Name: Licht-geïnduceerde in situ transmissie elektronenmicroscopie voor observatie van de interactie tussen vloeistof en zachte materie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Leer licht-geïnduceerde in situ transmissie elektronenmicroscopie voor observatie van bacteriële interacties met fotosensitizer. Deze methode vereist minimale samplevoorbereiding en maakt real-time monitoring van structurele veranderingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het onderzoek werd ondersteund door de Miniatura-subsidie (2019/03/X/NZ3/02100, National Science Center, Polen).

1. Transmissie elektronenmicroscoop modificatie
<ol><li>Wijzig de transmissie-elektronenmicroscoop door de optische vezel (zie tabel met materialen) aan te sluiten op de microscoopkolom bovenaan de objectieflens. Houd rekening met een paar centimeter ruimte tussen de objectieflens en de condensorlens, plus een vrije sleuf voor accessoires. OPMERKING: Een speciale monsterhouder4 of een houder voor cathodoluminescente waarnemingen in omgekeerde configuratie1 kan ook worden gebruikt.</li>
	<li>Controleer het systeem op lekken met behulp van ruwe vacuümpompen. Als het systeem geen vacuümlek vertoont, test het systeem dan onder een hoog vacuüm.<ol><li>Controleer of de bediening van het vacuümsysteem niet afwijkt van de standaard geventileerde microscoopstart. Neem in geval van problemen met de uitvoering, montage of inbedrijfstelling van de module contact op met geautoriseerd servicepersoneel of de fabrikant van het apparaat. OPMERKING: De correct gemaakte en gemonteerde illuminator zal de elektronenbundel niet verduisteren. Als de bundel tijdens de werking van de microscoop achtereenvolgens verschuift, zal de niet-geleidende optische vezel niet voldoende bedekt zijn met een metalen afscherming en een elektrische lading accumuleren. Schuif in dit geval de optische vezel diep in de geleidende mantel.</li>
	</ol></li>
	<li>Meet de lichtintensiteit met behulp van de fotodiode vermogenssensor (zie Materiaaltabel). Als de ruimte tussen de poolstukken van de objectieflens geen meting in de microscoop mogelijk maakt, meet dan de geometrie van het monster en de illuminator en reproduceer deze omstandigheden in een externe meetopstelling.</li>
	<li>Als de microscoop niet is uitgerust met een elektronendosismeetsysteem, voert u de kalibratie uit door de bundelstroom te meten met een Faraday-beker (zie Materiaaltabel) en numeriek de dichtheid te berekenen van elektronen die het monster raken27.</li>
</ol>2. Inkapseling van bacteriën met de fotosensitizer
<ol><li>Plaats twee onbehandelde TEM-roosters bedekt met amorf koolstof tussen twee gekruiste pincetten die naar de koolstofgecoate kant naar boven zijn gericht. Houd de roosters zo dicht mogelijk bij de rand. OPMERKING: Voor bepaalde substraat-, oplossings- en monstercombinaties kan het nuttig zijn om gloeiafscheiding op een of beide mazen te gebruiken om fabrieksonzuiverheden te verwijderen en een maximaal hydrofiel oppervlak te verkrijgen28. Aan de hand van het voorbeeld van S. aureus-bacteriën en methyleenblauwoplossing werd vastgesteld dat de beste en meest reproduceerbare resultaten werden verkregen op nieuwe, niet-behandelde koolstof op koperen roosters zonder extra gloetinthoot of plasmareiniging6.</li>
	<li>Plaats 4 μL bacterie-oplossing op een van de roosters. De optische dichtheid van het monster moet tussen 5 en 10 liggen. OPMERKING: De bacteriën die in het onderzoek werden gebruikt, werden gezuiverd uit de cultuur en verspreid in PBS-buffer. Het wordt ten zeerste aanbevolen om de concentratie van bacteriën in het verse monster elke keer te controleren, bijvoorbeeld met behulp van negatieve kleuringsmethoden, volgens de vastgestelde beschikbare protocollen 29,30,31.</li>
	<li>Wacht 60 s en dep de vloeistof voorzichtig met filterpapier. Probeer de vloeistof tijdens dit proces over het hele roosteroppervlak te verspreiden.</li>
	<li>Leg 4 μL fotosensitizer op hetzelfde rooster. OPMERKING: Methyleenblauw in een concentratie van 2 μg/ml werd gebruikt als fotosensitizer voor deze studie.</li>
	<li>Na 5 s, veeg de vloeistof uit. Laat een zeer dunne laag vloeistof achter op het substraat.</li>
