Name: Massa-opfok en moleculaire studies in Tortricidae plaaginsecten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Leer massa-opfok en moleculaire studies van Tortricidae plaaginsecten met kunstmatige diëten en nucleïnezuurextractie. Deze methoden ondersteunen onderzoek naar biologie en gewasbescherming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de steun van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellowships for Young Scientists erkennen [Grant Number 19J13123 and 21J00895].

1. Insectenverzameling en massale kweek
<ol><li>Verzamel tortricid insecten uit velden volgens eerder gepubliceerde referenties 8,12. OPMERKING: De larven H. magnanima en A. honmai worden verzameld uit beschadigde theebladeren (figuur 1A); volwassenen worden aangetrokken met behulp van 4 W draagbaar UV-licht (365 nm golflengte, zie Tabel met materialen, figuur 1B).</li>
	<li>Kweek de verzamelde larven (figuur 1C, D) individueel op een stuk kunstmatig dieet in een 1/2-oz cup gedurende 2-3 weken tot volwassen eclosie (figuur 1E, F). Bevestig het geslacht van poppen en volwassenen door morfologische kenmerken (figuur 1G,I).</li>
	<li>Paar de mannetjes en vrouwtjes in een plastic doos (30 cm x 20 cm x 5 cm) tot legoviposit-eimassa's op een paraffinepapier (figuur 1J-L). Plaats een vrouwtje en twee mannetjes in een plastic beker van 120 ml met een stuk paraffinepapier om een matriline vast te stellen. OPMERKING: Het is belangrijk om vouwen op het paraffinepapier te maken. Voor H. magnanima moet paraffinepapier op de bodem van de behuizing liggen. Leg ondertussen voor A. honmai een papier op het kastplafond om eieren te verzamelen (figuur 1L) omdat H. magnanima oviposit eiermassa aan de bovenkant van theebladeren, maar A. honmai legt eieren aan de onderkant van de bladeren8. De procedures werden ook geverifieerd in andere tortricid-soorten en het is beter om papieren aan beide zijden te plaatsen als de ecologie en het gedrag van de doelsoort niet zijn aangegeven.</li>
	<li>Knip de eimassa's (ongeveer 100-200 eieren per eimassa12, figuur 1M) op het paraffinepapier met een schaar uit. Plaats de eieren in een 1/2 oz kopje met gedumpt papier gedurende 5-7 dagen. OPMERKING: Het gerijpte embryo vertoont een mee-eterskapsel (figuur 1N). De perioden van embryogenese worden divers toegeschreven aan tortricid-soorten, maar over het algemeen 5 dagen na ovipositie (dpo) voor H. magnanima en 4 dpo voor A. honmai bij 25 °C met 60% relatieve vochtigheid, 16 h licht / 8 h donkere cycli7.</li>
	<li>Bewaar de eimassa's met zwarte kopcapsules bij 4-8 °C gedurende 7 dagen.</li>
	<li>Snijd ~ 60 g kunstmatige diëten met behulp van een rasp voor massale opfok. Plaats de met gerijpte embryo's gevulde eimassa op het gesneden kunstmatige dieet in een plastic bakje (23 cm x 16 cm x 8 cm). Leg paraffinepapierjes op de eimassa met de gesneden diëten (figuur 10). OPMERKING: Minder dan 30% relatieve vochtigheid wordt als te droog beschouwd, terwijl meer dan 70% te vochtig is. Het maken van gaten in het deksel van de plastic container is beter om een betere ventilatie mogelijk te maken. Vul de gaten met katoen om het ontsnappen van kleine larven te voorkomen.</li>
	<li>Om oppervlakteverontreinigingen uit de eieren te verwijderen, weekt u de eimassa gedurende 5 minuten in respectievelijk12 in 3% formaline en 0,2% benzalkoniumchlorideoplossing. Om darm- of intracellulaire bacteriën uit te roeien, gebruikt u een kunstmatig dieet aangevuld met 0,05% (w / w) Tetracycline hydrochloride of 0,06% (w / w) rifampicine in plaats van een normaal kunstmatig dieet (zie Tabel met materialen). OPMERKING: Deze stap is optioneel. Het is belangrijk om Silk Mate 2S en 0,05% (w / w) Tetracycline hydrochloride of 0,06% (w / w) rifampicine gelijkmatig te kneden voor consistentie.</li>
	<li>Verzamel de poppen uit de plastic container en onderscheid het geslacht op basis van morfologische12 kenmerken (figuur 1G-I). OPMERKING: Over het algemeen presenteren tortriciden 5-6 instars tot verpopping12. De larven H. magnanima en A. honmai doen er respectievelijk 3 weken en 2 weken over na het uitkomen tot de verpopping.</li>
	<li>Plaats 15 mannetjes en 10 vrouwtjes in een plastic doos (30 cm x 20 cm x 5 cm, figuur 1K) voor paring met 25 °C, 16 L/8 D. Verzamel eieren per 5-7 dagen en herhaal stappen 1,4-1,9. voor elke generatie. OPMERKING: Als het verzamelen van nieuw oviposited eimassa's voor latere analyse nodig is, stel dan het begin en einde van de donkere periode in, bijvoorbeeld van 9.00 tot 17.00 uur. In deze toestand leggen H. magnanima en A. honami meestal eicellen na 5 uur (14.00 uur).</li>
</ol>2. Scheiding van eieren en faraatlarven van eiermassa's voor fixatie, permeabilisatie en kleuring
<ol><li>Week de eimassa gedurende 10 minuten in 1.000 μL 1,2% natriumhypochloriet-waterige oplossing of gedurende 30 minuten in 1.000 μL 5 M kaliumhydroxide-waterige oplossing om de eieren te scheiden.</li>
	<li>Was de gescheiden eieren in 1.000 μL PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05% Polyoxyethyleen (20) Sorbitan Monolauraat [Tween-20] pH 7,4, zie Materialentabel) na het eerder gepubliceerde rapport7.</li>
	<li>Week eieren in een mengsel van 500 μL van 100% heptaan en 500 μL van 4% paraformaldehyde-PBSt oplossing (w/v). Mix gedurende 10 minuten bij 1.500 rpm met behulp van een vortexmixer.</li>
	<li>Week de eieren in een mengsel van 500 μL 100% heptaan en 500 μL 100% methanol. Mix gedurende 10 min bij 1.500 rpm.</li>
	<li>Was de eieren tweemaal met 1.000 μL 100% methanol en bewaar bij 4 °C in 100% methanol tot verdere experimenten (figuur 2A). LET OP: De eieren kunnen minstens 1 jaar bewaard worden bij 4 °C.</li>
	<li>Week de eieren achtereenvolgens in 99%, 70%, 50% ethanol en PBSt gedurende 5 minuten elk voor hydrofilisatie volgens het eerder gepubliceerde rapport7.</li>
