Name: Effect van hyaluronzuur 35 kDa op een in vitro model van te vroeg geboren darmletsel en genezing met behulp van enteroïde-afgeleide monolagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Leer een scratch-wondassay met enteroïde-afgeleide monolagen voor darmregeneratieonderzoek bij vroeggeborenen. Deze methode maakt real-time visualisatie van wondsluiting mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. HC wordt ondersteund door subsidie P20GM134973 van de National Institutes of Health. KB wordt ondersteund door een Children's Hospital Foundation (CHF) en Presbyterian Health Foundation (PHF) subsidie. Live-cell imaging-diensten die worden aangeboden door de Cancer Functional Genomics-kern werden gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 en national cancer institute grant P30CA225520 van de National Institutes of Health, toegekend aan het University of Oklahoma Health Sciences Center Stephenson Cancer Center.

Alle dierprocedures in deze studie werden goedgekeurd door het University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Na institutionele goedkeuring werden foetale dunne darm gemaksmonsters van een premature niet-menselijke primaat (NHP, 90% dracht, olijfbaviaan, Papio anubis) verkregen na euthanasie voor een afzonderlijke studie (Protocol # 101523-16-039-I) 20.
1. Vaststelling van premature niet-menselijke primaat 3D intestinale enteroïden
<ol><li>Media voorbereiding OPMERKING: Media kunnen tot 1 week voor cryptisolatie worden voorbereid volgens de standaard aseptische techniek. Penicilline/streptomycine (eindconcentratie 1%) kan indien gewenst worden gebruikt in plaats van de breedspectrumantibiotica voor primaire cellen.<ol><li>Bereid humane organoïde groeimedia + Y-27632 (HOGMY) voor door 50 ml organoïde groeimedium menselijk basaal medium te mengen met 50 ml organoïde supplement (materiaaltabel). Voeg 200 μL van de breedspectrumantibiotica (eindconcentratie 100 μg/ml) (materiaaltabel) en Y-27632 (tot een eindconcentratie van 10 μM) toe. Warm op de benchtop tot kamertemperatuur.</li>
		<li>Bereid humane organoïde groeimedia (HOGM) voor door 50 ml organoïde groeimedium menselijk basaal medium te mengen met 50 ml organoïde supplement. Voeg 200 μL van de breedspectrumantibiotica (100 μg/ml) toe. Warm op de benchtop tot kamertemperatuur. OPMERKING: HOGM zal worden gebruikt bij het wisselen van media na de eerste 2-3 dagen na passage.</li>
		<li>Koel 100 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium of magnesium tot het ijskoud is.</li>
		<li>Bereid 50 ml wasbuffer door 1x PBS zonder calcium of magnesium te combineren met 0,1% runderserumalbumine (BSA). Laat het afkoelen tot het ijskoud is.</li>
		<li>Bereid DMEM-F12 wasbuffer voor door 1 ml van de breedspectrumantibiotica (100 μg / ml) toe te voegen aan 500 ml DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES-buffer). Houd het ijskoud.</li>
	</ol></li>
	<li>Crypt isolatie en beplating OPMERKING: Extracellulaire matrix (ECM) -gebaseerde hydrogel moet gedurende de hele procedure op het ijs blijven. Deze procedure gaat uit van voldoende weefsel om zes op ECM gebaseerde hydrogelkoepels te bevolken. Als een andere dichtheid van crypten wordt geoogst, moet het koepelnummer dienovereenkomstig worden gewijzigd.<ol><li>Ontdooi 150 μL groeifactor verminderd (GFR) keldermembraanextract (BME) (fenol roodvrij) 's nachts op het ijs bij 2-8 °C.</li>
		<li>Incubeer een 24-well, platte bodem, weefselkweekbehandelde polystyreenplaat in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende minimaal 30 minuten voor gebruik.</li>
		<li>Na NHP-euthanasie en weefselverzameling spoelt u het ileumsegment van puin met een pipetpunt van 1.000 μL met behulp van ijskoude 1x PBS in een wegwerp petrischaaltje. OPMERKING: Vers weefsel moet snel worden geoogst en ijskoud worden gehouden om gezonde enteroïden te oogsten.</li>
		<li>Snijd het ileum in de lengterichting langs de hele darm en was 3x met ijskoude PBS. Gehakt het weefsel in kleine fragmenten (ongeveer 2 mm lang) met een steriele schaar over een conische buis van 50 ml met 15 ml ijskoude PBS, te beginnen met het deel van het ileale segment dat zich het dichtst bij de buis bevindt.</li>
		<li>Gebruik een serologische pipet van 10 ml om de crypten te verstoren door 5-10x op en neer te pipetteren. Laat de weefselsegmenten op de bodem van de buis zakken, verwijder vervolgens het supernatant en vervang het door verse, ijskoude PBS. Herhaal dit proces minimaal 7x-10x totdat het supernatant helder en vrij van vuil is.</li>
		<li>Eenmaal helder, verwijder het supernatant en resuspenseer de crypten in 25 ml celdissociatiereagens. Plaats de buis op een schommelplatform bij 20 rpm gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder de buis uit de rocker, laat de cellen ongeveer 30 s tot 1 min bezinken en verwijder het supernatant. Voeg 10 ml ijskoude wasbuffer toe. Pipetteer op en neer met een p1000 pipet om verder te dissociëren in enkele crypten.</li>
		<li>Filter het weefsel door een celzeef van 70 μm in een nieuwe conische buis van 50 ml. Spoel de originele conische buis van 50 ml met 10 ml ijskoude wasbuffer en filter door de zeef van 70 μm om ervoor te zorgen dat alle crypten uit de oorspronkelijke buis zijn verwijderd. Herhaal dit wassen van tissue voor een totaal van 4x spoelingen.</li>