	<li>Plaats het droge rooster snel bovenop het rooster dat bedekt is met vloeistof.</li>
	<li>Verplaats het bovenste rooster voorzichtig naar de rand van de tweede en knijp de substraten aan de randen met een pincet. OPMERKING: In dit stadium kan er wat vloeistof uit het monster stromen, wat betekent dat er niet genoeg is afgetapt. Dit betekent echter niet noodzakelijkerwijs dat de vorming van de vloeibare cel niet succesvol zal zijn.</li>
	<li>Herhaal voorzichtig het knijpen. OPMERKING: Het is gemakkelijker om deze stap uit te voeren door het pincet 90 ° te draaien, zodat ze loodrecht op de tafel liggen en de uiteinden van beide pincetten op dezelfde hoogte blijven, niet afhankelijk van de open / sluitpositie.</li>
	<li>Laat de vloeistofcel tussen het pincet 1 min staan.</li>
	<li>Steek het monster direct na het voltooien van de bereiding in de TEM-houder. OPMERKING: De spanning van de montageplaat/ring van de houder helpt de substraten om zich te hechten en de vloeistof binnen te houden.<ol><li>Pomp indien mogelijk de monsterhouder in een extern pompstation om de vervuiling van de microscoop door vloeistof te verdampen te verminderen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. In situ TEM-waarnemingen van bacteriële cellen in vloeistof-elektrondosiseffect
<ol><li>Plaats het monster in de microscoop.</li>
	<li>Start de waarnemingen in de modus met lage vergroting om een geschikt waarnemingsgebied te vinden. OPMERKING: Donkere gebieden zijn waarschijnlijk vloeibaar vanwege verstrooiing van elektronenbundels.<ol><li>Houd tijdens de waarnemingen de elektronendosis zo laag mogelijk. Breid de belichtingstijd uit (tot 2 s voor een versnellende spanning van 150 kV en een vergroting van 5.000x). De vergroting van 5.000x voor de bottom-mount camera (geschatte beeldhoek is 10 μm) is voldoende om bacteriën met een diameter van ~1 μm in beeld te brengen. OPMERKING: Soms is het niet gemakkelijk om de vloeistof te onderscheiden, dus aan het begin van de waarnemingen is het nuttig om de elektronenbundel te concentreren waar deze waarschijnlijk vloeibaar is. De vloeistof moet bewegen op een gerichte elektronenbundel en de bellen zullen verschijnen. Na deze verificatie is het noodzakelijk om een ander gebied te vinden voor verdere waarnemingen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zoek de cellen omringd door vloeistof op de juiste vergroting met langere belichtingstijd en leg de eerste afbeelding onmiddellijk vast. Houd de elektronendosis constant en verzamel elke 30 s beelden om de veranderingen waar te nemen.</li>
	<li>Onderzoek de beelden zorgvuldig en bereken de totale elektronendosis27 die overeenkomt met de eerste zichtbare veranderingen in de cellen.</li>
</ol>4. In situ TEM-waarnemingen van door licht geïnduceerde processen tussen bacteriële cellen en fotosensitizer
<ol><li>Voordat u het experiment start, stelt u de intensiteit van het laserlicht in door de huidige waarde aan te passen. Kies de juiste golflengte op basis van het absorptiespectrum van de fotosensitizer. Kies volgens de vorige kalibratieplot (stap 1.4.) de huidige waarde die overeenkomt met de laagste lichtintensiteit. OPMERKING: De lichtgolflengte die in deze studie werd gebruikt, was 660 nm.</li>
	<li>Plaats het monster in de microscoop en zoek het observatiegebied na stap 3.2. in de vorige sectie.</li>
	<li>Leg het eerste beeld van de cel vast voordat u begint met het verlichten van het monster en gebruik de beam blanker om de elektronenbundel uit te schakelen om de effecten van elektronenbestraling te voorkomen.</li>
	<li>Schakel de laser in. Begin met een korte verlichtingstijd (hier 30 s) omdat het laserlicht een relatief hoge intensiteit heeft. Schakel na die tijd de lichtbron uit.</li>
	<li>Schakel de beam blanker uit en leg het beeld onmiddellijk vast. Gebruik indien mogelijk een automatisch algoritme om het monster alleen weer te geven voor de tijd die nodig is voor het maken van de afbeelding. Meet zorgvuldig de elektronenbestralingstijd om de elektronendosis27 te berekenen die wordt gebruikt voor beeldvorming.</li>
	<li>Herhaal stap 4.4. en stap 4.5. om de verwachte lichtverlichtingstijd te verkrijgen.</li>
</ol>