	<li>Was de eieren met PBSt, dompel de eieren gedurende 5 minuten onder in 1 μg/ml DAPI-oplossing en was de eieren vervolgens tweemaal met 1x PBS. Week de eieren in 20 μL van 1,25% (w/w) melk-azijnoplossing (zie Tabel met materialen)11 om heterochromatine te visualiseren totdat de kernen een schitterende rode kleur vertonen (dit varieert van 5-60 min) (Figuur 2B,C). OPMERKING: De melkzuur-azijn orceïne kleuring periodes zijn afhankelijk van temperatuur en vochtigheid. Het is beter om te controleren op de juiste kleuring met behulp van een microscoop met 4x-10x vergroting.</li>
	<li>Breng de bevlekte eieren met een pipet over op een glazen schuif. Omsluit de bevlekte eieren met antifadereagens (zie Materiaaltabel) en een afdekglas7.</li>
	<li>Extraheer pharaat H. magnanima en A. honmai larven (4-5 dagen na ovipositie (dpo)) uit de eimassa's met behulp van een tang (figuur 2D). Bisectlarven op een glasplaat (figuur 2E).</li>
	<li>Fixeer alle weefsels (bijv. subofoesofageaal ganglion, thoracale ganglia, malpighian tubulus, enz.) met een mengsel van 1:3 (v/v) 99,7% azijnzuur/100% methanol gedurende 5 minuten. Kleur die met 1,25% (w / w) melkzuur-azijnoplossing11 totdat de kernen zijn gekleurd (dit kan 5-60 minuten duren, afhankelijk van de temperatuur en vochtigheid).</li>
	<li>Bepaal het geslacht van elk monster door de aanwezigheid (vrouwelijk) of afwezigheid (mannelijk) van heterochromatine (het W-chromosoom, figuur 2F, G) onder een microscoop te observeren. OPMERKING: Het geslacht wordt bepaald door het geslacht chromatine te visualiseren. Elke cel vertegenwoordigt het geslacht chromatine als een stip in vrouwtjes11,12, terwijl het resterende deel van faraat larvale weefsels (niet gefixeerd) onmiddellijk moet worden ondergedompeld in cellysisbuffer12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA en 1% SDS, pH 8,0) of fenolbevattende RNA-extractiereagentia voor DNA- of RNA-extractiereagentia. Geef vóór de dissecties vooraf 20 μL van de reagentia af in PCR-buizen van 0,2 ml (figuur 3A). Dompel de monsters onder en bewaar ze bij -80 °C tot verdere extractie. De monsters kunnen minstens 3 maanden worden bewaard, maar het is beter om door te gaan met de stroomafwaartse experimenten om de afbraak van nucleïnezuren te voorkomen.</li>
</ol>3. DNA- en RNA-extracties uit geslachtsbepaalde faraatlarven
<ol><li>Pool 12 geslachtsbepaalde mannelijke of vrouwelijke faraatlarven (5 dpo-embryo) en voeg cellysisbuffer of RNA-extractiereagentia (zie stap 2.11 en Tabel met materialen) toe aan één buis van 1,5 ml. OPMERKING: Volg stap 3.2-3.7 voor DNA-extractie en stap 3.8-3.11 voor RNA-extractie.</li>
	<li>Homogeniseer weefsels in 600 μL van de cellysisbuffer (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA en 1% SDS, pH 8,0) en centrifugeer de monsters bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Verzamel het supernatant (500 μL) met behulp van een pipet en incubeer bij 50 °C met 1,5 μL Proteinase K (20 mg/ml, zie Materiaaltabel) gedurende 5 uur op een warmteblok.</li>
	<li>Behandel de monsters met 1,0 μl 10 mg/ml RNase-oplossing (zie materiaaltabel) bij 37 °C gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Voeg 200 μL eiwitprecipitatieoplossing (zie materiaaltabel) toe aan de buis7, gevolgd door een centrifuge bij 17.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Meng het supernatant (500 μL) met 500 μL 100% isopropanol en centrifugeer vervolgens bij 20.400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Was het gepelleteerde DNA tweemaal met 1.000 μL 70% ethanol. Vervolgens, aan de lucht drogen (5-10 min bij kamertemperatuur), los het DNA op in 30 μL van 10 mM Tris-Cl buffer (pH 8,5).</li>
	<li>Homogeniseer de weefsels in 600 μL RNA-extractiereagentia en voeg 240 μL ultrazuiver gedestilleerd water toe aan de buis. Centrifugeer de buizen bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Meng het supernatant (600 μL) met 600 μL 100% isopropanol en breng het mengsel over in een silica spinkolom (zie Tabel met materialen). Centrifugeer de buizen bij 17.900 x g gedurende 1 min bij 4 °C.</li>
	<li>Was de kolom met 750 μL 70% ethanol en centrifugeer de kolom tweemaal bij 17.900 x g gedurende 1 minuut elk bij 4 °C.</li>
	<li>Laad 15 μL ultrazuiver gedestilleerd water op de kolom. Centrifugeer de buisjes bij 17.900 x g gedurende 1 min bij 4 °C om het RNA te elueren.</li>
	<li>Bereken en verifieer de kwaliteit en kwantiteit van DNA en RNA met behulp van een UV-gebaseerde spectrofotometer. Beoordeel de zuiverheid van nucleïnezuren met behulp van de verhoudingen A260/A280 (nucleïnezuren/eiwitten) en A260/A230 (nucleïnezuren/zouten en andere verontreinigingen)13. OPMERKING: Voor RNA-extractie werd de eerder gepubliceerde procedure12 gevolgd, wat resulteerde in fenolbesmetting (tabel 1). Het geëxtraheerde DNA en RNA van een enkel embryo of faraatlarven levert monsters van lage hoeveelheid en lage kwaliteit op. Typisch levert DNA-extractie uit 12 faraatlarven 100-600 ng op, terwijl RNA-extractie met behulp van de huidige methode 900-1.500 ng genereert, zoals tabel 1 laat zien. OPMERKING: Stappen 3.13-3.15 zijn optioneel voor verdere testen van sequencings met hoge doorvoer.</li>
	<li>Bereken de hoeveelheden DNA en RNA met behulp van een op fluorescentie gebaseerde spectrofotometer. OPMERKING: De verhouding tussen RNA-grootheden (UV-gebaseerde concentratie (ng/μL)/fluorescentieconcentratie (ng/μL)) werd berekend om de kwaliteit voor verdere experimentele toepassing te beoordelen. Wanneer bijvoorbeeld uv- en fluorescentieconcentraties respectievelijk 80 ng / uL en 60 ng / uL zijn, is de verhouding 1,5 (80/60). Gewoonlijk geven verhoudingen onder 1,5 voldoende zuiverheid aan voor downstream-toepassingen met behulp van high throughput sequencing13.</li>
	<li>Analyseer de kwaliteit van RNA met behulp van microchip-elektroforese14.</li>
	<li>Gebruik de gekwalificeerde RNA's om de RNA-bibliotheek voor te bereiden met behulp van een RNA-bibliotheekvoorbereidingskit (zie Tabel met materialen). Rangschik de bibliotheken met behulp van een platform dat geschikt is voor de voorbereide bibliotheken.</li>
</ol>