		<li>Centrifugeer het filtraat bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Voeg 600 μL HOGMY toe en verstoor de pellet door op en neer te pipetteren met een pipet van 200 μL. Plaats de buis op ijs totdat de oplossing ijskoud wordt. OPMERKING: Als de oplossing niet ijskoud is, zal de koepel niet de juiste structuur behouden wanneer deze wordt verguld. Vermijd het introduceren van bubbels bij het pipetteren van op ECM gebaseerde hydrogelkoepels, omdat bubbels een goede hechting aan de plaatbodem voorkomen.</li>
		<li>Voeg 600 μL ijskoude hydrogel op basis van ECM toe om de celpellet te suspenseren en meng goed met een pipet van 200 μL.</li>
		<li>Haal de 24-wells plaat uit de incubator en plaats deze op een 37 °C platenwarmer. Pipetteer 50 μL ijskoud HOGMY/ECM-gebaseerd hydrogelmengsel in het midden van 24 putten van een 24-well kweekplaat (50 μL per koepel).</li>
		<li>Laat de koepels na de vergulding 1 minuut op een platenwarmer van 37 °C zitten om hechting aan de onderkant van de plaat mogelijk te maken. Keer de plaat voorzichtig om, zorg ervoor dat er zich geen condensatie op de bodem van de plaat heeft opgehoopt en plaats de omgekeerde plaat in de incubator bij 37 °C en 5% CO2.</li>
		<li>Draai na 15 minuten de plaat rechts omhoog en pipetteer 750 μL HOGMY op kamertemperatuur in elke put. OPMERKING: Pipet media langzaam op de zijwand van putten, voorzichtig om de nieuw gevormde 3D ECM-gebaseerde hydrogelkoepel niet te verstoren.</li>
		<li>Zodra alle putjes zijn gevuld met media, plaatst u de plaat in de incubator en vervangt u de media om de 3 dagen met 750 μL HOGM. Passage enteroïden om de 7-10 dagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Intestinale enteroïde passaging OPMERKING: Het volgende protocol is voor één 24-well kweekplaat met NHP-enteroïden met een splitsnelheid van 1:2.<ol><li>Verwijder de enteroïde media uit elke put, zorg ervoor dat de ECM-koepel met enteroïden niet wordt verstoord, voeg 500 μL ijskoude celdissociatiereagens toe aan elke put met behulp van een pipet van 1.000 μL en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Verstoor de ECU handmatig door 8-12x op en neer te pipetteren. Breng de inhoud van 12 putten over op één conische buis van 15 ml.</li>
		<li>Zodra alle oplossing is verzameld uit de 24-well kweekplaat, voegt u 250 μL celverstoringsreagens toe aan elke put om ervoor te zorgen dat alle NHP-enteroïden uit elke put zijn verwijderd en voegt u deze laatste spoeling toe aan de bestaande conische buizen van 15 ml.</li>
		<li>Plaats op een schommelplatform bij 40 tpm gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (20 °C). U kunt de buizen ook handmatig schudden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Na 15 minuten centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant uit de buizen van 15 ml totdat alleen de pellet overblijft.</li>
		<li>Voeg 8 ml ijskoude DMEM + breedspectrumantibiotica toe aan één conische buis van 15 ml en zorg ervoor dat de pellet voldoende verstoord is. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Voeg 600 μL HOGMY toe en verstoor de pellet door op en neer te pipetteren met een pipet van 1.000 μL. Plaats de buis op ijs totdat de oplossing ijskoud wordt. Zodra de oplossing ijskoud is, voegt u 600 μL ijskoude ECU toe om de celpellet te suspenseren en mengt u goed met een pipet van 1.000 μL. Herhaal stap 1.3.2.-1.3.7. voor de overige 12 putten.<ol><li>Voor de overige stappen raadpleegt u stap 1.2.11.-1.2.16.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Vaststelling van enteroïde monolaag- en kraswondtest
<ol><li>Media en behandelingsvoorbereiding<ol><li>Koel 5 ml PBS zonder calcium of magnesium tot het ijskoud is.</li>
		<li>Bereid DMEM-F12 wasbuffer voor door 1 ml van de breedspectrumantibiotica (100 μg / ml) toe te voegen aan 500 ml DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES-buffer). Houd ijskoud.</li>
		<li>Bereid 100 ml HOGMY, zoals beschreven in stap 1.1.1., en verwarm het op de bank tot kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwarm 25 ml 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) in een waterbad van 37 °C.</li>
		<li>Bereid 50 μg/ml, 100 μg/ml en 200 μg/ml ha35 voor celbehandeling, met steriel PBS zonder calcium of magnesium als oplosmiddel. De uiteindelijke verdunning van HA35 zal HOMGY als oplosmiddel gebruiken. OPMERKING: HA35-preparaat kan verschillende verdunningen vereisen, omdat HA35 vaak uit de oplossing komt in een concentratie van meer dan 5 mg / ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Enteroïde monolaagvorming OPMERKING: De volgende procedure biedt volumes die voldoende zijn voor het genereren van één 24-well plaat van enteroïde monolagen. Pas de volumes aan voor het gewenste aantal monolagen.<ol><li>Ontdooi 96 μL op ECM gebaseerde hydrogel BME (fenol roodvrij) 's nachts op ijs bij 2-8 °C. Verdun ECM-gebaseerde hydrogel in ijskoude PBS zonder calcium of magnesium in een verhouding van 1:50. Bestrijk elk putje van een 24-well weefselkweekplaat met 200 μL ijskoude verdunde hydrogel op basis van ECM.</li>
		<li>Incubeer de op ECM gebaseerde hydrogel-gecoate plaat gedurende minimaal 1 uur bij 37 °C en 5% CO2. Aspirateer media uit de 24-well kweekplaat met de 3D-enteroïden bestemd voor monolagen en vervang door 500 μL celdissociatiereagens/put.</li>
		<li>Verbreek handmatig op ECM gebaseerde hydrogelkoepels door 8x-12x op en neer te pipetteren en breng de inhoud van 12 putten over naar een conische buis van 15 ml.</li>