<ol><li>Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+observation+of+plasmon-controlled+photocatalytic+dehydrogenation+of+individual+palladium+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).</li>
<li>Weng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+light-induced+dynamic+structural+transformations+of+Au+clusters-based+photocatalyst+via+in+situ+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM.</a> Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).</li>
<li>Cao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+TEM+investigation+on+ultrafast+reversible+lithiation+and+delithiation+cycling+of+Sn%40C+yolk-shell+nanoparticles+as+anodes+for+lithium+ion+batteries%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Energy%22%5BJournal%5D)">In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries.</a> Nano Energy. 40, 187-194 (2017).</li>
<li>Cavalca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+transmission+electron+microscopy+of+light-induced+photocatalytic+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions.</a> Nanotechnology. 23 (7), 075705(2012).</li>
<li>Tung, C. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+adaptive+junction+for+efficient+solar-driven+oxygen+evolution%3A+In+situ+unraveling+the+interfacial+metal-silicon+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Energy+Materials%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction.</a> Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308(2019).</li>
<li>Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy%3A+Novel+approach+for+antimicrobial+photodynamic+therapy+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463(2021).</li>
<li>Shindo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+multifunctional+TEM+specimen+holder+equipped+with+a+piezodriving+probe+and+a+laser+irradiation+port%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port.</a> Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensing+performance+of+branched+CdS%2FZnO+heterostructures+as+revealed+by+in+situ+TEM+and+photodetector+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests.</a> Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistically+analyzed+photoresponse+of+elastically+bent+CdS+nanowires+probed+by+light-compatible+in+situ+high-resolution+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM.</a> Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).</li>
<li>Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+observation+of+photodecomposition+process+of+poly-hydrocarbons+on+catalytic+TiO2+films%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films.</a> Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).</li>
<li>Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+of+photocatalytic+reactions+by+excited+electrons+in+ionic+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).</li>
<li>Textor, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+preparing+graphene+liquid+cells+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).</li>
<li>Ring, E. A., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).</li>
<li>Inayoshi, Y., Minoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carbon+sandwich+environmental+cell+for+wet+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A carbon sandwich environmental cell for wet specimens.</a> Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).</li>
<li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+electron+microscopy+using+graphene+veils%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Live cell electron microscopy using graphene veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li>
<li>De Jonge, N., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Live cell electron microscopy is probably impossible.</a> ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).</li>
<li>Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+electron-beam-irradiated+bacteria+in+reply+to+%26%2334%3Blive+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to &#34;live cell electron microscopy is probably impossible.&#34.</a> ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).</li>
<li>Alves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+on+bacterial+cellular+targets+of+photodynamic+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation.</a> Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).</li>
<li>Cieplik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+photodynamic+therapy-What+we+know+and+what+we+don%27t%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't.</a> Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+and+Type+II+mechanisms+of+antimicrobial+photodynamic+therapy%3A+An+in+vitro+study+on+gram-negative+and+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).</li>
<li>Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Escherichia+coli+photodynamic+inactivation+by+an+amphiphilic+tricationic+porphyrin+and+5%2C10%2C15%2C20-tetra%284-N%2CN%2CN-trimethylammoniumphenyl%29+porphyrin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+and+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).</li>
<li>Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+synthesis+of+a+cyclic+antimicrobial+peptide-conjugated+phthalocyanine+for+synergistic+chemo-photodynamic+killing+of+multidrug-resistant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria.</a> Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).</li>
<li>Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+fluorescence+imaging+to+evaluate+the+effect+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+depth+on+P.+gingivalis+and+T.+denticola+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).</li>
<li>Maldonado-Carmona, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin-loaded+lignin+nanoparticles+against+bacteria%3A+A+photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+application%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 606185(2020).</li>
<li>Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-optic+sample+illuminator+design+for+the+observation+of+light+induced+phenomena+with+transmission+electron+microscopy+in+situ%3A+Antimicrobial+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy.</a> Ultramicroscopy. 230, 113388(2021).</li>
<li>Dinh, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+adsorption+mechanisms+of+methylene+blue+and+chromium%28III%29+from+aqueous+solution+onto+pomelo+fruit+peel%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel.</a> RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).</li>
<li>Żak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+controlling+the+electron+dose+to+improve+low-dose+imaging+of+sensitive+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples.</a> Micron. 145, 103058(2021).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+on+negative+stain+electron+microscopy+methods%3A+Tools+for+tackling+challenging+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li>
<li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM%3A+From+grid+preparation+to+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li>
<li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+negative+staining%3A+A+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087(2014).</li>
<li>Miller, B. K., Crozier, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System+for+in+situ+UV-visible+illumination+of+environmental+transmission+electron+microscopy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li>
<li>Schneider, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-Water+interactions+and+implications+for+liquid+cell+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De installatie en inbedrijfstelling van de verlichting vereisen basiskennis van de service en kunnen de microscoop beschadigen. De eenvoudigste manier om het licht aan de microscoop te introduceren, is door de optische vezel vanaf de bovenkant van de objectieflens aan te sluiten, waar meestal ruimte is voor de TEM-afbuigspoelen en extra detectoren. Meer vrije ruimte kan ook worden verwacht van oudere top-entry-apparaten, waar dezelfde locatie het monstervacuümslot en het monsterinstallatiemechanisme herbergt. Deze config...