<ol><li>Gaston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+magnitude+of+global+insect+species+richness%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Biology%22%5BJournal%5D)">The magnitude of global insect species richness.</a> Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).</li>
<li>Pogue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+world+revision+of+the+genus+Spodoptera+Guen%C3%A9e+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Memoirs+of+the+American+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1(2002).</li>
<li>Matsuura, H., Naito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+cold-hardiness+and+overwintering+of+Spodoptera+litura+F.+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%3A+VI.+Possible+overwintering+areas+predicted+from+meteorological+data+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Entomology+and+Zoology%22%5BJournal%5D)">Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan.</a> Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).</li>
<li>Mita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+an+EST+database+for+Bombyx+mori+and+its+application%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The construction of an EST database for Bombyx mori and its application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).</li>
<li>Kawamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+genome+assembly+of+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).</li>
<li>Fukui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+masculinizing+function+of+the+Ostrinia+furnacalis+Masculinizer+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).</li>
<li>Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+disperse+eggs+from+lepidopteran+scale-like+egg+masses+and+to+observe+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Entomological+Science%22%5BJournal%5D)">A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis.</a> Entomological Science. 25 (1), 12497(2022).</li>
<li>vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avander+Geest%2C+LP+%22Tortricid+pests%3A+their+biology%2C+natural+enemies+and+control%22">Tortricid pests: their biology, natural enemies and control</a>. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).</li>
<li>Kiuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+female-specific+piRNA+is+the+primary+determiner+of+sex+in+the+silkworm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm.</a> Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).</li>
<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li>
<li>Kageyama, D., Traut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+sex-specific+effects+of+Wolbachia+and+interference+with+the+sex+determination+of+its+host+Ostrinia+scapulalis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis.</a> Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).</li>
<li>Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+male-killing+and+nonmale-killing+Wolbachia+strains+in+the+oriental+tea+tortrix+Homona+magnanima%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima.</a> Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).</li>
<li>Schalamun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+MinION%3A+An+example+of+how+to+establish+long-read+sequencing+in+a+laboratory+using+challenging+plant+tissue+from+Eucalyptus+pauciflora%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora.</a> Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).</li>
<li>Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+insect+RNA+look+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Why does insect RNA look degraded.</a> Journal of Insect Science. 10 (1), 159(2010).</li>
<li>Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inbreeding+in+Mimulus+guttatus+on+tolerance+to+herbivory+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments.</a> Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).</li>
<li>Saccheri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+and+extinction+in+a+butterfly+metapopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation.</a> Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).</li>
<li>Crnokrak, P., Roff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+depression+in+the+wild%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Inbreeding depression in the wild.</a> Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).</li>
<li>Keller, L. F., Waller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+effects+in+wild+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Inbreeding effects in wild populations.</a> Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).</li>
<li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).</li>
<li>Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+male-killing+Wolbachia+carries+a+feminizing+factor+and+is+associated+with+degradation+of+the+sex-determining+system+of+its+host%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host.</a> Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Tortricid bestaat uit verschillende land- en bosbouwplagen; de huidige studie presenteerde methoden om tortrix generaties lang te kweken, embryogenese en geslacht van de insecten te observeren en moleculaire analyse uit te voeren met behulp van gerijpte embryo's.
Een van de obstakels voor ongedierte-insectenstudie is het vaststellen van opfokmethoden. Vooral inteelt heeft soms een negatieve invloed op de fitheid van de soort. De fitheidsvermindering door de inteelt, inteeltdepressie genaamd, i...