		<li>Was de 12 lege putjes met 250 μL celdissociatiereagens om ervoor te zorgen dat alle enteroïden zijn verwijderd en breng de inhoud over naar een conische buis van 15 ml. Herhaal stap 2.2.5. en stap 2.2.6. voor de overige 12 putten met behulp van een tweede conische buis van 15 ml.</li>
		<li>Centrifugeer de conische buizen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Voeg 10 ml ijskoude DMEM-F12 wasbuffer toe aan 15 ml conische buizen en suspensie de enteroïde pellets door de buizen om te keren. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellets in 12 ml trypsine-EDTA van 37 °C. Plaats de buisjes gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C of totdat de cellen oplosbaar lijken. Voeg 3 ml DMEM-F12 wasbuffer toe aan elke buis om Trypsin-EDTA te verdunnen, meng door de buizen om te keren en plaats op ijs.</li>
		<li>Filter de gedissocieerde enteroïden door een 37 μM mesh celzeef en verzamel de inhoud in schone conische buizen van 15 ml. Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Terwijl de cellen in de centrifuge pelleteren, verwijdert u de op ECM gebaseerde hydrogel-gecoate plaat uit de incubator en zuigt u overtollige hydrogeloplossing op basis van ECM op zonder het gecoate oppervlak te krassen of de plaat volledig te laten drogen.</li>
		<li>Verwijder het supernatant uit de conische buizen en resuspenseer de celpellets met 6 ml HOMGY. Voeg 500 μL van de gecombineerde 12 ml HOMGY-celsuspensie toe aan elke put van de 24-well plaat bedekt met ECM-gebaseerde hydrogel met een zaaidichtheid van ongeveer 3 x 105 cellen / put. Draai de plaat met een deksel erop om een gelijkmatige verdeling van de cellen in de putten te garanderen.</li>
		<li>Incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 en wissel elke 2 dagen HOMGY-media uit totdat de monolagen >90% samenvloeiing bereiken.</li>
	</ol></li>
	<li>Monolayer behandeling en kras wond assay<ol><li>Zodra de monolagen >90% confluency bereiken, aspirateer media om cellen te verwijderen die zich niet hechten. Behandel cellen met 500 μL HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) of PBS, opgelost in HOMGY, gedurende 24 uur.</li>
		<li>Verwijder na 24 uur de media en zorg ervoor dat u het oppervlak van de monolaag niet verstoort. Maak met behulp van een pipetpunt van 200 μL een lineaire kras over de volledige oppervlaktediameter van de monolaag in elke put, waarbij u moet oppassen dat u monolagen niet laat drogen.</li>
		<li>Was de bekraste monolagen 1x met 500 μL 1x PBS. Voeg 500 μL HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) of PBS opgelost in HOMGY toe en breng de plaat over naar het levendcelanalyse-instrument (materiaaltabel) in een CO2-incubator van 37 °C en 5%.</li>
		<li>Klik onder het pictogram Schema in de live-cell analysesoftware (Materiaaltabel) op het pictogram Launch Add New Vessel Wizard en stel de scanfrequentie in om volgens een schema te scannen. Maak een nieuw Whole Well-vat onder Scantype, geef de scaninstellingen op (d.w.z. Fase voor beeldkanalen en 4x voor Doelstelling) en klik op Volgende.</li>
		<li>Selecteer de fabrikant van de plaat en het catalogusnummer in de lijst. Kies onder het pictogram Schema het plussymbool waar de plaat in het live-cell analyse-instrument wordt geplaatst. Selecteer het gewenste scanpatroon en maak vervolgens een plaatkaart door "+" te selecteren op de pagina Plaatindeling. Selecteer Analyse uitstellen tot later en stel vervolgens het scanschema in voor elke 4 uur gedurende 24 uur en controleer de acquisitie-instellingen op de pagina Overzicht van de wizard Vaartuig . Selecteer ten slotte Toevoegen aan schema.</li>
		<li>Zodra de 24-test is voltooid, dubbelklikt u onder het pictogram Weergave op Vessel Name en exporteert u afbeeldingen en films. Selecteer putjes en een reeks afbeeldingen om weer te geven en te exporteren als JPEG. Analyseer afbeeldingen voor procent wondgenezing met behulp van de Wound Healing Size Plugin voor ImageJ21, volgens stap 2.4. onder.</li>
	</ol></li>
	<li>Kras wondanalyse<ol><li>Open ImageJ-software. Upload de scratch wound assay afbeeldingen (. TIFF of .JPG).</li>
		<li>Selecteer Afbeelding > Typ > 8-bits om de afbeelding te wijzigen van 24-bits RGB in 8-bits. Installeer de Wound Healing Size Plugin door Plugins > Macros te selecteren > Install > Wound Healing Size Plugin te installeren.</li>
		<li>Draai de afbeelding zodat de kras verticaal is en initialiseer de Wound Healing Size Tool-plug-in.</li>
		<li>Selecteer de plugin parameters in het dialoogvenster om het beste bij de kras wond te passen. Stel de waarde van de parameters voor opties voor wondgenezingsgrootte als volgt in: Variantievensterradius op 20, Drempelwaarde op 100 en Percentage verzadigde pixels op 0,001 en kies Ja voor Schaal globaal instellen. Voltooi de selectie door op de knop OK te klikken. Controleer of het geselecteerde gebied het wondgebied is. De bovenstaande parameters kunnen standaardisatie van laboratorium tot laboratorium vereisen.</li>
		<li>Herhaal stap 2.4.2.-2.4.4. voor de resterende tijdspunten voor elke kras.</li>
		<li>Bereken het percentage wondgenezing van het krasgebied van migrerende of prolifererende cellen gedurende 24 uur als volgt: % Wondgenezing = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63758/63758eq01.jpg" style="margin: auto;"> waarbij T0 = % oppervlakte op tijdstip 0 h en Tc = % oppervlakte 0 h, 4 h, 12 h of 24 h.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network%2C+January+1995+through+December+1996%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1(2001).</li>