Lichtgeïnduceerde verschijnselen in hoge resolutie zijn interessant op vele gebieden, zoals nano-engineering 1,2,3, katalyse 4,5 en biofotonica6. Enkele originele ontwerpen die dergelijke experimenten mogelijk maken, zijn te vinden in de literatuur, inclusief modificaties van de monsterhouders 1,4,7,8,9 en de optische vezel bevestigd aan de microscoop10,11.
De combinatie van lichtverlichting, een vloeibare omgeving en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) biedt een geweldige kans voor gedetailleerde, dynamische studies van foto-geïnduceerde processen. De hoogvacuümconditie in de microscoop is echter nogal ongunstig voor veel vloeistoffen, vooral wateroplossingen. Vloeibare inkapseling, die het beschermt tegen de omgeving, kan worden bereikt met behulp van een paar technieken die voornamelijk zijn gebaseerd op grafeen12, siliciumnitride13 of koolstof14 substraten. Naast onderzoek in materiaalkunde2 bieden zogenaamde vloeibare cellen mogelijkheden voor het uitvoeren van onconventionele microscopische waarnemingen op biologische specimens in de buurt van hun oorspronkelijke omstandigheden15. Dergelijke waarnemingen zijn uiterst veeleisend, vooral voor levende micro-organismen zoals bacteriële cellen. De elektronenbundel als ioniserende straling veroorzaakt onomkeerbare schade aan de gehydrateerde monsters, dus de elektronendosis moet wordengespecificeerd 16. Dit is nodig om ongunstige effecten te minimaliseren, de schade te beheersen en verwarrende artefacten te voorkomen. De optimale maximale elektronendosis die waarnemingen van levende cellen mogelijk maakt is nog een twijfelachtig onderwerp16, maar de dosis van 30 e−/nm2 lijkt de drempelwaarde te zijn, althans voor bacteriën17.
Enkele van de onderwerpen die van belang zijn voor dergelijke microscopische studies zijn processen tijdens antimicrobiële fotodynamische therapie (APDT)18. Kortom, de therapie verloopt als volgt. De bacteriële cellen worden omringd door de lichtgevoelige vloeistof genaamd photosensitizer. Wanneer lichtverlichting wordt gegeven op een specifieke golflengte, worden de cytotoxische reactieve zuurstofsoorten (ROS) gegenereerd uit energie- of ladingsoverdracht van de geëxciteerde fotosensitizermoleculen naar de zuurstof die van nature in de oplossing aanwezig is. Pathogenen blootgesteld aan ROS worden snel geïnactiveerd met een zeer hoge efficiëntie, zonder bijwerkingen19. De respons op de therapie varieert voor verschillende microben - de impact van dezelfde fotosensitizer kan bijvoorbeeld heel anders zijn voor Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën20. In het algemeen is vastgesteld dat het belangrijkste doelwit van ROS de buitenste structuren van cellen zijn, waar schade resulteert in functionele stoornissen van het celmembraan en bijgevolg leidt tot de dood van bacteriën21,22. Schade aan nucleïnezuren en eiwitten kan echter ook worden beschouwd als een oorzaak van inactivatie18, dus het is nog onbekend welke celstructuren de belangrijkste doelwitten zijn tijdens dit proces19. Een dieper inzicht in de schadelijke processen zou kunnen helpen om deze definitieve therapie te verbeteren. Vergeleken met de lichtmicroscopiemethoden die in APDT-onderzoek23 worden gebruikt, geven TEM-technieken meer mogelijkheden om naar het APDT-mechanisme te kijken met een hogere resolutie en vergroting24. TEM is al met succes gebruikt voor celobservatie tijdens de lopende therapie, waardoor we Gram-positieve bacterieschade konden bestuderen en de veranderingen in de celwand in detail konden beschrijven 6,25.
Het huidige protocol presenteert een geschikte experimentele opstelling voor beeldvorming met hoge resolutie van door licht geïnduceerde bacteriën inactivatie met behulp van TEM, wat een goed lichtverlichtingssysteem, de inkapseling van cellen met een vloeistof en strikte elektronendosiscontrole vereist. De bacteriën die voor de observatie werden gebruikt , waren Staphylococcus aureus en een methyleenblauwoplossing werd gebruikt als fotosensitizer. De speciale lichtverlichtingsopstelling bestaat uit een instelbare halfgeleiderlaser die rechtstreeks op de microscoopkolom is aangesloten met behulp van de lichtvezel. Dit ontwerp biedt een uniforme bestraling in het hele monster vanwege de bijna parallelle plaatsing van de optische vezel op de microscoopas. Monochroom licht van hoge intensiteit gegenereerd door de laser kan vervolgens worden gebruikt om verschillende fotochemische effecten te bestuderen. Het licht dat in het experiment werd gebruikt, had een golflengte gelijk aan 660 nm omdat methyleenblauw in het zichtbare gebied absorptiepieken heeft bij 613 nm en 664 nm26. Het protocol voor vloeibare inkapseling is gebaseerd op koolstofsubstraten, waardoor de procedure snel en ongecompliceerd is. Ten slotte wordt een methode voor lage dosis in situ TEM-observatie van cellen in vloeistof gepresenteerd. De moeilijkheden met betrekking tot de monstervoorbereiding, de elektronendosiseffecten op het gevoelige monster en een redelijke beeldinterpretatie worden besproken.

