Een competent hepatocytenmodel dat de toegang tot het hepatitis B-virus onderzoekt via natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide als een therapeutisch doelwit

Dit protocol is ontworpen om te verifiëren of een kandidaat-anti HBV-verbinding de virale toegang remt, vooral door NTCP-binding te blokkeren. Deze techniek is bedoeld om te onderzoeken of HBV-invoer of een eerste stap van infectie kan worden onderbroken door een kandidaat-verbinding. De procedure wordt gedemonstreerd door Piyanoot Thongsri, een PSP-student uit mijn laboratorium.

Om te beginnen met de meting van het natrium taurocholaat co-transporterende polypeptide, of NTCP, incubeer de volwassen hepatocyten met acht mill of meer ethyleendiaminetetra-azijnzuur of EDTA gedurende 15 minuten. Verzamel celpellets en fixeer de hepatocyten door gedurende 15 minuten 300 microliter 3,7% paraformaldehyde in PBS toe te voegen. Breng vervolgens de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter om ze gedurende 10 minuten bij 300 G en 25 graden Celsius te centrifugeren.

Was de cellen tweemaal met 700 microliter PBS met 1% foetaal runderserum of FBS in de centrifuge gedurende 10 minuten zoals eerder beschreven. Vervolgens permeabiliseer de cellen met 300 microliter van 0,05% Triton X 100 in PBS bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Geef na de centrifugatie drie wasbeurten van elk één minuut met behulp van 700 microliter PBS met 1% FBS.

Incubeer de cellen gedurende 30 minuten op vier graden Celsius met het primaire antilichaam tegen NTCP in een verhouding van één tot 100, gevolgd door drie wasbeurten met permanentwasbuffer en centrifugatie. Kleur de cellen met een secundair antilichaam geconjugeerd aan Alexa Fluor 488 gedurende 30 minuten op vier graden Celsius en herhaal drie wasbeurten van permanentwasbuffer gedurende elk één minuut. Na centrifugeren bij 300 G, resuspenseren de celpellet met 200 microliter PBS met 1% FBS.

Selecteer in de software de meetparameters voor flowcytometrische analyse, waaronder FSC, SSC, FITC of PE. Stel automatische compensatieaanpassing in en neem de compensatiebesturingselementen op zoals uitgelegd in het manuscript. Voer vervolgens het niet-gekleurde monster uit met een gemiddeld vloeibaar debiet van 60 microliter per minuut. Pas de voorwaartse verstrooiings- en zijverstrooiingsdrempel aan totdat ze de interessante celpopulatie bedekken.

Markeer het poortgebied in dit gebied en pas alle compensatiecontroles toe. Stel de fotovermenigvuldigingsbuis of PMT-fluorescentie in met behulp van de niet-gekleurde regeling en pas de PMT-spanning van FITC of PE in het negatieve kwadrant aan. Voer het positief gekleurde monster uit en pas FITC of PE aan in de positieve kwadrantschaal.

Voer de niet-gekleurde, FITC-gekleurde of PE-besturingselementen uit, bereken de compensatie en pas deze toe op de monsterinstellingen. Voer vervolgens het hepatocytenmonster uit om het NTCP-niveau te meten. Begin vervolgens met het analyseren van de gekleurde hepatocyten door serieel te selecteren op BD FACSuite-vensters, de besturingsbuis en vervolgens het tabblad gegevensbronnen.

Wacht tot de onbewerkte gegevens worden weergegeven. Klik vervolgens op het werkbladtabblad aan de rechterkant op de ellipspoortknop, selecteer de celpopulatie en SSC en de FSC-dot plot met behulp van de muiscursor. Wacht vervolgens tot de cirkel P1 verschijnt.

Klik op de intervalpoortknop en markeer het gebied in het met fluoresceïneisothiocyanaat bevlekte histogram. Vanaf de hoogste fluorescentie-intensiteitswaarde aan de rechterkant. De lijn P2 verschijnt op het scherm.

Klik op de experimentbuis en merk op dat de gegevens op het werkbladtabblad veranderen. Klik op de knop Statistieken en vervolgens op de lege ruimte en het werkblad. Observeer vervolgens de statistische waarden van de natrium taurocholaat co-transporterende polypeptide populatie.

Aspirateer het medium uit de 100% confluente MHC-putplaten en voeg vier micromolaire ciclosporine A toe, verdund met William's E Medium gedurende twee uur. Aspirateer vervolgens de kandidaat-hepatitis B-virusinvoerremmer om deze te vervangen door één milliliter Williams E Medium met 4% polyethyleenglycol. Incubeer vervolgens het kweekmedium met hepatitis B-virusdeeltjes bij een veelvoud aan infectie van 100 per put gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius.

Gooi vervolgens het supernatant weg bij twee milliliter koude PBS en draai voorzichtig om het oude medium met ongebonden hepatitis B-virus af te spoelen. Na het kweken van de cellen met twee milliliter van complete William's E Medium gedurende zeven dagen, was de cellen met PBS en fixeer ze met 3,7% paraform aldehyde en PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer de geïnfecteerde cellen sequentieel met IF-blokkerende oplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in het primaire antilichaam bij één tot 200 verdunning in de blokkerende oplossing 's nachts bij vier graden Celsius.