Lepidopteran insecten vertegenwoordigen meer dan 10% van alle beschreven levende soorten1, en bepaalde taxa soorten veroorzaken ernstige schade aan planten en ernstige landbouwverliezen 2,3. Hoewel moleculaire en genetische studies zijn ontwikkeld met behulp van modelinsecten zoals de zijderups Bombyx mori 4,5, blijven plaaginsecten onbeproefd, mede vanwege de moeilijkheden voor het fokken en hanterenvan 6,7. Daarom zijn fundamentele studies en technieken nodig om de biologie van dergelijke niet-model plaaginsecten te begrijpen.
De Tortricidae (Lepidoptera), algemeen bekend als tortrix of bladrollermotten, omvat veel land- en bosbouwplagen8. Van de insectentaxa zijn de oosterse theeschildpad Homona magnanima Diakonoff en de zomerfruittort Adoxophyes honmai Yasuda ernstige polyfagote plagen waarvan bekend is dat ze theebomen in Oost-Azië beschadigen7. De twee soorten leggen platte en ovale schubachtige eierclusters (of eimassa's) bestaande uit dunne, zachte en fragiele eieren bedekt met maternale afscheidingen. Hoewel embryogenesestadia cruciaal zijn voor de ontwikkeling van insecten en geslachtsbepalingen9, verhinderen structuren van de eieren verdere analyse om de biologie van de insecten te begrijpen. Het is belangrijk om de moeilijkheden te overwinnen voor verder onderzoek naar plagen die zo'n complexe eimassa verankeren.
Hier, om de biologie van tortriciden te begrijpen, zijn methoden voor massa-opfok, observaties en moleculaire studies ontwikkeld met behulp van A. honmai en H. magnanima. Ten eerste onderhouden massafokmethoden beide tortriciden gedurende 100 generaties door inteelt. De scheiding van eieren van de aaneengeschakelde schubachtige eimassa vergemakkelijkte embryogenese-observatie van de tortriciden met behulp van alkalische en organische oplosmiddelen die eerder waren ontwikkeld op basis van technieken die bij vliegenwerden gebruikt 10. Bovendien stelde de huidige studie geslachtsdiscriminatie van kleine embryo's vast door kleuringsmethoden van het geslachtschromatine van lepidoptera-vrouwtjes te ontwikkelen met behulp van melkzuur-azijn orceïne11. Door deze methoden te combineren, werden nucleïnezuren van hoge kwaliteit en kwantiteit geëxtraheerd uit geslachtsbepaalde embryo's, wat anders moeilijk vast te stellen was6. Het geëxtraheerde RNA werd gebruikt voor sequencing van de volgende generatie. Gezamenlijk zijn de hier gepresenteerde methoden van toepassing op andere lepidoptera-insecten en andere insectentaxa.

