Licht-geïnduceerde in situ transmissie elektronenmicroscopie voor observatie van de interactie tussen vloeistof en zachte materie

Het protocol presenteert hoe de combinatie van vloeibare cel TEM en lichtverlichting kan worden gebruikt om de structurele veranderingen in de bacteriën te observeren die zijn ingekapseld met fotosensitizer bij lichtverlichting. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud. Het protocol vereist geen moeilijke monstervoorbereiding en biedt voldoende inkapseling van bacteriën met fotosensitizeroplossing.

Wijzig om te beginnen de transmissie-elektronenmicroscoop door de optische vezel aan te sluiten op de microscoopkolom aan de bovenkant van de objectieflens. Houd rekening met een paar centimeter ruimte tussen de objectieflens en de condensorlens, plus een vrije sleuf voor accessoires. Plaats twee onbehandelde TEM-roosters bedekt met amorf koolstof tussen twee gekruiste pincetten, gericht op de met koolstof gecoate kant naar boven.

Houd de roosters zo dicht mogelijk bij de rand. Plaats vier microliter bacterie-oplossing op een van de roosters. De optische dichtheid van het monster moet tussen vijf en 10 liggen.

Wacht 60 seconden en dep de vloeistof voorzichtig met filterpapier. Probeer de vloeistof tijdens het proces over het hele roosteroppervlak te verspreiden. Plaats vier microliter fotosensitizer op hetzelfde rooster.

Veeg na vijf seconden de vloeistof eruit. Laat een zeer dunne laag vloeistof achter op het substraat. Plaats het droge rooster snel bovenop het rooster dat bedekt is met vloeistof.

Verplaats het bovenste raster voorzichtig naar de rand van het tweede raster en knijp de substraten aan de randen met een pincet. Herhaal voorzichtig het knijpen. Laat de vloeistofcel tussen het pincet een minuut staan.

Steek het monster direct na het voltooien van de bereiding in de TEM-houder. Nadat u het monster in de microscoop hebt geplaatst, start u de waarnemingen in de modus met lage vergroting om een geschikt observatiegebied te vinden. Houd tijdens de waarnemingen de elektronendosis zo laag mogelijk.

Breid de belichtingstijd uit. Zoek de cellen omringd door vloeistof met de juiste vergroting met langere belichtingstijd en leg onmiddellijk het eerste beeld vast. Houd de elektronendosis constant en verzamel elke 30 seconden beelden om de veranderingen te observeren.

Onderzoek de beelden zorgvuldig en bereken de totale elektronendosis die overeenkomt met de eerste zichtbare veranderingen in de cellen. Voordat u het experiment start, stelt u de intensiteit van het laserlicht in door de huidige waarde aan te passen. Plaats het monster in de microscoop en zoek het observatiegebied.

Leg het eerste beeld van de cel vast voordat u begint met het verlichten van het monster en gebruik de beam blanker om de elektronenbundel uit te schakelen om de effecten van elektronenbestraling te voorkomen. Schakel de laser in. Begin met een korte verlichtingstijd, omdat het laserlicht een relatief hoge intensiteit heeft.

Schakel na die tijd de lichtbron uit. Schakel de beam blanker uit en leg het beeld onmiddellijk vast. Gebruik indien mogelijk een automatisch algoritme om het monster alleen weer te geven voor de tijd die nodig is voor het maken van de afbeelding.

Meet zorgvuldig de elektronenbestralingstijd om de elektronendosis te berekenen die wordt gebruikt voor beeldvorming. Een opmerkelijke degradatie van de buitenste laag van de cel veroorzaakt door de reactieve zuurstofsoort gegenereerd door lichtere straling van de fotosensitizer na één minuut wordt waargenomen. Verdere lichtverlichting maakte de veranderingen beter zichtbaar.

Goede observatieplekken met voldoende vloeistof kunnen gemakkelijk worden gevonden bij lage vergroting, omdat deze gebieden donkerder en waziger lijken. De met vloeistof bedekte bacteriën zijn minder zichtbaar dan de droge, maar kunnen nog steeds worden onderscheiden. Het is nuttig om tijdens de beeldvorming naar de vloeistofgrens te kijken en de beweging ervan kan gemakkelijk worden gedetecteerd, wat impliceert dat het gekozen gebied ongeschikt en onstabiel kan zijn.

Een ander probleem tijdens observaties is de verdamping van het water en de neerslag van de oplossing die kan optreden in willekeurige delen van het monster, inclusief de gebieden rond de bacteriën. Inkapseling van bacteriën kan ook worden uitgevoerd met behulp van grafeen en siliciumnitraatmembranen. De monstervoorbereiding is moeilijker, maar de stabiliteit van de vloeibare cel zal beter zijn.

De gepresenteerde methode kan worden gebruikt voor observaties van door licht geïnduceerde reacties op vloeistof. Bijvoorbeeld de invloed van licht op metalen materialen, door licht geïnduceerde katalysatoren en fotochemische reacties.