Geef vervolgens drie wasbeurten van elk één minuut met behulp van een wasoplossing voordat u de cellen met het secundaire antilichaam in één tot 500 verdunning gedurende één uur bij kamertemperatuur incubeert. Monteer het monster na drie keer wassen met een antivervagingsmontagemedium met DAPI en bedek het met een glazen afdekslip. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met DAPI- en PE-filters detecteert het fluorescentiesignaal met een 20 x objectieve lens om de anti HBV-entry-activiteit van de kandidaat-verbindingen te bepalen.

Bereid voor de celbindingstest de cellen voor zoals eerder aangetoond en incubeer ze met hepatitis B-virusdeeltjes bij vier graden Celsius gedurende twee uur. Nadat u het medium hebt weggegooid, spoelt u de cellen af met twee milliliter koude PBS met een zachte werveling. Oogst vervolgens de geïnfecteerde cellen met behulp van een celschraper en verstoor de cellen met lysisbuffer.

Breng het cellysaat over naar een verzamelbuis om het totale DNA te extraheren met polymerasekettingreactie met behulp van de temperatuuromstandigheden die in het manuscript worden beschreven. Na het bereiden van de cellen zoals eerder aangetoond, incubeer de hepatocyten met de natrium taurocholzuuroplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, aspirateer de oplossing en was de cellen driemaal met koude HEPES. Voeg vervolgens 300 tot 500 microliter koude HEPES toe om de cellen met celschrapers op ijs te oogsten.

Homogeniseer de cellen door ultrasoon geluid bij 20 kilohertz gedurende 20 seconden en incubeer gedurende vijf minuten op ijs. Verzamel na centrifugatie bij 10.000 G het supernatant en evalueer de intracellulaire taurocholzuurconcentratie met behulp van een taurocholzuur ELISA-testkit. Om de cellen en spuit in de isothermische titratiecalorimetrie of het ITC-instrument te wassen, start u de ITC-software.

Selecteer onder het tabblad Experiment uitvoeren de microkalkmethode voor 19 injectiepunten ITCM en klik op Openen. Wanneer een nieuw venster wordt geopend, klikt u op het tabblad Reinigen en selecteert u in het venster reinigingsmethode de wasknop voor de celreinigingsmethode en de spoelknop voor de spuitreinigingsmethode. Klik op Volgende en volg de instructies op het scherm.

Nadat u het voorbeeld in de ITC hebt geladen, klikt u op de laadknop onder het tabblad Experiment uitvoeren. Klik vervolgens op Volgende en volg de video-instructies totdat deze laadstap is voltooid. Vul met behulp van een spuit de referentiecel met een oplossingsbuffer in de monstercel met 15 micromolaire NTCP in de buffer.

Verwijder de overtollige oplossing en vul de spuit met een 150 Micromolaire Curcumin Ligand-oplossing, waardoor luchtbellen worden vermeden. Voer het voorbeeld uit door op de knop Uitvoeren onder het tabblad Experiment uitvoeren te klikken. De experimentele informatie en instellingen worden aan de linkerkant weergegeven.

Voer de ligandeiwitconcentraties en temperatuurgegevens in. Klik op start om het injectieproces uit te voeren. Wacht 1,4 uur totdat de eiwitligandinteractie is voltooid.

Zodra de injectie is voltooid, selecteert u de gemarkeerde analyseknop om de onbewerkte gegevens te analyseren met behulp van de analysesoftware. Klik vervolgens op overzicht om de onbewerkte gegevens weer te geven en kies het aanpassingsmodel als één set bindingsplaatsen. Leverrijpingskenmerken werden waargenomen, waaronder binucleated cellen en polygonaal gevormde morfologie, vooral in het gedifferentieerde stadium van MHC.

Een grote toename van NTCP-expressie werd waargenomen in gedifferentieerde HepaRG en gedifferentieerde MHC. De sterk geglycosyleerde vorm van NTCP werd meer gedetecteerd in gedifferentieerde MHC dan in gedifferentieerde HepaRG. De NTCP-niveaus waren hoger in gedifferentieerde MHC-cellen dan in de ongedifferentieerde cellen.

Virusimmunofluorescentiekleuring evalueerde de anti HBV-entry-activiteiten op dag zeven na infectie en het niveau van virusbinding op de celoppervlakreceptor werd geëvalueerd door real-time polymerasekettingreactie. Taurocholzuuropnameanalyse suggereerde dat de punitieve remmende activiteit van kandidaat-verbindingen de hepatitis B-virusbinding via NTCP verminderde. De colorimetrische verandering werd gedetecteerd met continue injecties in de monstercel.

Een standaard niet-lineaire kleinste kwadratenregressie werd uitgezet op basis van één bindingsplaats die goed bij de gegevens paste. De ononderbroken lijn gaf aan dat de beste fit was voor de experimentele waarden voor SBB-binding als a en dat cellen en hepatitis B-virale deeltjes worden geïncubeerd bij vier graden Celsius. Taurocholzuur update kan worden geëvalueerd met behulp van de radioactieve techniek.

Het niveau van radioactief taurocholzuur kan worden gekwantificeerd met behulp van een vloeistofsimulatieteller. Deze techniek is eenvoudig en snel te screenen op virale invoer in onderzoeksactiviteit van elk antiviraal regime dat infectie of herinfectie zou helpen voorkomen.