<li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+composition%2C+digestion%2C+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies%3A+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550(2021).</li>
<li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).</li>
<li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis%3A+An+immature+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776(2011).</li>
<li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+the+developing+human+intestine%3A+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li>
<li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li>
<li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk%2C+microbiota%2C+and+intestinal+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li>
<li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enteral+supplementation+of+a+prebiotic+mixture+of+non-human+milk+galacto-%2C+fructo-+and+acidic+oligosaccharides+on+intestinal+permeability+in+preterm+infants%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants.</a> British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).</li>
<li>vanden Berg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+glutamine-enriched+enteral+nutrition+on+intestinal+permeability+in+very-low-birth-weight+infants%3A+A+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parenteral+and+Enteral+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial.</a> Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).</li>
<li>Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li>
<li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li>
<li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li>
<li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14(2019).</li>
<li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li>
<li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546(2020).</li>
<li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030(2021).</li>
<li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li>
<li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4%CE%B1+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li>
<li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+regeneration+ability+of+Crohn%27s+disease+assessed+using+patient-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013(2021).</li>
<li>Gurung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Zika+virus+%28ZIKV%29+infection+following+vaginal+inoculation+with+ZIKV-infected+semen+in+timed-pregnant+olive+baboons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons.</a> Journal of Virology. 94 (11), 00058(2020).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cell+migration+monitoring+to+analyze+drug+synergism+in+the+scratch+assay+using+the+IncuCyte+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).</li>
<li>de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk+nutrients+driving+intestinal+epithelial+layer+maturation+via+Wnt+and+Notch+signaling%3A+Implications+for+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229(2021).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+protects+epithelial+cells+from+excessive+autophagy+and+apoptosis+in+experimental+neonatal+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis.</a> PLoS One. 8 (7), 69620(2013).</li>
<li>Kessler, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li>
<li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan%3A+Its+nature%2C+distribution%2C+functions+and+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover.</a> Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+35kDa+treatment+protects+mice+from+Citrobacter+rodentium+infection+and+induces+epithelial+tight+junction+protein+ZO-1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo.</a> Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).</li>
<li>Prehm, P., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+hyaluronan+export+from+human+fibroblasts+by+inhibitors+of+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters.</a> Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).</li>
<li>Stenson, W. F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth%2C+wound+repair%2C+and+radioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510(2021).</li>
<li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li>
<li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+and+TLR4+mediate+hyaluronic+acid+regulation+of+Lgr5%2B+stem+cell+proliferation%2C+crypt+fission%2C+and+intestinal+growth+in+postnatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).</li>
<li>Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific-sized+hyaluronan+fragments+promote+expression+of+human+beta-defensin+2+in+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).</li>
<li>Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intestinal+epithelial+wound+healing+through+protease-activated+receptor-2+activation+in+Caco2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).</li>
<li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li>
<li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).</li>
<li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+organoids%3A+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen en geen belangenconflicten.