<table><tbody><tr><td>1/2 ounce cup</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070009</td><td>insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/</td></tr><tr><td>1/2 ounce cup lid</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070011</td><td>insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether</td></tr><tr><td>99.7% acetic acid</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>36289</td><td>fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>not shown</td><td>Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument</td></tr><tr><td>Agilent RNA6000 nano kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td>Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf</td></tr><tr><td>benzalkonium chloride solution</td><td>Nihon Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>No.4987123116046</td><td>Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html</td></tr><tr><td>Cotton</td><td>AOUME</td><td>8-1611-02</td><td>insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&amp;sc2id=af_113_0_1</td></tr><tr><td>DAPI solution</td><td>Dojindo, Tokyo, Japan</td><td>340-07971</td><td>stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/</td></tr><tr><td>Disodium Hydrogenphosphate</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html</td></tr><tr><td>dsDNA HS quantification kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231</td><td>Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230</td></tr><tr><td>Econospin RNA II column</td><td>Epoch Life Science Inc.</td><td>EP-11201</td><td>RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html</td></tr><tr><td>Ethylenediamine-N,N,N'N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA)</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html</td></tr><tr><td>Glassine paper</td><td>HEIKO</td><td>2100010</td><td>insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&amp; utm_medium=cpc&amp;utm_source= Adw</td></tr><tr><td>heat block WSC-2620 PowerBLOCK</td><td>ATTO, Tokyo, Japan</td><td>4002620</td><td>incubation; https://www.attoeng.site/</td></tr><tr><td>heptane</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html</td></tr><tr><td>INSECTA LF</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>not shown</td><td>Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>ISOGENII</td><td>Nippon Gene</td><td>311-07361</td><td>RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html</td></tr><tr><td>isopropanol</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html</td></tr><tr><td>Lactic acid</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html</td></tr><tr><td>methanol</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html</td></tr><tr><td>MSV-3500 vortex</td><td>Biosan</td><td>BS-010210-TAK</td><td>Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/</td></tr><tr><td>Nano Photometer NP 80</td><td>Implen</td><td>not shown</td><td>Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/</td></tr><tr><td>Natural pack wide</td><td>Inomata chemical</td><td>1859</td><td>insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%KB%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%83%E3%83%90</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7770S</td><td>Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039</td></tr><tr><td>orcein</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>160-16061</td><td>fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html</td></tr><tr><td>Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html</td></tr><tr><td>Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength)</td><td>Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan</td><td>not shown</td><td>Insect collection; http://www.southwalker

