Name: Oprichting van zebravispatiënt-afgeleide xenografts van alvleesklierkanker voor chemosensitiviteitstests (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Leer hoe je een zebravispatiënt-afgeleide xenograft (zPDX) model opzet voor alvleesklierkanker. Deze methode behoudt het tumormicroklimaat en voorspelt binnen één week de chemotherapiegevoeligheid van patiënten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door Fondazione Pisa (project 114/16). De auteurs willen Raffaele Gaeta van de Histopathologie Unit van Azienda Ospedaliera Pisana bedanken voor de selectie van patiëntenmonsters en pathologieondersteuning. We bedanken ook Alessia Galante voor de technische ondersteuning bij de experimenten. Dit artikel is gebaseerd op werk van COST Action TRANSPAN, CA21116, ondersteund door COST (European Cooperation in Science and Technology).

Het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid heeft alle beschreven dierproeven goedgekeurd, in overeenstemming met richtlijn 2010/63/EU betreffende het gebruik en de verzorging van dieren. De lokale ethische commissie keurde de studie goed, onder registratienummer 70213. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle betrokkenen. Voordat u begint, moeten alle oplossingen en de apparatuur worden voorbereid (sectie 1) en moeten de vissen worden gekruist (sectie 2).
1. Bereiding van oplossingen en apparatuur
OPMERKING: Zie tabel 1 voor de oplossingen en media die moeten worden voorbereid.
<ol><li>Agarose gel ondersteuning<ol><li>Weeg het agarosepoeder af in een microwavable kolf en los het op in een bepaald volume E3 zebravismedium om een gel van 1% te maken. Verwarm in een magnetron totdat de agarose volledig is opgelost. OPMERKING: Overkook de oplossing niet.</li>
		<li>Giet de gesmolten agarose in een petrischaaltje en wacht tot de gel helemaal gestold is.</li>
		<li>Maak kleine agarose cilinders (~ 5 mm hoog) met behulp van een plastic Pasteur-pipet waarvan de punt is afgesneden. Eenmaal bereid, bewaren in een petrischaaltje bij 4 °C gewikkeld in aluminiumfolie.</li>
	</ol></li>
	<li>Glazen micronaalden<ol><li>Trek met een trekker aan de borosilicaatglazen haarvaten om fijne naalden te verkrijgen (instellingen: HEAT 990, PULL 550). OPMERKING: Uit één capillair is het mogelijk om twee fijne naalden te verkrijgen met een puntdiameter van 10 μm.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Viskruising en eierverzameling
<ol><li>Breng volwassen vissen 3 dagen voorafgaand aan weefselimplantatie over in kweektanks, zoals beschreven door Avdesh et al.17.</li>
	<li>OPMERKING: Een verhouding van 1:1 of 2:3 mannetjes tot vrouwtjes wordt aanbevolen. De visdichtheid moet maximaal vijf vissen per liter water zijn. Houd mannetjes en vrouwtjes 's nachts gescheiden met een barrière.</li>
	<li>Verwijder de volgende dag de barrière en laat de vis paren.</li>
	<li>Verwijder de vissen uit de kweektanks en breng ze terug naar hun huisvestingstanks.</li>
	<li>Giet het water uit de kweekbak door een fijnmazig net. Breng de bevruchte eieren over in een petrischaaltje met E3 zebravismedium.</li>
	<li>Controleer de petrischaal met een stereomicroscoop en gooi de troebele eieren weg. Bewaar de bevruchte eieren in vers E3 zebravismedium bij 28 °C.</li>
</ol>3. Verzameling van specimens
OPMERKING: Autoclaaftang en een scalpelhandvat.
<ol><li>Onmiddellijke verwerking<ol><li>Verzamel het chirurgische monster van de tumor in 10 ml tumormedium bij 4 °C (tumormonster met een diameter van 5 mm tot 10 mm). Breng het monster bij 4 °C over van de gewenste locatie voor onmiddellijke verwerking.</li>
	</ol></li>
	<li>Opslag 's nachts (optioneel)<ol><li>Verzamel het chirurgische tumormonster in 10 ml tumormedium en bewaar het monster 's nachts bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Opslag bij -80 °C (optioneel, minst aanbevolen)<ol><li>Bewaar het monster bij -80 °C in een cryogene injectieflacon met tumormedium aangevuld met 5% dimethylsulfoxide (DMSO).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Monsterverwerking
OPMERKING: Voer de stappen uit onder een steriele laminaire stromingskap voor weefselkweek.