Het maagdarmkanaal van een te vroeg geboren baby staat onder voortdurende regeneratieve druk van herhaalde blootstelling aan milieu-beledigingen geassocieerd met dysbiose, inflammatoire bacteriële metabolieten en toxines, en intermitterende hypoxie23,24. Helaas is het darmepitheel van het te vroeg geboren kind niet in staat om snel functionele integriteit vast te stellen23, wat resulteert in barrièredisfunctie, verhoogde darmdoorlaatbaarhe...

Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een van de meest voorkomende gastro-intestinale noodsituaties bij te vroeg geboren baby's1. De ziekte wordt gekenmerkt door ernstige darmontsteking die snel kan verslechteren tot darmnecrose, sepsis en mogelijk de dood. Hoewel de etiologie onduidelijk is, suggereert bewijs dat NEC multifactorieel is en het resultaat van een complexe interactie van voeding, abnormale bacteriële kolonisatie en een onrijp darmepitheel 2,3. Premature baby's hebben een verhoogde darmdoorlaatbaarheid, abnormale bacteriële kolonisatie en een laag regeneratief vermogen van enterocyten 4,5, waardoor hun risico op intestinale barrièredisfunctie, bacteriële translocatie en NEC-ontwikkeling toeneemt. Daarom is het identificeren van strategieën of interventies om de intestinale epitheliale rijping te versnellen en regeneratie of genezing van het darmepitheel te bevorderen van cruciaal belang bij het voorkomen van deze dodelijke ziekte.
Studies hebben aangetoond dat moedermelk (HM) beschermend is tegen NEC bij te vroeg geboren baby's 6,7,8,9,10,11. Zowel menselijke als dierlijke studies hebben aangetoond dat op runderen gebaseerde formule de darmdoorlaatbaarheid verhoogt en direct toxisch is voor intestinale epitheelcellen 2,12. Hoewel niet volledig opgehelderd, suggereert bewijs dat de beschermende effecten van HM worden gemedieerd door bioactieve componenten zoals lactoferrine, immunoglobuline A (IgA) en HM oligosacchariden13. HM is ook rijk aan hyaluronaat (HA), een uniek niet-gesulfateerd glycosaminoglycaan met herhalend D-glucuronzuur en N-acetyl-D-glucosaminedisachariden14,15. Belangrijk is dat we hebben aangetoond dat orale 35 kDa HA (HA35), een HM HA-nabootsing, de ernst van darmletsel verzwakt, bacteriële translocatie voorkomt en de mortaliteit vermindert in een muizenNEC-achtig darmletselmodel16,17.
Hier worden de effecten van HA35 op darmgenezing en regeneratie in vitro verder onderzocht. Momenteel is de meest gebruikte in vitro assay voor darmbeschadiging en -reparatie een kraswondtest uitgevoerd in colorectale kanker (CRC) celmonolagen. De fysiologische relevantie van een dergelijk model voor de te vroeg geboren darm is beperkt, omdat wondherstel van CRC-cellen sterk afhankelijk is van de zeer proliferatieve aard van kankercellen in plaats van stamcelgestuurde reparatieprocessen18. Om deze beperking te overwinnen, wordt de oprichting van een 2D enteroïde kraswondmodel, inclusief de procedure voor het isoleren en onderhouden van primaire stamcel-afgeleide dunne darm enteroïden van premature niet-menselijke primaten (NHP), hier beschreven. Aangezien premature NEC meestal wordt gemeld in de distale dunne darm, biedt het gebruik van primaire epitheelcelorganoïden in een model van darmbeschadiging en -reparatie een meer fysiologisch vertaalbaar in vitro model in vergelijking met bestaande modellen die traditionele colorectale monolagen gebruiken18,19.