<table><tbody><tr><td>Carbon film on 200 mesh copper grid</td><td>Agar Scientific</td><td>AGS160</td><td>De standaard TEM-grids voor observaties en vloeistofcelvoorbereiding</td></tr><tr><td>Crossover Tweezers</td><td>Dumont</td><td>N5</td><td>De pincetten zijn noodzakelijk voor de voorbereiding van vloeistofcellen</td></tr><tr><td>Photodiode Power Sensor</td><td>ThorLabs</td><td>S130C</td><td>De sensor die wordt gebruikt voor het meten van lichtintensiteit</td></tr><tr><td>Polyimide-Coated Multimode Fiber</td><td>Thorlabs</td><td>FG400UEP</td><td>Moet in de microscoop worden gebouwd met behulp van de op locatie gebouwde adapter, volgens 10.1016/j.ultramic.2021.113388</td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscope</td><td>Hitachi</td><td>H-800</td><td>Kan worden vervangen door elke zijingangsmicroscoop, beschikbaar voor aanpassing</td></tr><tr><td>Tuneable Diode Laser</td><td>CNI</td><td>MRL-III-660D</td><td>De lichtgolflengte moet worden gekozen op basis van het absorptiespectrum van de fotosensibilisator</td></tr></tbody></table>

licht-geïnduceerde in situ transmissie elektronenmicroscopie voor observatie van de interactie tussen vloeistof en zachte materie

