met behulp van database zoeksoftware. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63735/63735fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Dit protocol is bedoeld om PTM-analyses toegankelijker te maken en een bredere analyse van meerdere PTM's in dezelfde workflow mogelijk te maken. Dit protocol kan worden toegepast op andere complexe biologische matrices, waaronder cellen en biovloeistoffen.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur, Glaciaal (Gecertificeerd ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>Aceton (Gecertificeerd ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril, Optima LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetaat (Kristallijn/Gecertificeerd ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxide (Gecertificeerd ACS Plus)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669-212</td><td></td></tr><tr><td>Byonic software</td><td>Protein Metrics</td><td>n/a</td><td>Commerciële software gebruikt voor glycoproteomische analyse (https://proteinmetrics.com/byos/)</td></tr><tr><td>C18 BEH materiaal</td><td>Waters</td><td>186002353</td><td>Materiaal verwijderd uit kolom en gebruikt om nano capillaire te vullen (tip rechtstreeks in lijn met instrument inlaat gebruikt)</td></tr><tr><td>CAE-Ti-IMAC, 100%</td><td>J&amp;K Scientific</td><td>2749380-1G</td><td>Materiaal gebruikt voor dubbel functioneel Ti(IV)-IMAC; kan ook worden gebruikt voor conventionele IMAC/conventionele fosfopeptide verrijking</td></tr><tr><td>Cellcrusher kit</td><td>Cellcrusher</td><td>n/a</td><td>Gebruikt voor het vermalen van weefsel monsters tot poeder voor extractie</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R Microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-401-205</td><td>Voor temperatuur gecontroleerde centrifugatie</td></tr><tr><td>cOmplete protease remmercocktail tabletten</td><td>Sigma</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>DTT, Moleculair Grad (DL-Dithiothreitol)</td><td>Promega</td><td>V3151</td><td>Eiwit reducerend middel</td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof (100%), USP</td><td>Fisher</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>Voor monster lysis met behulp van ultrasonificatie</td></tr><tr><td>Mierenzuur, 99,0+%, Optima LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Gefuzeerde silica capillaire (75 µm binnendiameter, 360 µm buitendiameter)</td><td>Polymicro Technologies LLC</td><td>100 m TSP075375</td><td>Voor in-house getrokken en gevulde kolommen met geïntegreerde emitter</td></tr><tr><td>Fluorwaterstofzuur (48 wt. % in H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339261-100ML</td><td>Gebruikt voor het openen van emitter van getrokken capillaire kolom</td></tr><tr><td>Iodoacetamid, BioUltra</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td>Eiwit reducerend reagens</td></tr><tr><td>MaxQuant software</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Gratis software gebruikt voor fosfoproteomische analyse (https://www.maxquant.org/)</td></tr><tr><td>Multi-therm Shaker met verwarming en koeling</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td>Verwarmingsblok</td></tr><tr><td>Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td>Grotere schaal cartridge ontzouten voor tryptische digests (laadcapaciteit ongeveer tot 1 mg elk)</td></tr><tr><td>OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elutie volume, 1 x 96 tips</td><td>Agilent</td><td>A57003100</td><td>Kleinere schaal gevulde pipette tip voor ontzouten voor verrijking eluties</td></tr><tr><td>P-2000 Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000/F</td><td>Voor het trekken van nano-capillaire kolommen voor LC-MS</td></tr><tr><td>PhosSTOP fosfataseremmertabletten</td><td>Sigma</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Eiwit Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Kwantitatieve Colorimetrische Peptide Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>PolySAX LP (12 µm, poriegrootte 300 Å)</td><td>PolyLC</td><td>BMSX1203</td><td>Materiaal voor sterke anionen uitwisselingschromatografie gebruikt voor ERLIC/conventionele glycopeptide verrijking</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat Monobasisch (Kristallijn/Gecertificeerd ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Drukinjectiecel met geïntegreerde magnetische roerplaat</td><td>Next Advance</td><td>PC77-MAG</td><td>Voor het vullen van nano-capillaire kolommen met stationaire fase tot 2500 psi limiet</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer software</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Commerciële software voor proteomics anaysis (met geïntegreerde database zoeksoftware nodes) en data visualisatie (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)</td></tr><tr><td>SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120</td><td>Savant</td><td>n/a</td><td>Centrifugale vacuüm concentrator voor het drogen van monsters (onder warmte)</td></tr><tr><td>SDS Oplossing, 10% Natriumdodecylsulfaat Oplossing, Moleculaire Biologie/Electroforese</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2436200</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Grade Gemodificeerd Trypsine</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (Kristallijn/Gecertificeerd ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>TopTip, Leeg, 10-200 µL, Pak van 96</td><td>Glygen Corporation</td><td>TT2EMT.96</td><td>Lege pipette tip met micron-grootte gat dat kan worden gebruikt om chromatografische materialen voor verrijkingen te vullen, gebundeld met buisadapters</td></tr><tr><td>Triethylammoniumbicarbonaat buffer (TEAB, 1 M, pH 8,5 (vluchtig))</td><td>Sigma</td><td>90360-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur, Reagens Grad, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>60-017-61</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (Witte Kristallen of Kristallijn Poeder/Moleculaire Biologie)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/Lys-C Mix, Mass Spec Grad</td><td>Promega</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>Urea (Gecertificeerd ACS)</td>