<table><tbody><tr><td>10 mL Serologische Pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-49</td><td></td></tr><tr><td>100x21mm Dish, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conische buis</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>24-Well, TC-behandeld, Platte Bodemplaat</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>37 µM Omkeerbare Cell Strainer</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conische buis</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>70 µm Sterile Cell Strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Albumine, Rund (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) met 15 mM HEPES buffer</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td><td>Sartorius</td><td>4647</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td><td>Sartorius</td><td>9600-0012</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td>Dit is HOGMY, maar zonder de Y-27632 of antibiotica. Ook gebruikt als basis voor HOGM, maar dan alleen zonder de antibiotica.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides van Escherichia coli O111:B4, gezuiverd door gel-filtratie chromatografie</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Fenol Rood-Vrij</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-behandeld, Platte Bodemplaat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Dit zijn breed-spectrum antibiotica</td></tr><tr><td>Natrium Hyaluronaat, Onderzoekskwaliteit, HA20K</td><td>Lifecore Biomedical</td><td>HA20K-1</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td>Bedrijf: Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 1X, 0,25% Trypsin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

effect van hyaluronzuur 35 kda op een in vitro model van te vroeg geboren darmletsel en genezing met behulp van enteroïde-afgeleide monolagen

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

In vitro kraswondtesten worden vaak gebruikt om de mechanismen en kenmerken van epitheliale genezing in verschillende weefseltypen te onderzoeken. Hier beschrijven we een protocol om een tweedimensionale (2D) monolaag te genereren uit driedimensionale (3D) niet-menselijke primaat enteroïden afgeleid van darmcrypten van het terminale ileum. Deze van enteroïden afgeleide monolagen werden vervolgens gebruikt in een in vitro kraswondtest om het vermogen van hyaluronaat 35 kDa (HA35), een ha-mimiek voor moedermelk, te testen om celmigratie en proliferatie langs de epitheliale wondrand te bevorderen. Nadat de monolagen tot confluentie waren gegroeid, werden ze handmatig bekrast en behandeld met HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) of controle (PBS). Celmigratie en proliferatie in de kloof werden in beeld gebracht met behulp van een doorgelaten lichtmicroscoop die is uitgerust voor live-cell imaging. Wondsluiting werd gekwantificeerd als percentage wondgenezing met behulp van de Wound Healing Size Plugin in ImageJ. Het krasgebied en de snelheid van celmigratie en het percentage wondsluiting werden gemeten gedurende 24 uur. HA35 in vitro versnelt wondgenezing in enteroïde monolagen in de dunne darm, waarschijnlijk door een combinatie van celproliferatie aan de wondrand en migratie naar het wondgebied. Deze methoden kunnen mogelijk worden gebruikt als een model om darmregeneratie in de premature menselijke dunne darm te onderzoeken.