<ol><li>Was het hele tumorweefsel met 5 ml vers tumormedium en pipetteer 10x op en neer met een plastic Pasteur-pipet. Zuig het wasmiddel op en gooi het weg. Herhaal deze stap 3x. OPMERKING: Vermijd aspiratie van het tumorweefsel omdat het aan de plastic Pasteur-pipet kan blijven zitten.</li>
	<li>Breng het monster over in een petrischaaltje en dompel het onder in 1-2 ml vers tumormedium. Snijd het tumormonster in kleine stukjes (1-2 mm3) met behulp van een scalpelmesje en plaats ze in een steriele plastic buis van 5 ml met tumormedium.</li>
	<li>Stel de McIlwain weefselhakselaar in op 100 μm dikte. Leg de monsterfragmenten op de ronde plastic tafel van de hakselaar en hak ze fijn. Draai de tafel 90° en herhaal het hakken.</li>
	<li>Centrifugeer de fragmenten gedurende 3 minuten op 300 × g . Zuig vervolgens voorzichtig het supernatant op en gooi het weg.</li>
	<li>Incubeer de fragmenten met een fluorescerende celtracker, CM-DiI (eindconcentratie van 10 μg/ml in dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing [DPBS]), Deep Red (eindconcentratie van 1 μL/ml in DPBS) of CellTrace (eindconcentratie van 5 μM in DPBS) gedurende 30 minuten, waarbij de buis in een waterbad van 37 °C wordt geplaatst.</li>
	<li>Resuspensie van de fragmenten door elke 10 minuten zachtjes op en neer te pipetteren. OPMERKING: Voeg in het geval van CellTrace aan het einde van de incubatie een medium toe dat ten minste 1% eiwit bevat, volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 3 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap 3x met 1 ml DPBS om niet-geïncorporeerde kleurstof te verwijderen.</li>
	<li>Suspensie de fragmenten in 5 ml DPBS in een petrischaal van 60 mm. OPMERKING: Zorg ervoor dat het weefsel niet uitdroogt.</li>
</ol>5. Oprichting van zPDX
OPMERKING: Voer de stappen uit onder een steriele laminaire stromingskap voor weefselkweek.
<ol><li>Verdoof de 2 dagen na de bevruchting (dpf) embryo's met 0,16 mg/ml tricaïne in E3 zebravis medium.</li>
	<li>Plaats drie agarosecilinders (stap 1.1.3) in een petrischaaltje en leg een zebravisembryo op een cilinder, waarbij één kant wordt blootgelegd. Verwijder de overtollige oplossing om het embryo in slechts een dunne film te houden.</li>
	<li>Breng het stukje gekleurd weefsel met een steriele tang over van de petrischaal naar de 1% agarose-ondersteuning waar het embryo ligt. Pak het weefsel op, leg het bovenop de embryodooier en duw het vervolgens in de perivitellineruimte met behulp van de door warmte getrokken glazen micronaald (stap 1.2.1).</li>
	<li>Voeg voorzichtig enkele druppels E3 1% penicilline-streptomycine (Pen-Streptomycine) toe aan het embryo om het terug in de vloeistof te brengen.</li>
	<li>Herhaal stap 5.2-5.4 voor alle embryo's en verwijder ten slotte de agarosesteunen uit de petrischaal en incubeer de embryo's bij 35 °C.</li>
	<li>Controleer de embryo's op de juiste xenografts (positieve kleuring) 2 uur na implantatie met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop. Gooi de embryo's weg met tumorfragmenten die zich niet volledig in de perivitellineruimte bevinden, evenals de dode embryo's. Verdeel de embryo's willekeurig in zes multi-well platen (maximaal n = 20 embryo's/put), gelijkelijk verdeeld in groepen volgens het experimentele plan (bijv. controle en FOLFOXIRI).</li>
</ol>6. Behandeling
<ol><li>Verdun het geneesmiddel (bijv. 5-fluorouracil, oxaliplatine, irinotecan) tot E3 1% Pen-Strep, grondig mengen door meerdere keren op en neer te pipetteren. Zoals voorgesteld door Usai et al.12, gebruik een vijfvoudige verdunning van het geneesmiddel in het viswater, met betrekking tot de equivalente plasmaconcentratie (EPC).</li>
	<li>Meng de medicijnen om de cocktail te bereiden (bijv. FOLFOXIRI).</li>
	<li>Verwijder de media uit elke put en voeg de medicijncocktail 2 uur na implantatie toe.</li>
	<li>Behandel de embryo's gedurende 3 dagen. Vernieuw de drugscocktail elke dag.</li>
</ol>7. Immunofluorescente kleuring met hele montage
OPMERKING: Breng aceton voor het begin aan bij -20 °C en bereid de in tabel 1 vermelde oplossingen.
<ol><li>Dag 1:<ol><li>Bevestig de larven met 1 ml 4% paraformaldehyde in glazen injectieflacons bij 4 °C gedurende een nacht.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 2:<ol><li>Was de larven 3 x 5 minuten met 1 ml PBS, voorzichtig roerend op een laboratoriumplatform rocker (400 rpm).</li>