een spin-tipverrijkingsstrategie voor gelijktijdige analyse van n-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels

A Spin-Tip Enrichment Strategy for Simultaneous Analysis of N-Glycopeptides and Phosphopeptides from Human Pancreatic Tissues

Massaspectrometrie kan een diepe dekking bieden van posttranslationele modificaties (PTM's), hoewel verrijking van deze modificaties uit complexe biologische matrices vaak noodzakelijk is vanwege hun lage stoichiometrie in vergelijking met niet-gemodificeerde analyten. De meeste verrijkingsworkflows van PTM's op peptiden in bottom-up proteomics-workflows, waarbij eiwitten enzymatisch worden verteerd voordat de resulterende peptiden worden geanalyseerd, verrijken slechts één type modificatie. Het is echter het hele complement van PTM's dat leidt tot biologische functies, en verrijking van een enkel type PTM kan een dergelijke kruisverwijzing van PTM's missen. PTM-kruisverwijzing is waargenomen tussen eiwitglycosylering en fosforylering, de twee meest voorkomende PTM's in menselijke eiwitten en ook de twee meest bestudeerde PTM's met behulp van massaspectrometrieworkflows. Met behulp van de hierin beschreven simultane verrijkingsstrategie worden beide PTM's verrijkt uit postmortaal menselijk pancreasweefsel, een complexe biologische matrix. Dual-functionele Ti(IV)-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie wordt gebruikt om verschillende vormen van glycosylering en fosforylering tegelijkertijd in meerdere fracties te scheiden in een handige op spintip gebaseerde methode, waardoor downstream-analyses van potentiële PTM-overspraakinteracties mogelijk zijn. Deze verrijkingsworkflow voor glyco- en fosfopeptiden kan worden toegepast op verschillende monstertypen om diepe profilering van meerdere PTM's te bereiken en potentiële doelmoleculen voor toekomstige studies te identificeren.

Representatieve massaspectrometriegegevens, waaronder onbewerkte bestanden en zoekresultaten, zijn gedeponeerd bij het ProteomeXchange Consortium via de PRIDE-partnerrepository met de dataset-id PXD03306522.
In dit werk werden dubbele injectiereplicaties geanalyseerd voor elke verrijkingselelution. Identificaties gemaakt van beide technische replica's werden verzameld in de uiteindelijke analyse. Vanwege de semi-stochastische aard van gegevensafhankelijke acqui...

Posttranslationele modificaties (PTM's) veranderen eiwitstructuren en -functies. Methoden voor de gelijktijdige verrijking van meerdere PTM-typen kunnen de dekking in analyses maximaliseren. We presenteren een protocol met behulp van dual-functionele Ti(IV)-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie gevolgd door massaspectrometrie voor de gelijktijdige verrijking en analyse van eiwit N-glycosylatie en fosforylering in pancreasweefsels.