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Het huidige protocol beschrijft de modificaties van de transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) opstelling voor in situ licht-geïnduceerde waarnemingen. Een glasvezel die in de elektronenkolom boven het objectieflenspaalstuk werd gestoken en een laser, een instelbare lichtbron, werd gebruikt om het apparaat te fabriceren. Nadat de illuminator is gekalibreerd met behulp van een extern meetsysteem, kan men de intensiteit van de verlichting aanpassen aan de behoeften van het waargenomen proces. Dit verlichtingssysteem werd gebruikt om antimicrobiële fotodynamische therapieverschijnselen in beeld te brengen, die momenteel het onderwerp zijn van intensief onderzoek. Het monster werd bereid door een suspensie van bacteriën op een koolstof-, grafeen- of siliciumnitridesubstraat te spotten, de overtollige oplossing te deppen, de fotosensitizeroplossing te spotten, de overtollige vloeistof opnieuw te deppen en vervolgens de vloeibare cel samen te stellen met een tweede substraat of grafeenfilm. Het proces van het beeldvormingsexperiment zelf omvat het kiezen van de juiste plaats voor observatie met behulp van een lage vergroting en een minimale dosis elektronen, en vervolgens cyclische activering van de lichtbron om volgende beelden met gespecificeerde intervallen vast te leggen met de minimale hoeveelheid elektronen die nodig is. De elektronendosis van elke blootstelling en de tijd en intensiteit van de gebruikte verlichting moeten zorgvuldig worden geregistreerd vanwege de complexiteit van de waargenomen verschijnselen, omdat het proces tegelijkertijd zowel licht- als elektronengestuurd is. Nadat het eigenlijke experiment is uitgevoerd, moeten aanvullende controlewaarnemingen worden gedaan, waarbij dezelfde doses elektronen worden gebruikt, maar zonder extra lichtinvloed en kleinere doses elektronen worden gebruikt voor hogere doses licht. Dit maakt het mogelijk om door licht geïnduceerde microstructurele effecten te onderscheiden van die veroorzaakt door elektronen op zowel het gebied van het leven als de materiaalkunde.

De experimentele opstelling is ontworpen om de door licht geïnduceerde processen te observeren die plaatsvinden in een vloeistof met een hoge resolutie. De concurrentieanalyse van de beelden stelde ons in staat om de schade veroorzaakt door de elektronenbundel te onderscheiden van veranderingen die verband houden met de fotochemische reactie. Het effect van de elektronenbundel op het gevoelige monster (in dit geval de cellen ingekapseld met vloeistof) was overal zichtbaar in het bestraalde gebied toen de elektronen er ge...

Het huidige protocol beschrijft transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) modificaties met een lichtverlichtingssysteem, de fabricage van vloeibare cellen en in situ TEM-waarnemingen van door licht geïnduceerde interacties tussen bacteriële cellen en een fotosensitizer. De monstervoorbereidingsmethoden, elektronenbundelschade en beeldvorming worden ook besproken.

Licht-geïnduceerde in situ transmissie elektronenmicroscopie voor observatie van de interactie tussen vloeistof en zachte materie

The current protocol describes the modifications of the transmission electron microscope (TEM) setup for in situ light-induced observations. A glass ...