De effecten van HA op weefselherstel en wondgenezing in verschillende weefsels en organen zijn goed gedocumenteerd; de specifieke effecten van HA met een molecuulgewicht van 35 kDa op foetale of neonatale genezing en regeneratie van de dunne darm zijn momenteel echter onbekend. Om het vermogen van HA35 te testen om wondgenezing te bevorderen in een model van de foetale of neonatale dunne darm, genereerden we 3D-intestinale enteroïden uit NHP-ileaal weefsel en dissocieerden we dit weefsel verder in afzonderlijke cellen om...

Dit protocol beschrijft een methode om een kraswondtest vast te stellen en uit te voeren op tweedimensionale (2D) monolagen afgeleid van driedimensionale (3D) enteroïden geïsoleerd uit niet-menselijke primatenileum.

Effect van hyaluronzuur 35 kDa op een in vitro model van te vroeg geboren darmletsel en genezing met behulp van enteroïde-afgeleide monolagen

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Dit protocol breidt de veel voorkomende kraswondtest uit die wordt gebruikt voor regeneratiestudies met enteroïde-afgeleide monolagen die alle belangrijke celtypen van de dunne darm vertegenwoordigen. Deze techniek maakt real-time visualisatie van wondsluiting mogelijk in een prematuur 2D enteroïde monolaagmodel van darmregeneratie. Onze techniek kan worden toegepast op de studie van te vroeg geboren darm van zoogdieren, die meestal slecht gemodelleerd is met behulp van getransformeerde colorectale kankercellijnen.Begin met het ontdooien van 96 microliter extracellulaire matrix, of op ECM gebaseerde hydrogel BME, 's nachts op ijs bij twee tot acht graden Celsius. Verdun de op ECM gebaseerde hydrogel en ijskoude PBS zonder calcium of magnesium in een verhouding van één tot 50. Bedek elke put van een 24-well weefselkweekplaat met 200 microliter ijskoude verdunde HYDROGEL op basis van ECM en incubeer de gecoate plaat gedurende minimaal een uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Adem vervolgens de media op uit de 24-well kweekplaat met de 3D-enteroïden die bestemd zijn voor monolagen en vervang deze door 500 microliter celdissociatiereagens per put. Verstoor de op ECM gebaseerde hydrogelkoepels handmatig door acht tot 12 keer op en neer te pipetteren en de inhoud van 12 putten over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter. Was de 12 lege putten met 250 microliter celdissociatiereagens om ervoor te zorgen dat alle enteroïden zijn verwijderd en breng de inhoud over naar conische buizen van 15 milliliter.Centrifugeer de conische buizen op 300 g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Voeg 10 milliliter ijskoude DMEM/F-12 wasbuffer toe aan de conische buizen en suspensie de enteroïde pellets door de buizen om te keren. Centrifugeer op 300g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant.Resuspenseer de celpellets in 12 milliliter van 37 graden Celsius Trypsin-EDTA en plaats de buisjes gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius of totdat de cellen oplosbaar lijken. Voeg drie milliliter DMEM/F-12 wasbuffer toe aan elke buis om Trypsine-EDTA te verdunnen. Meng door de buizen om te keren en op ijs te plaatsen.Filter de gedissocieerde enteroïden door een 37 micrometer mesh celzeef. Verzamel de inhoud in schone conische buizen van 15 milliliter en centrifugeer de buizen gedurende vijf minuten op 300 g bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant uit de conische buizen en resuspenseer de celpellets met zes milliliter HOMGY.Verwijder vervolgens de op ECM gebaseerde hydrogel-gecoate plaat uit de incubator en zuig overtollige HYDROGEL-oplossing op basis van ECU op zonder het gecoate oppervlak te krassen of de plaat volledig te drogen. Voeg 500 microliter van de gecombineerde HOMGY-celsuspensie van 12 milliliter toe aan elke put van de 24-wellplaat bedekt met ECM-gebaseerde hydrogel. Draai de plaat rond met het deksel erop om een gelijkmatige verdeling van cellen in de putten te garanderen.Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide en wissel elke twee dagen HOMGY-media uit totdat de monolagen meer dan 90% samenvloeiing bereiken. Zodra de monolagen meer dan 90% confluency bereiken, ademt u de media op om cellen te verwijderen die zich niet hechten. Behandel de cellen met 500 microliter HA35 of PBS opgelost in HOMGY gedurende 24 uur.Verwijder daarna de media zonder het oppervlak van de monolaag te verstoren. Maak met behulp van een pipetpunt van 200 microliter een lineaire kras over de volledige oppervlaktediameter van de monolaag in elke put, waarbij u moet oppassen dat u de monolagen niet laat drogen. Was de bekraste monolagen eenmaal met 500 microliter 1X PBS en voeg 500 microliter HA35 of PBS opgelost in HOMGY toe.Breng de plaat over naar het live celanalyse-instrument in een incubator van 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Klik onder het pictogram Schema in de live celanalysesoftware op het pictogram Wizard Nieuw vaartuig starten. Selecteer Scannen op schema en klik vervolgens op Volgende.Selecteer Nieuw onder Vaartuig maken en klik op Volgende, selecteer vervolgens Hele put onder Scantype en klik op Volgende. Kies Fase voor beeldkanalen en 4x voor het objectief. Selecteer de plaatfabrikant en het catalogusnummer in de lijst en klik op Volgende.Selecteer een lege vatlocatie gevolgd door het gewenste scanpatroon. Voer de naam van het bord in bij Naam en selecteer plus om een plaatindeling te maken. Selecteer kleine plus om een behandelingsnaam te maken.Voer een korte naam in en vervolgens OK. Markeer de plaatputten die overeenkomen met die behandeling en sla grote plus om putten aan te wijzen met die behandeling. Voer de samengestelde concentratie in en klik op OK. Wanneer de plaat is voltooid, selecteert u OK, Volgende. Selecteer Analyse uitstellen tot later, gevolgd door Nieuw schema maken met scans met tussenpozen van vier uur.Stop met scannen op één dag, nul uur. Zorg ervoor dat de samenvatting correct is en voeg deze vervolgens toe aan de planning. In live celanalysesoftware selecteert u Weergave boven aan het scherm.Navigeer in het menu Scheepsnaam naar uw voltooide 24-uursscan en dubbelklik op de scheepsnaam. Selecteer het pictogram Afbeeldingen en films exporteren aan de linkerkant, gevolgd door de optie Zoals weergegeven. Markeer de interessante bronnen en selecteer vervolgens nuttige tijdspunten en reeks afbeeldingen zoals weergegeven.Zorg ervoor dat het sequentietype en de scans correct zijn. Selecteer de gewenste locatie van de doelmap. Kies JPEG in het vervolgkeuzemenu en vervolgens Exporteren.Open ImageJ-software en upload de kraswondtestafbeelding. Selecteer Afbeelding en typ vervolgens 8-bits om de afbeelding te wijzigen van 24-bits RGB. Selecteer Plug-ins, Macro's, Installeren Wound_healing_size plug-in om de Wound Healing Size Plugin te installeren.Stel daarna de straal van het variantievenster in op 20, de drempelwaarde op 100 en het percentage verzadigde pixels op 0,001. Ja voor Schaal globaal instellen en klik vervolgens op OK. Controleer of het omlijnde gebied het wondgebied is en herhaal dit voor extra krassen. Bereken ten slotte het percentage van het wondgenezing van het krasgebied van migrerende of prolifererende cellen gedurende 24 uur met behulp van de vergelijking die op het scherm wordt weergegeven.Hier is T0 het gebied op tijd nul uur, en TC is het gebied op nul uur, vier uur, 12 uur of 24 uur. Enteroïde generatie en enteroïde-afgeleide monolayer wondgenezingsprocedure worden getoond in deze afbeeldingen. Een cultuur van driedimensionale, niet-menselijke intestinale enteroïden van primaten wordt gebruikt om te dissociëren in tweedimensionale monolagen.Monolagen werden gekweekt tot meer dan 90% samenvloeiing in een 24-well plaat en vervolgens behandeld met HA35 of PBS gedurende 24 uur. Monolayers werden vervolgens bekrast met een P200 pipetpunt. Hier zijn de representatieve beelden van HA35 in controlebehandelingen van niet-menselijke primaten enteroïde monolagen.Beelden werden verkregen op nul uur, vier uur, 12 uur en 24 uur na het uitvoeren van een kras met een P200 pipetpunt. Het effect van HA35 op wondgenezing andoïde monolagen wordt hier getoond. De verandering in wondgenezing in de loop van de tijd bij enteroïde monolagen is afhankelijk van de HA35-behandelingsconcentratie.HA35 verhoogde de wondgenezing aanzienlijk na vier uur en 12 uur bij 100 microgram per milliliter en 200 microgram per milliliter in vergelijking met controle, maar de genezingssnelheden convergeerden tussen behandelingen met 24 uur. Een van de belangrijkste dingen om te onthouden met deze procedure is dat intestinale enteroïde monolagen van korte duur zijn. Dus als ze eenmaal voor 90% vertrouwd zijn, moeten onderzoekers proberen ze snel te gebruiken.Deze techniek is ons go-to-model geworden voor premature darmregeneratie in vitro, vooral als we geïnteresseerd zijn in meer mechanische in plaats van inflammatoire letsels.

effect-hyaluronic-acid-35-kda-on-an-vitro-model-preterm-small

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates the development of necrotizing enterocolitis disease in a human-derived neonatal enteroid model induced by lipopolysaccharides treatment. This model helps to study intestinal pathophysiology.

Induction of Necrotizing Enterocolitis in Human Epithelial Enteroid Model

Dit protocol beschrijft de meting van epitheliale barrière permeabiliteit in real-time volgende farmacologische behandeling in menselijke intestinale organoids met behulp van fluorescentie microscopie en levende cel microscopie.