massa-opfok en moleculaire studies in tortricidae plaaginsecten

Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects

Tortricidae (Lepidoptera), algemeen bekend als tortrix of bladrollermotten, bevat veel land- en bosbouwplagen, die ernstige landbouwverliezen veroorzaken. Om de biologie van dergelijke plaagmotten te begrijpen, zijn fundamentele technieken erg in trek geweest. Hier worden methoden voor massa-opfok, observaties en moleculaire studies ontwikkeld met behulp van twee theetort, Homona magnanima en Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Insecten werden massaal gekweekt met gesneden kunstmatig dieet en onderhouden door inteelt gedurende meer dan 100 generaties door rekening te houden met hun biologische kenmerken. Insecten hebben verschillende geslachtsdimorfismen; daarom is het moeilijk om het geslacht te onderscheiden tijdens de ontwikkelingsstadia, die latere assays hebben voorkomen. Het huidige werk benadrukte dat het geslacht van tortricidslarven kon worden bepaald door testikels of melk-azijnachtige orceïnekleuring te observeren om het vrouwspecifieke W-chromosoom te visualiseren. Bovendien maakte de huidige studie, met behulp van de geslachtsbepalingsmethoden, nucleïnezuurextracties uit geslachtsbepaalde embryo's en toepassing op high throughput sequencing mogelijk. Deze tips zijn toepasbaar op andere plaaginsecten en zullen verdere morfologische en genetische studies vergemakkelijken.

Opzetten van host lines en het onderhoud ervan De levensvatbaarheid van in het veld verzamelde larven wordt anders toegeschreven aan veldlocatie, seizoenen en opfokomstandigheden (bijv. 90% van de levensvatbaarheid in Taiwan, Taoyuan, zoals weergegeven in Arai et al.12). Ongeveer 30% -50% van de paren zal zoals gewoonlijk de volgende generatie genereren. Voor H. magnanima en A. honmai worden matrilines al meer dan 100 generaties onderhouden door inteelt.
<...

Het huidige protocol beschrijft de kweekmethode van tortricid plaaginsecten in de laboratoria. De procedures om het geslacht van insecten te onderscheiden en nucleïnezuren te extraheren voor sequencing met hoge doorvoer worden vastgesteld met behulp van twee tortricid-plagen.

Massa-opfok en moleculaire studies in Tortricidae plaaginsecten

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural ...

We presenteren fundamentele, maar zeer veelgevraagde massa's voor massale opfok, observaties en moleculaire studies met behulp van ernstige plaag Tortrix-massa's, om hun biologie te bestuderen. Tot nu toe heeft de structuur van de insecteneieren verdere analyse verhinderd. Met name hebben we de studie mogelijk gemaakt van dunne, zachte en fragiele eieren bedekt met maternale secretie.Er worden eenvoudige technieken verwacht toepasbaar te zijn voor verder onderzoek naar tortrix, het proberen van andere insecten en andere taxa. Begin met het plaatsen van een vrouwtje en twee mannetjes in een plastic beker van 120 milliliter met een stuk paraffinepapier om een Matra-lijn te vestigen. Snijd ongeveer 60 gram kunstmatige diëten met behulp van een rasp voor massale opfok.Plaats de eimassa gevuld met gerijpte embryo's op het gesneden kunstmatige dieet in een plastic container. Leg paraffinepapierjes op de eimassa met de gesneden diëten. Plaats 15 mannetjes en 10 vrouwtjes in een plastic doos om te paren bij 25 graden Celsius.Verzamel eieren om de vijf tot zeven dagen en herhaal massale opfokstappen voor elke generatie. Week de eimassa in 1000 microliter 1,2% natriumhypochloriet-waterige op