		<li>Bewaren in 1 ml 100% methanol bij -20 °C 's nachts (of voor langdurige opslag).</li>
		<li>Rehydrateer 3 x 10 min met 1 ml PTw (0,1% tween in PBS), zachtjes roerend op een laboratoriumplatform rocker (400 rpm).</li>
		<li>Permeabiliseren met 1 ml van 150 mM Tris-HCl bij pH 8,8 gedurende 5 minuten bij RT, gevolgd door verwarming gedurende 15 minuten bij 70 °C.</li>
		<li>Was 2 x 10 minuten met 1 ml PTw, voorzichtig roerend op een laboratoriumplatformwip (400 tpm).</li>
		<li>Was 2 x 5 minuten met 1 ml dH2O, voorzichtig roerend op een laboratoriumplatformwip (400 tpm).</li>
		<li>Permeabiliseren met 1 ml ijskoude aceton gedurende 20 minuten bij -20 °C.</li>
		<li>Was 2 x 5 minuten met 1 ml dH2O, voorzichtig roerend op een laboratoriumplatformwip (400 tpm).</li>
		<li>Was 2 x 5 minuten met 1 ml PTw, voorzichtig roerend op een laboratoriumplatform rocker (400 rpm).</li>
		<li>Incubeer de larven in 1 ml blokkeringsbuffer gedurende 3 uur bij 4 °C, voorzichtig roerend op een laboratoriumplatform rocker (400 rpm).</li>
		<li>Plaats de larven in putplaten die als volgt per groep zijn verdeeld: 10 larven in 50 μL volume/put in een 96-putplaat of 20 larven in 100 μL volume/put in een 48-putplaat.</li>
		<li>Gooi de blokkeringsbuffer weg, incubeer de larven met primaire antilichaamoplossing (bijv. Konijn anti-menselijke gekloofde caspase-3, 1:250) verdund in incubatiebuffer 's nachts bij 4 °C in het donker, en wieg zachtjes op een schudplaat (400 tpm). Zie stap 7.2.11 voor de aanbevolen volumes.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 3:<ol><li>Was de larven achtereenvolgens 3 x 1 uur met 1 ml PBS-TS (10% geitenserum, 1% Triton X-100 in PBS) en vervolgens met 2 x 10 minuten met 1 ml PBS-T (1% Triton X-100 in PBS) en 2 x 1 uur met 1 ml PBS-TS. Roer bij elke wasbeurt de platen met de larven voorzichtig op een schudplaat (400 tpm).</li>
		<li>Incubeer de larven met fluorescerende kleurstof geconjugeerde secundaire antilichamen (bijv. Geit anti-Konijn IgG [H + L] Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 647, 1:500) en 100 μg / ml Hoechst 33258 verdund in incubatiebuffer in het donker 's nachts bij 4 °C, met zachte agitatie op een schudplaat (400 rpm). Zie stap 7.2.11 voor de aanbevolen hoeveelheden secundaire antilichaamoplossing.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 4:<ol><li>Was 3 x 1 uur met 1 ml PBS-TS en 2 x 1 uur met 1 ml PTw, met zacht roeren op een schudplaat (400 tpm).</li>
		<li>Maak een cirkelvormige laag met het glazuur (dikte van ~ 0,5-1 mm) op microscoopglaasjes. Laat het glazuur uitdrogen en plaats de larven in het midden van de cirkelvormige laag, waardoor de zijkant van het xenograft bloot komt te liggen.</li>
		<li>Droog de overtollige oplossing en monteer de glazen afdekplaat met een in water oplosbaar, niet-fluorescerend montagemedium.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Beeldvorming
<ol><li>Leg beelden vast onder confocale microscopie met een 40x objectief. Gebruik de volgende acquisitieparameters: een resolutie van 1024 x 512 pixels met een Z-afstand van 5 μm.</li>
</ol>9. Analyse van apoptose door ImageJ
<ol><li>Laad (Fiji is gewoon) ImageJ-software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) en open de bestandsafbeelding van Z-stack (klik op Bestand | Open). Selecteer in het pop-upvenster Stackweergave/Hyperstack en klik op OK.</li>
	<li>Overlay de verschillende kanalen door Afbeelding | Kleur | Maak composiet.</li>
	<li>Sleep de Z-balk onder aan de afbeelding om door de Z-stack-afbeelding te bladeren en het xenograftgebied te identificeren (cellen die positief zijn voor fluorescerende celtrackers. Zie stap 4.5) in de perivitellineruimte van de zebravis.</li>
	<li>Selecteer Point Tool en tel het aantal apoptotische menselijke cellen (positieve tot fluorescerende celtracker en gespleten caspase-3), zoals weergegeven in Aanvullende video S1.</li>
	<li>Dubbelklik op het pictogram Point Tool , wijzig de teller en tel het totale aantal menselijke celkernen (kernen van CM-DiI-positieve cellen).</li>
</ol>