Een spin-tipverrijkingsstrategie voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels

Mass spectrometry can provide deep coverage of post-translational modifications (PTMs), although enrichment of these modifications from complex biological ...

De dual-functionele Titanium geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie strategie kan zowel N-glycopeptiden als fosfopeptiden in dezelfde workflow verrijken, waardoor biomoleculaire informatie uit dezelfde analyse toeneemt. Het belangrijkste voordeel van deze verrijking is twee scheidingsmechanismen, die de gelijktijdige scheiding van N-glycopeptiden en fosfopeptiden in afzonderlijke fracties mogelijk maken voor downstream massaspectrometrie-analyse. Het gebruik van deze verrijkingsmethode kan de detectie van glycosylering en fosforylering in complexe biologische monsters zoals pancreasweefsels verbeteren in de richting van de ontdekking van ziektebiomarkers zoals bij diabetes en kanker.Omdat deze methode afhankelijk is van spintips en centrifugatie, is het belangrijk om de centrifugatiesnelheid te regelen en ervoor te zorgen dat monsters vrij zijn van deeltjes om verstopping te voorkomen. Om te beginnen, koel de delen van de weefselverpulverizer die in contact komen met de pancreasweefsels, namelijk de kamer, verpulverer en herstellepel, samen met eventuele spatels, vooraf af in een polystyreencontainer. Breng vervolgens weefselstukken over in de voorgekoelde monsterhouder en voeg een vloeibare stikstof toe aan het weefsel totdat ze zijn bevroren.Nadat u de vergruizer in de kamer hebt geplaatst, slaat u deze vijf tot tien keer met een hamer om het monster te verpletteren, verwijder vervolgens de vergruizer uit de kamer en schraapt u het aanhangende weefselpoeder en de stukken af. Voeg vervolgens een lepel vloeibare stikstof toe aan de kamer als weefsels beginnen te smelten en herhaal het verpulveringsproces totdat een fijn poeder is verkregen en deel de monsters in ongeveer 100 milligram aliquots in voorgekoelde buizen. Los na het bereiden van de lysisbuffer één tablet elk van protease en fosfataseremmer op in 500 microliter water, voor een voorraad van 20 keer de gewenste eindconcentratie, en voeg het vereiste volume voorraad van elke remmer toe aan de lysisbuffer om de uiteindelijke remmerconcentraties te bereiken.Na het toevoegen van 600 microliter lysisbuffer aan de buis, incubeer je bij 95 graden Celsius in het verwarmingsblok gedurende 10 minuten met schudden bij 800 RPM, verwijder dan de monsters uit het verwarmingsblok en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Soniceer vervolgens de monsters op 60 Watt energie gedurende 45 seconden, met behulp van 15 seconden pulsen met een rust van 30 seconden ertussen, en pelleteer de monsters op 3000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Voeg het supernatant toe aan vijf keer het volume precipitatieoplosmiddel.Bijvoorbeeld, 300 microliter lysisbuffer tot 1,5 milliliter precipitatie-oplosmiddel met 50% aceton, 49,9% ethanol en 0,1% azijnzuur, en koel dan 's nachts af bij 80 graden Celsius. Pelleteer de monsters opnieuw op 3000 maal G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant, was de pellet vervolgens door te breken met een spatel en meng met dezelfde hoeveelheid precipitatie-oplosmiddel. Na het centrifugeren droogt u de monsterpellet gedurende 15 minuten aan de lucht in een zuurkast en bewaart u deze bij 80 graden Celsius totdat u klaar bent om verder te gaan.Suspensie eerst de eiwitpellet opnieuw in 300 microliter vers gemaakte digestiebuffer met 50 millimolar triethylammoniumbicarbonaatbuffer en acht molaire ureum. Voeg aan het eiwit in oplossing dithiothreitol toe aan een uiteindelijke concentratie van vijf millimolar, meng en verlaag bij kamertemperatuur gedurende een uur en voeg vervolgens jodoacetamide toe aan een uiteindelijke concentratie van 15 millimolar. Meng en alkylaat op kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker.Voeg vervolgens Lys-C / Trypsin toe in een verhouding van 1 tot 100 enzym/eiwit en incubeer bij 37 graden Celsius in een incubator gedurende vier uur en voeg vervolgens 50 millimolaire triethylammoniumbicarbonaatbuffer toe om het acht molaire ureum dat wordt