Real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale Organoids

Enteroids ontstaan als een nieuwe model in de studie van ziekten bij de mens. Het protocol wordt beschreven hoe een enteroid model van menselijke necrotizing enterocolitis met behulp van lipopolysaccharide (LPS) behandeling van enteroids gegenereerd op basis van neonatale weefsel te simuleren. Verzamelde enteroids tonen ontstekingsreactie verwant aan degenen gezien in menselijke necrotizing enterocolitis.

Een nieuwe menselijke epitheliale Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis

Human geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide intestinale organoids bieden spannende mogelijkheden om te modelleren van ziekten in vitro. We tonen de differentiatie van hiPSCs in intestinale organoids (iHOs), de stimulatie van deze iHOs met cytokines, en de microinjectie van salmonella typhimurium in de iHO lumen, waardoor de studie van een epitheel invasie door deze Pathogen.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide intestinale Organoids te bestuderen en te wijzigen epitheel cel bescherming tegen salmonella en andere pathogenen

Hier beschrijven we de voorbereiding van van menselijke organoïden afgeleide intestinale epitheliale monolagen voor het bestuderen van de darmbarrièrefunctie, permeabiliteit en transport. Omdat organoïden de oorspronkelijke reactie van epitheelweefsel op externe stimuli vertegenwoordigen, combineren deze modellen de voordelen van uitbreidbaarheid van cellijnen en de relevantie en complexiteit van primair weefsel.

Organoïde-afgeleide epitheliale monolaag: een klinisch relevant in vitro model voor de darmbarrièrefunctie

Dit protocol beschrijft een apicale necrotiserende enterocolitis (NEC)-in-een-schotelmodel met behulp van enteroïden in de dunne darm met omgekeerde polariteit, waardoor toegang tot het apicale oppervlak mogelijk is. We bieden een immunofluorescentiekleuringsprotocol om NEC-gerelateerde epitheliale verstoring te detecteren en een methode om de levensvatbaarheid te bepalen van apicale enteroïden die zijn onderworpen aan het NEC-in-a-dish-protocol.

In vitro Apiical-Out Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis

Dit protocol beschrijft de oprichting van enteroïden, een driedimensionaal darmmodel, uit foetaal darmweefsel. Immunofluorescente beeldvorming van epitheliale biomarkers werd gebruikt voor modelkarakterisering. Apicale blootstelling van lipopolysacchariden, een bacterieel endotoxine, met behulp van micro-injectietechniek geïnduceerde epitheliale permeabiliteit op een dosisafhankelijke manier gemeten door de lekkage van fluorescerende dextran.

Testen van epitheliale permeabiliteit bij foetale weefsel-afgeleide enteroïden

Hier beschrijven we de constructie van een basis driedimensionaal (3D) intestinale cellijnmodelsysteem en een paraffine-inbeddingsprotocol voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten. Kleuring van geselecteerde eiwitten maakt de analyse van meerdere visuele parameters van een enkel experiment mogelijk voor mogelijk gebruik in preklinische onderzoeken naar geneesmiddelen.

Basis driedimensionaal (3D) darmmodelsysteem met een immuuncomponent

Dit protocol beschrijft een in vitro model van necrotiserende enterocolitis (NEC), dat kan worden gebruikt voor mechanistisch onderzoek naar de pathogenese van ziekten. Het beschikt over een microfluïdische chip bezaaid met darmenteroïden die zijn afgeleid van de menselijke neonatale darm, endotheelcellen en het darmmicrobioom van een pasgeborene met ernstige NEC.

Microfluïdisch model van necrotiserende enterocolitis met menselijke neonatale darmenteroïden en een dysbiotisch microbioom

Dit protocol heeft tot doel biofunctionele zelfassemblerende peptiden te evalueren voor celadhesie, organoïde morfologie en genexpressie door immunokleuring. We zullen een colorectale kankercellijn gebruiken om een kosteneffectieve manier te bieden om organoïden te verkrijgen voor intensieve tests.

Fabricage en karakterisering van organoïden van colorectale kanker uit de SW1222-cellijn in ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix

Deze studie presenteert een protocol voor het genereren van 2D-monolagen in de darm van runderen uit organoïden, en biedt verbeterde toegang voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en ziekteverwekker. Het bevat methoden voor het beoordelen van de integriteit en functionaliteit van het membraan, het bevorderen van in vitro modellen die de gastro-intestinale fysiologie van runderen nabootsen. Deze aanpak belooft aanzienlijke biomedische en agrarische voordelen, waaronder verbeterde...

Vooruitgang in de organoïdetechnologie van runderen met behulp van monolaaginterfaces voor dunne en grote darmen

Leer een scratch-wondassay met enteroïde-afgeleide monolagen voor darmregeneratieonderzoek bij vroeggeborenen. Deze methode maakt real-time visualisatie van wondsluiting mogelijk.

Effect van hyaluronzuur 35 kDa op een in vitro model van te vroeg geboren darmletsel en genezing met behulp van enteroïde-afgeleide monolagen (Video) | JoVE Journal

Effect van hyaluronzuur 35 kDa op een in vitro model van te vroeg geboren darmletsel en genezing met behulp van enteroïde-afgeleide monolagen

Meer video's verkennen