<ol><li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Understanding cancer.</a> Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).</li>
<li>Krzyszczyk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+role+of+precision+and+personalized+medicine+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment.</a> Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2022%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2022.</a> CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).</li>
<li>Trunk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+treatment+strategies+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Emerging treatment strategies in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).</li>
<li>Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer-A+disease+in+need%3A+Optimizing+and+integrating+supportive+care%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care.</a> Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).</li>
<li>Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+ductal+adenocarcinoma%3A+Treatment+hurdles%2C+tumor+microenvironment+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastrointestinal+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).</li>
<li>Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+vs.+organoids%3A+a+preliminary+analysis+of+cancer+research+output%2C+funding+and+human+health+impact+in+2014-2019%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019.</a> Animals. 10 (10), 1923(2020).</li>
<li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+based+personalized+medicine%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).</li>
<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+and+application+of+patient-derived+xenograft+model+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li>
<li>Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+models%3A+a+more+suitable+tool+for+pre-clinical+studies+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178(2021).</li>
<li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient-derived+xenografts+identify+chemo-response+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients.</a> Cancers. 13 (16), 4131(2021).</li>
<li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+a+zebrafish+avatar+for+co-clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials.</a> Cancers. 12 (3), 677(2020).</li>
<li>Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benefits+of+zebrafish+xenograft+models+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551(2021).</li>
<li>Miserocchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+and+potentialities+of+primary+cancer+cultures+in+preclinical+and+translational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229(2017).</li>
<li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59(2020).</li>
<li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment%3A+interplay+in+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity.</a> Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Tavares Barroso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+pancreatobiliary+cancer+zebrafish+avatars+for+chemotherapy+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening.</a> Cells. 10 (8), 2077(2021).</li>
<li>Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+patient-derived+xenografts%3A+the+best+laid+plans+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men.</a> Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).</li>
<li>Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+associated+fibroblasts+%28CAFs%29+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment.</a> Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).</li>
<li>Strähle, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+as+an+alternative+to+animal+experiments-a+commentary+on+the+definition+of+the+onset+of+protected+life+stages+in+animal+welfare+regulations%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