mass-rearing-and-molecular-studies-in-tortricidae-pest-insects

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Om populatieonderdrukking van Aedes aegypti te bereiken met behulp van het RIDL® (Release of Insects carrying a Dominant Lethal) systeem, moeten grote aantallen mannelijke muggen worden vrijgelaten. Dit vereist het gebruik van massaopfoktechnieken en -technologie om betrouwbare systemen te bieden om het maximale aantal mannelijke muggen van hoge kwaliteit te verkrijgen.

Massaproductie van genetisch gemodificeerde Aedes aegypti voor veldreleases in Brazilië

Protocollen voor een efficiënte bereiding van homogene monsters van spintmijten, aantasting van experimentele installaties, en beoordeling van plantaardige schade, zoals vereist voor studies van planten-plaaginteractie werden ontwikkeld.

Toepassing van twee-gespot spintmijt<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; Voor Plant-pest Interaction Studies

Hier presenteren we protocollen voor het kweken van een intermediair-kiem kever, Dermestes maculatus (D. maculatus) in het lab. We hebben ook protocollen voor de embryonale en ouderlijke RNAi en methodes te delen voor het analyseren van embryonale fenotypes voor bestudering van genfunctie in deze soort.

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever, Dermestes maculatus

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s

Leven tabellen toestaan van kwantificering van de bronnen en de tarieven van sterfte in de insectenbevolking en bijdragen aan het begrijpen, voorspellen en manipuleren van de populatiedynamiek in agro-ecosystemen. Methoden voor het uitvoeren en analyseren van de cohort gebaseerde leven tabellen in het veld voor een insect met sessiele onvolwassen levensstadia worden gepresenteerd.

Methodologie voor ontwikkeling van leven tabellen voor sessiele insecten in het veld met de wittevlieg, Bemisia tabaci, in katoen als een modelsysteem

We bieden een gedetailleerd protocol voor het fokken, micro-injectie van eieren en voor een efficiënte paring van de firebrat Thermobia domestica om mutante stammen te genereren en te onderhouden na genoombewerking.

Ei micro-injectie en efficiënte paring voor genoombewerking in de Firebrat Thermobia domestica

Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.

Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Dit artikel schetst basismethoden om belangrijke factoren zoals dichtheid, voerbeschikbaarheid, hydratatiebron en omgevingscontroles te standaardiseren voor het langdurig kweken van laboratoriumculturen van de eetbare krekel, Gryllus bimaculatus.

Het onderhouden van laboratoriumculturen van Gryllus bimaculatus, een veelzijdig orthopteraanmodel voor insectenlandbouw en ongewervelde fysiologie

Het protocol demonstreert een eenvoudige en gemakkelijke dissectiemethode, geschikt voor wildtype migrerende vrouwelijke insecten die zijn gevangen met zoeklichtvallen. Deze techniek kan dezelfde soort aanzienlijk ophelderen door beide voortplantingsweefsels te vergelijken, namelijk de paringszak en de ovariële ontwikkeling van vrouwelijke insecten van het wildtype.

Dissectie en classificatie van de ontwikkeling van de eierstokken bij vrouwelijke insecten van het wildtype

Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van entomopathogene schimmels van een boshoutboorder en een vervangende manier om hun entomopathogene activiteiten te evalueren met behulp van een Coleoptera-modelinsect. Deze methode is efficiënt en handig voor het verkennen van entomopathogene schimmelbronnen van houtborende insectenplagen in natuurlijke bossen.

Isolatie, gedragsidentificatie en pathogeniteitsbeoordeling van entomopathogene schimmels van een boshoutboorder

Leer massa-opfok en moleculaire studies van Tortricidae plaaginsecten met kunstmatige diëten en nucleïnezuurextractie. Deze methoden ondersteunen onderzoek naar biologie en gewasbescherming.

Massa-opfok en moleculaire studies in Tortricidae plaaginsecten

Meer video's verkennen