Het protocol presenteert hoe de combinatie van vloeibare cel TEM en lichtverlichting kan worden gebruikt om de structurele veranderingen in de bacteriën te observeren die zijn ingekapseld met fotosensitizer bij lichtverlichting. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud. Het protocol vereist geen moeilijke monstervoorbereiding en biedt voldoende inkapseling van bacteriën met fotosensitizeroplossing.Wijzig om te beginnen de transmissie-elektronenmicroscoop door de optische vezel aan te sluiten op de microscoopkolom aan de bovenkant van de objectieflens. Houd rekening met een paar centimeter ruimte tussen de objectieflens en de condensorlens, plus een vrije sleuf voor accessoires. Plaats twee onbehandelde TEM-roosters bedekt met amorf koolstof tussen twee gekruiste pincetten, gericht op de met koolstof gecoate kant naar boven.Houd de roosters zo dicht mogelijk bij de rand. Plaats vier microliter bacterie-oplossing op een van de roosters. De optische dichtheid van het monster moet tussen vijf en 10 liggen.Wacht 60 seconden en dep de vloeistof voorzichtig met filterpapier. Probeer de vloeistof tijdens het proces over het hele roosteroppervlak te verspreiden. Plaats vier microliter fotosensitizer op hetzelfde rooster.Veeg na vijf seconden de vloeistof eruit. Laat een zeer dunne laag vloeistof achter op het substraat. Plaats het droge rooster snel bovenop het rooster dat bedekt is met vloeistof.Verplaats het bovenste raster voorzichtig naar de rand van het tweede raster en knijp de substraten aan de randen met een pincet. Herhaal voorzichtig het knijpen. Laat de vloeistofcel tussen het pincet een minuut staan.Steek het monster direct na het voltooien van de bereiding in de TEM-houder. Nadat u het monster in de microscoop hebt geplaatst, start u de waarnemingen in de modus met lage vergroting om een geschikt observatiegebied te vinden. Houd tijdens de waarnemingen de elektronendosis zo laag mogelijk.Breid de belichtingstijd uit. Zoek de cellen omringd door vloeistof met de juiste vergroting met langere belichtingstijd en leg onmiddellijk het eerste beeld vast. Houd de elektronendosis constant en verzamel elke 30 seconden beelden om de veranderingen te observeren.Onderzoek de beelden zorgvuldig en bereken de totale elektronendosis die overeenkomt met de eerste zichtbare veranderingen in de cellen. Voordat u het experiment start, stelt u de intensiteit van het laserlicht in door de huidige waarde aan te passen. Plaats het monster in de microscoop en zoek het observatiegebied.Leg het eerste beeld van de cel vast voordat u begint met het verlichten van het monster en gebruik de beam blanker om de elektronenbundel uit te schakelen om de effecten van elektronenbestraling te voorkomen. Schakel de laser in. Begin met een korte verlichtingstijd, omdat het laserlicht een relatief hoge intensiteit heeft.Schakel na die tijd de lichtbron uit. Schakel de beam blanker uit en leg het beeld onmiddellijk vast. Gebruik indien mogelijk een automatisch algoritme om het monster alleen weer te geven voor de tijd die nodig is voor het maken van de afbeelding.Meet zorgvuldig de elektronenbestralingstijd om de elektronendosis te berekenen die wordt gebruikt voor beeldvorming. Een opmerkelijke degradatie van de buitenste laag van de cel veroorzaakt door de reactieve zuurstofsoort gegenereerd door lichtere straling van de fotosensitizer na één minuut wordt waargenomen. Verdere lichtverlichting maakte de veranderingen beter zichtbaar.Goede observatieplekken met voldoende vloeistof kunnen gemakkelijk worden gevonden bij lage vergroting, omdat deze gebieden donkerder en waziger lijken. De met vloeistof bedekte bacteriën zijn minder zichtbaar dan de droge, maar kunnen nog steeds worden onderscheiden. Het is nuttig om tijdens de beeldvorming naar de vloeistofgrens te kijken en de beweging ervan kan gemakkelijk worden gedetecteerd, wat impliceert dat het gekozen gebied ongeschikt en onstabiel kan zijn.Een ander probleem tijdens observaties is de verdamping van het water en de neerslag van de oplossing die kan optreden in willekeurige delen van het monster, inclusief de gebieden rond de bacteriën. Inkapseling van bacteriën kan ook worden uitgevoerd met behulp van grafeen en siliciumnitraatmembranen. De monstervoorbereiding is moeilijker, maar de stabiliteit van de vloeibare cel zal beter zijn.De gepresenteerde methode kan worden gebruikt voor observaties van door licht geïnduceerde reacties op vloeistof. Bijvoorbeeld de invloed van licht op metalen materialen, door licht geïnduceerde katalysatoren en fotochemische reacties.

light-induced-situ-transmission-electron-microscopy-for-observation

Research

JoVE Journal

Engineering

Techniek

We hebben een self-contained vloeibare cel die imaging doorlaat vloeistoffen met een transmissie-elektronenmicroscoop. Dynamische processen van nanodeeltjes in vloeistoffen kan worden onthuld in real-time met sub-nanometer resolutie.