In vivo modellen in kankeronderzoek bieden onschatbare hulpmiddelen om kankerbiologie te begrijpen en de respons op kankerbehandeling te voorspellen. Momenteel zijn er verschillende in vivo modellen beschikbaar, bijvoorbeeld genetisch gemodificeerde dieren (transgene en knock-out muizen) of van patiënten afgeleide xenografts uit menselijke primaire cellen. Ondanks vele optimale functies, heeft elk ervan verschillende beperkingen. In het bijzonder missen de bovengenoemde modellen een betrouwbare manier o...

Een van de problemen van klinisch kankeronderzoek is dat kanker geen enkele ziekte is, maar een verscheidenheid aan verschillende ziekten die in de loop van de tijd kunnen evolueren en specifieke behandelingen vereisen, afhankelijk van de kenmerken van de tumor zelf en de patiënt1. Bijgevolg is de uitdaging om naar patiëntgericht kankeronderzoek te gaan, om nieuwe gepersonaliseerde strategieën te identificeren voor de vroege voorspelling van kankerbehandelingsresultaten2. Dit is met name relevant voor pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC), omdat het wordt beschouwd als een moeilijk te behandelen kanker, met een 5-jaarsoverleving van 11%3.
De late diagnose, snelle progressie en het gebrek aan effectieve therapieën blijven de meest urgente klinische problemen van PDAC. De belangrijkste uitdaging is daarom om de patiënt te modelleren en biomarkers te identificeren die in de kliniek kunnen worden toegepast om de meest effectieve therapie te selecteren in overeenstemming met gepersonaliseerde geneeskunde 4,5,6. In de loop van de tijd zijn nieuwe benaderingen voorgesteld om kankerziekten te modelleren: patiënt-afgeleide organoïden (PDO's) en muispatiënt-afgeleide xenografts (mPDXs) afkomstig van een bron van menselijk tumorweefsel. Ze zijn gebruikt om de ziekte te reproduceren om de respons en de resistentie tegen therapie te bestuderen, evenals ziekterecidief 7,8,9.
Evenzo is de interesse in zebravis-gebaseerde patiënt-afgeleide xenograft (zPDX) -modellen toegenomen, dankzij hun unieke en veelbelovende kenmerken10, wat een snel en goedkoop hulpmiddel is voor kankeronderzoek11,12. zPDX-modellen vereisen slechts een kleine tumorsteekproefgrootte, waardoor screening van chemotherapie met hoge doorvoer haalbaar is13. De meest gebruikte techniek voor zPDX-modellen is gebaseerd op volledige monstervertering en implantatie van de primaire celpopulaties, die de tumor gedeeltelijk reproduceert, maar de nadelen heeft van een gebrek aan tumormicro-omgeving en overspraak tussen kwaadaardige en gezonde cellen14.
Dit werk laat zien hoe zPDXs kunnen worden gebruikt als een preklinisch model om het chemosensitiviteitsprofiel van patiënten met alvleesklierkanker te identificeren. De waardevolle strategie vergemakkelijkt het xenograftproces, omdat er geen celuitbreiding nodig is, waardoor de chemotherapiescreening kan worden versneld. De kracht van het model is dat alle micro-omgevingscomponenten worden gehandhaafd zoals ze zijn in het kankerweefsel van de patiënt, omdat, zoals bekend, het gedrag van de tumor afhangt van hun samenspel15,16. Dit is zeer gunstig ten opzichte van alternatieve methoden in de literatuur, omdat het mogelijk is om de heterogeniteit van de tumor te behouden en bij te dragen aan het verbeteren van de voorspelbaarheid van de behandelingsuitkomst en terugval op een patiëntspecifieke manier, waardoor het zPDX-model kan worden gebruikt in coklinische onderzoeken. Dit manuscript beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het maken van het zPDX-model, te beginnen met een stuk tumorresectie van de patiënt en het behandelen ervan om de respons op chemotherapie te analyseren.