gebruikt tot minder dan één kies te verdunnen. Na toevoeging van trypsine in een verhouding van 1 tot 100 enzym/eiwit, incubeer je 's nachts bij 37 graden Celsius in een incubator en doof je vervolgens de spijsvertering met de toevoeging van trifluorazijnzuur. Voor elke milligram starteiwit, conditioneer een ontziltingspatroon met één milliliter acetonitril en driemaal met één milliliter 0,1% trifluorazijnzuur, laad vervolgens het verteerde mengsel op de ontziltingspatroon en was het mengsel driemaal met één milliliter 0,1% trifluorazijnzuur.Vervolgens eluteer peptiden met behulp van een milliliter van 60% acetonitril en 0,1% mierenzuuroplossing, en droog vervolgens geëlueerde peptiden op ongeveer 35 graden Celsius met behulp van een centrifugale vacuümconcentrator totdat het oplosmiddel volledig is verdampt. Nadat u de peptiden opnieuw in water hebt gesuspendeerd, schat u de peptideconcentraties met behulp van een peptidetest volgens het protocol van de fabrikant, deelt u de peptiden vervolgens in aliquots van 500 microgram en droogt u volledig. Weeg ongeveer drie milligram watten en verpak het in een lege spintip.Voeg na het overbrengen van één gram titanium geïmmobiliseerd metaalaffiniteitschromatografiemateriaal in een buis toe, 0,1% trifluorazijnzuur aan een bekende concentratie materiaal. Nadat u voldoende drijfmest aan een spinpunt hebt toegevoegd om 20 milligram materiaal over te brengen, wast u de spinpunt door te centrifugeren met 200 microliter 0,1% trifluorazijnzuur. Suspensieer de monsters opnieuw in 200 microliter laad-/wasmiddel en stroom door de spinpunt.Na het wassen van de spinpunt door centrifugatie met laad- / wasmiddel, wast u de spinpunt met 200 microliter 80% acetonitril 0,1 mierenzuuroplossing, elueert u vervolgens de peptiden met 200 microliter E1 en E2 en analyseert u elke elutie afzonderlijk. Herhaal het elutieproces met behulp van E3- en E4-oplosmiddelen en combineer de juiste elutiefracties vóór de downstreamanalyse. Voordat u de eluties bij een basis-pH uitvoert, conditioneert u het materiaal driemaal met behulp van 200 microliter 90% acetonitril in 2,5% ammoniumhydroxide, elueert u de peptiden vervolgens met 200 microliter E5- en E6-oplosmiddelen en analyseert u deze eloplossingen afzonderlijk na ontzouting met behulp van een verpakte punt.Eluuteer vervolgens de peptiden met 200 microliter verschillende concentraties acetonitril en ammoniumhydroxide. Combineer daarna deze eloplossingen en analyseer als één monster, E7, na ontzouting met behulp van een verpakte punt. Geannoteerde high-confidence MS/MS-spectra van N-geglycosyleerde en gefosforyleerde peptiden werden verkregen met een rijke fragmentatie van precursoren, waardoor het vertrouwen in de identificatie toenam, zoals toegewezen door de database-zoeksoftware.Peptide-identificaties werden gevonden uit monsters verrijkt met behulp van de dual-functionele Titanium geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie spintipmethode over elke elutiedractie. De meerderheid van glycopeptiden elueren in de eerste vier fracties, terwijl de meerderheid van fosfopeptiden elueren in de laatste drie fracties, waardoor potentiële interferenties in ionisatie worden verminderd. De glycoproteomics-resultaten van de dual titanium-methode werden vergeleken met een Ehrlich-glycopeptide-only verrijking, wat aantoont dat verhoudingen van elk type glycan na binning in zes categorieën op basis van hun samenstellingen, vergelijkbaar zijn tussen beide methoden.Fosfoproteomics resultaten van de dual titanium methode werden vergeleken met een conventionele geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie fosfopeptide-only verrijking of met behulp van beide methoden. De meerderheid van de gefosforyleerde aminozuren werden geïdentificeerd als serine en threonine, met ongeveer 1% gefosforyleerde tyrosine. Het goed construeren van de spinpunt is belangrijk om een soepele elutie te garanderen.Steek het katoen stevig in de punt, zodat het verrijkingsmateriaal bovenop het katoen kan worden verpakt. We hebben de dual-functionele titanium IMAC-methode gebruikt voor gelijktijdige karakterisering van glycosylering en fosforylering in de meeste weefsels en het SARS-CoV-2 spike-eiwit.