Onthulling dynamische processen van de grondstoffen in vloeistoffen met behulp van vloeibare Cell Transmissie Elektronen Microscopie

Hier beschrijven we een procedure om virale complexen in vloeistof met nanometerresolutie in beeld te brengen met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop.

Ter plaatse TEM van biologische assemblages in vloeistof

Dit protocol beschrijft de werking van een vloeistofstroom monsterhouder voor het scannen van transmissie elektronenmicroscopie van AuNPs in water, zoals gebruikt voor de observatie van nanoschaal dynamische processen.

Het bestuderen van dynamische processen van Nano-sized Objecten in Vloeistof met behulp van Scanning Transmission Electron Microscopy

Door in situ vloeistof Scanning elektronen microscopie presenteren we een procedure voor real-time beeldvorming en elementaire samenstelling analyse van böhmiet deeltjes in gedeïoniseerd water.

In Situ Karakterisering van böhmiet deeltjes in het Water met behulp van vloeibare SEM

Hier introduceren we een experimentele protocollen voor het real-time opvolgen van een zelf-assemblage proces met behulp van vloeistof-cel transmissie-elektronenmicroscopie.

Vloeistof-cel transmissie-elektronenmicroscopie voor Tracking zelf-assemblage van nanodeeltjes

Een oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) methode wordt toegepast op afbeelding virus-geïnduceerde intracellulaire structuren via elektronenmicroscopie (EM) in de cellen die eerder door de lichte microscopie (LM) zijn geselecteerd. LM en EM worden gecombineerd als een hybride beeldvorming aanpak om een geïntegreerde visie van virus-gastheer interacties.

Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen

Een protocol voor de bereiding van met grafeen ondersteunde titer vloeistof cellen voor in-situ elektronenmicroscopie van goud nano van de haucl4 precursor oplossing wordt gepresenteerd. Bovendien wordt een analyse routine gepresenteerd om waargenomen etsen en groeidynamiek te kwantificeren.

Bereiding van met grafeen ondersteunde Microwell vloeistof cellen voor in-situ transmissie elektronenmicroscopie

Temperatuurregeling tijdens vloeistoffase-elektronenmicroscopie-experimenten opent nieuwe perspectieven voor het bestuderen van de dynamiek van nanodeeltjes in vloeibare omgevingen die hun vormings- of toepassingsmedia nabootsen. Met behulp van recent ontwikkelde verwarmingsvloeistofcellen hebben we direct de invloed van temperatuur op de nucleatie- en groeiprocessen van gouden nanodeeltjes in water waargenomen.

Het bestuderen van de Effecten van Temperatuur op de Nucleatie en Groei van Nanodeeltjes door Vloeistof-Cel Transmissie Elektronenmicroscopie

Hier worden protocollen beschreven om virusassemblages voor te bereiden die geschikt zijn voor vloeistof-EM- en cryo-EM-analyse op nanoschaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.

Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

Hier presenteren we een protocol om machine-vision-software te gebruiken om dynamische processen tijdens TEM-beeldvorming te stabiliseren, terwijl tegelijkertijd meerdere stromen metadata naar elke afbeelding worden geïndexeerd in een navigeerbare tijdlijn. We laten zien hoe dit platform geautomatiseerde kalibratie en mapping van de elektronendosis in de loop van een experiment mogelijk maakt.

Een machine-vision benadering van transmissie-elektronenmicroscopie workflows, resultatenanalyse en gegevensbeheer

We presenteren een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van een fluorescerend eiwit genaamd mScarlet. Deze methode kan de fluorescentie en de ultrastructuur tegelijkertijd behouden. Deze techniek is geschikt voor een breed scala aan biologische toepassingen.

Epon Post Inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie

Leer licht-geïnduceerde in situ transmissie elektronenmicroscopie voor observatie van bacteriële interacties met fotosensitizer. Deze methode vereist minimale samplevoorbereiding en maakt real-time monitoring van structurele veranderingen mogelijk.

Licht-geïnduceerde in situ transmissie elektronenmicroscopie voor observatie van de interactie tussen vloeistof en zachte materie (Video) | JoVE Journal

Licht-geïnduceerde in situ transmissie elektronenmicroscopie voor observatie van de interactie tussen vloeistof en zachte materie

Meer video's verkennen