<table><tbody><tr><td>5-fluorouracil</td><td>Teva Pharma AG</td><td>SMP 1532755</td><td></td></tr><tr><td>48 multiwell plate</td><td>Sarstedt</td><td>83 3923</td><td></td></tr><tr><td>96 multiwell plate</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Agarose powder&nbsp;</td><td>Merck</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1</td><td>Merck</td><td>MAB1281&nbsp;</td><td>1:200 verdunning</td></tr><tr><td>Aquarium net QN6</td><td>Penn-plax</td><td>0-30172-23006-6</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34567</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CM-DiI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C7001</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Deep Red&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9661S</td><td>1:250 verdunning</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)&nbsp;</td><td>PanReac AppliChem ITW Reagents</td><td>A3672,0250</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Folinic acid -&nbsp; Lederfolin</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries, 3.5"</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Buitendiameter = 1,14 mm. Binnendiameter = 0,53 mm.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glass vials&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>WHEAW224581</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit&nbsp;IgG&nbsp;(H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21244&nbsp;&nbsp;</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31872</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Irinotecan</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low Temperature Freezer Vials</td><td>VWR International</td><td>479-1220</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate Mixer</td><td>SCILOGEX</td><td>822000049999</td><td></td></tr><tr><td>Oxaliplatin</td><td>Teva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83 3902500</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83 3901</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Mount</td><td>Tebu-bio</td><td>18606-5</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Merck</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td><td>VWR International</td><td>SWAN3001</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Merck</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Micropipette Puller</td><td>Shutter instrument</td><td>P-30&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

oprichting van zebravispatiënt-afgeleide xenografts van alvleesklierkanker voor chemosensitiviteitstests

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Kanker is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken en de incidentie van vele soorten kanker blijft toenemen. Er is veel vooruitgang geboekt op het gebied van screening, preventie en behandeling; Preklinische modellen die het chemosensitiviteitsprofiel van kankerpatiënten voorspellen, ontbreken echter nog. Om deze leemte op te vullen, werd een in vivo patiënt-afgeleid xenograftmodel ontwikkeld en gevalideerd. Het model was gebaseerd op zebravis (Danio rerio) embryo's op 2 dagen na de bevruchting, die werden gebruikt als ontvangers van xenograft fragmenten van tumorweefsel genomen van het chirurgische monster van een patiënt. 
Het is ook vermeldenswaard dat bioptische monsters niet werden verteerd of uitgesplitst, om de micro-omgeving van de tumor te behouden, wat cruciaal is in termen van het analyseren van tumorgedrag en de respons op therapie. Het protocol beschrijft een methode voor het vaststellen van op zebravissen gebaseerde patiënt-afgeleide xenografts (zPDXs) van primaire solide tumorchirurgische resectie. Na screening door een anatomopatholoog wordt het monster ontleed met behulp van een scalpelmesje. Necrotisch weefsel, bloedvaten of vetweefsel worden verwijderd en vervolgens in stukjes van 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm gehakt. 
De stukjes worden vervolgens fluorescerend gelabeld en xenotransplanteerd in de perivitellineruimte van zebravisembryo's. Een groot aantal embryo's kan tegen lage kosten worden verwerkt, waardoor in vivo analyses met een hoge doorvoer van de chemosensitiviteit van zPDX's voor meerdere geneesmiddelen tegen kanker mogelijk zijn. Confocale beelden worden routinematig verkregen om de apoptotische niveaus geïnduceerd door chemotherapiebehandeling te detecteren en te kwantificeren in vergelijking met de controlegroep. De xenograftprocedure heeft een aanzienlijk tijdsvoordeel, omdat deze in één dag kan worden voltooid, waardoor een redelijk tijdsbestek wordt geboden om een therapeutische screening voor coklinische onderzoeken uit te voeren.