a-spin-tip-enrichment-strategy-for-simultaneous-analysis-n

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In this video, we demonstrate antibody-based immunoprecipitation of phosphopeptides from a peptide mixture. The enriched phosphopeptides are vacuum concentrated and stored for downstream analysis.

Phosphopeptide Enrichment: An Antibody-based Immunoprecipitation Technique to Separate Specific Phosphorylated Peptides from Complex Peptide Mixtures

Celoppervlakeiwitten biologisch belangrijke en sterk geglycosyleerd. We introduceren hier een glycopeptide-capture benadering oplosbaar te maken, te verrijken, en deglycosylate deze eiwitten voor facile LC-MS gebaseerde proteomics analyses.

Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

Dit protocol beschrijft een procedure om uitpakken en verrijken van phosphopeptides van prostaatkanker cellijnen of weefsels voor een analyse van de phosphoproteome via massa spectrometrie gebaseerde proteomics.

Verrijking van de Phosphopeptide in combinatie met kwantitatieve Label-vrije Spectrometrie van de massa te onderzoeken van de Phosphoproteome in prostaatkanker

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

Hier wordt een fosfaatprotemische benadering gepresenteerd, namelijk stop and go extractietip op basis van phosfoproteom, die een hoge doorvoer en diepe dekking van Arabidopsis phosphoproteome biedt. Deze aanpak definieert het overzicht van osmotische stresssignalering in Arabidopsis.

Fosfaatprotemische strategie voor profilering osmotische stresssignalering in Arabidopsis

Dit protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor de efficiënte isolatie van extracellulaire blaasjes in de urine met behulp van gefunctionaliseerde magnetische kralen. Bovendien omvat het latere analyses, waaronder western blotting, proteomics en phosphoproteomics.

Chemische affiniteit-gebaseerde isolatie van extracellulaire blaasjes uit biovloeistoffen voor proteomics en fosfoproteomics-analyse

Dit protocol beschrijft de glycomics-geleide glycoproteomics-methode, een geïntegreerde omics-technologie die uitgebreide inzichten biedt in het heterogene glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen die nodig zijn om de glycobiologie van kankers beter te begrijpen.

Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen 

Hier stellen we een op massaspectrometrie gebaseerde proteomische methode op met behulp van geïsoleerde interessegebieden in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties. Dit protocol wordt gebruikt om proteoom te analyseren van specifieke weefselgebieden in gearchiveerde, in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties.

Een gestroomlijnde aanpak voor proteomics op basis van massaspectrometrie met behulp van geselecteerde weefselregio's

Leer een dual-functionele titanium IMAC-methode voor gelijktijdige verrijking van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijk pancreasweefsel. Deze spin-tipstrategie verbetert detectie van post-translatiemodificaties voor biomarkeronderzoek naar diabetes en kanker.

Een spin-tipverrijkingsstrategie voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels (Video) | JoVE Journal

Een spin-tipverrijkingsstrategie voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels

Meer video's verkennen