Dit protocol beschrijft de experimentele benadering voor het vaststellen van zPDX's van primair humaan pancreas adenocarcinoom. Een tumormonster werd verzameld, gehakt en gekleurd met behulp van fluorescerende kleurstof, zoals beschreven in protocolsectie 4. zPDX's werden vervolgens met succes vastgesteld door implantatie van een stuk tumor in de perivitellineruimte van 2 DPF-zebravisembryo's, zoals beschreven in protocolsectie 5. Zoals beschreven in protocolsectie 6, werden de zPDX's verder gescreend om de chemotherapie...

Preklinische modellen zijn bedoeld om de kennis van kankerbiologie te vergroten en de werkzaamheid van de behandeling te voorspellen. Dit artikel beschrijft de generatie van op zebravissen gebaseerde patiënt-afgeleide xenografts (zPDXs) met tumorweefselfragmenten. De zPDXs werden behandeld met chemotherapie, waarvan het therapeutische effect werd beoordeeld in termen van celapoptose van het getransplanteerde weefsel.

Oprichting van zebravispatiënt-afgeleide xenografts van alvleesklierkanker voor chemosensitiviteitstests

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Zebravis patiënt-afgeleide xenograft is een krachtig preklinisch model om het chemosensitiviteitsprofiel van kankerpatiënten in vivo te voorspellen. Het protocol beschrijft de generatie van het model uitgaande van een chirurgisch monster van de patiënt. Door een klein weefselfragment te xenograferen in plaats van cellen te isoleren in zebravisembryo's, is het mogelijk om de micro-omgeving van de tumor te behouden, wat de cruciale stap is voor tumorprogressie en de reactie op chemotherapie.Het grote voordeel van het model wordt gegeven door het potentieel om de prognose van de patiënt te voorspellen in een klinisch relevant tijdsbestek van slechts één week dat fungeert als een hulpmiddel voor gepersonaliseerde geneeskunde. Begin met de monsterverwerking door het hele tumorweefsel dat van de patiënt is verzameld te wassen met vijf milliliter vers tumormedium. Pipetteer het 10 keer op en neer met een plastic Pasteur-pipet.Zuig het wasmedium voorzichtig op en gooi het weg voordat u de was drie keer herhaalt. Dompel het monster onder in één tot twee milliliter vers tumormedium. Snijd het tumormonster in kubusstukken van één tot twee millimeter met behulp van een scalpelmes en plaats ze

establishment-zebrafish-patient-derived-xenografts-from-pancreatic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Deze video beschrijft de techniek om een van zebravispatiënt afgeleid xenograftmodel te maken. In het monsterprotocol beoordelen we de efficiëntie van de geneesmiddelen Gemcitabine en Navitoclax op het xenograftmodel van de pancreastumor.

Zebravis patiënt-afgeleide Xenograft (zPDX): een kankermodel

This video describes the zebrafish xenograft assay to assess in vivo tumor formation and study the effect of therapeutic agents.

Zebrafish Xenograft Assay: A Method to Assess the Anti-cancer Efficacy of Therapeutics on Tumorigenicity in Zebrafish In Vivo

This video describes the method for transplantation of tumor cells from the melanoma-bearing donor zebrafish model to an immunocompromised recipient Casper zebrafish. It helps to visualize tumor engraftment and proliferation in the recipient fish.

Subcutaneous Transplantation Assay: A Method to Transplant Melanoma Cells from a Donor to a Recipient Zebrafish Model

De transplantatie van kankercellen is een belangrijk instrument voor de identificatie van kankermechanismen en therapeutische reacties. Huidige technieken zijn afhankelijk van immuun-incompetente dieren. Hier beschrijven we een methode om zebravis tumorcellen te transplanteren in immuun-competente embryo's voor de langetermijnanalyse van tumorcelgedrag en in vivo drugresponsen.

Transplantatie van zebravis-pediatrische hersentumoren in immuungecompetente gastheren voor langdurige studie van tumorcellen gedrag en drugrespons

Dit protocol beschrijft de optimalisatie procedures in een virus-gebaseerde Dual fluorescentie-gelabelde tumor xenotransplantaatmodellen is model met behulp van larvale zebravis als gastheren. Dit heterogene xenotransplantaatmodellen is-model bootst de weefsel samenstelling van de micro-omgeving van pancreaskanker na in vivo en dient als een preciezer hulpmiddel voor het beoordelen van geneesmiddel responsen in gepersonaliseerde zpdx (Zebrafish patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is)...

Door patiënten afgeleid heterogeen xenograft-model van pancreaskanker met behulp van zebravis larven als gastheer voor vergelijkende geneesmiddelenbeoordeling

Zebrafish xenograft modellen zorgen voor high-throughput drug screening en fluorescerende beeldvorming van menselijke kankercellen in een in vivo micro-omgeving. We ontwikkelden een workflow voor grootschalige, geautomatiseerde medicijnscreening op patiënt-afgeleide leukemiemonsters bij zebravissen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit.

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenograften te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.

Generatie zebravislarven xenografts en tumorgedragsanalyse

We beschrijven een protocol voor xenotransplantatie in de dooier van transparante zebravisembryo's dat wordt geoptimaliseerd door een eenvoudige, snelle stadiëringsmethode. Analyses na injectie omvatten overleving en het beoordelen van de ziektelast van xenogetransplanteerde cellen door middel van flowcytometrie.

Een eenvoudige, snelle en effectieve methode voor tumor xenotransplantatie analyse in transparante zebravis embryo's

Dit protocol biedt stapsgewijze instructies voor het genereren en oplossen van problemen met xenotransplantaten voor acute lymfatische leukemie (ALL) bij de mens uit cellijnen en vers patiëntenmateriaal in kortstondig immunosuppressie-zebravisembryo's, samen met richtlijnen voor de beoordeling van de geneesmiddelrespons met behulp van flowcytometrie. De experimentele pijplijn kan ook worden aangepast voor solide tumoren.

Snelle in vivo voorspelling van geneesmiddelrespons met behulp van leukemieceltransplantaten in zebravisembryo's

We beschrijven een methode voor stabiele kenmerken van de patiënt afgeleide xenotransplantaten (PDXs) met lentivirale deeltjes uiten van groen fluorescerend eiwit en luciferase reporters. Deze werkwijze maakt het volgen van de groei van PDXs op de primaire locatie, alsmede detectie spontane en experimentele metastasen gebruik in vivo beeldvorming.

Etikettering van borstkanker-Patient afgeleid Xenograften met Traceable Verslaggevers voor tumorgroei en metastase Studies

Leer hoe je een zebravispatiënt-afgeleide xenograft (zPDX) model opzet voor alvleesklierkanker. Deze methode behoudt het tumormicroklimaat en voorspelt binnen één week de chemotherapiegevoeligheid van patiënten.

Oprichting van zebravispatiënt-afgeleide xenografts van alvleesklierkanker voor chemosensitiviteitstests

Meer video's verkennen