Gestandaardiseerde in vitro assays om interacties tussen menselijke neutrofielen en staphylococcus aureus biofilms te visualiseren en te kwantificeren

Deze protocollen zijn ontworpen om te begrijpen hoe menselijke neutrofielen interageren met bacteriële biofilms en deze doden. Het doel is om dit beter te begrijpen en de variabiliteit van test tot test te beperken, begrijpend dat er inherente problemen zijn met menselijke neutrofielen van donor tot donorvariatie. De hier genoemde technieken zijn geoptimaliseerd om de gebruikers in staat te stellen experimenten uit te voeren met minimale variabiliteit, vooral met losjes bevestigde biofilms.

Bovendien kunnen deze protocollen ook worden aangepast om andere microben te bestuderen die biofilms kunnen vormen. Begin met het verkrijgen van geïsoleerde kolonies Staphylococcus aureus uit een gecryopreserveerde voorraad met behulp van een streakplaattechniek op een voedingsrijke agarplaat, zoals tryptische soja-agar. Bekleed individuele putten van een 96-wellsplaat met 100 microliter PLL verdund in steriel water en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Aspirateer de PLL-oplossing aseptisch met behulp van een vacuümondersteunde aspiratieval. Laat de putjes een nacht op kamertemperatuur drogen. Bereid een nachtcultuur voor door een kolonie S.aureus in MEM-alfa te enten, aangevuld met 2% glucose en geïncubeerd bij 37 graden Celsius gedurende 16 tot 18 uur bij 200 rotaties per minuut.

Verdun de nachtcultuur door 50 microliter over te brengen op vijf milliliter verse MEM-alfa aangevuld met 2% glucose. Incubeer het vervolgens bij 37 graden Celsius met 200 rotaties per minuut totdat de middelste logaritmische fase is bereikt. Gebruik MEM-alfa om de mid-logaritmische cultuur te normaliseren tot een OD van 0,1.

Breng 150 microliter genormaliseerde cultuur over naar elk putje van de met PLL behandelde 96-well plaat. Incubeer de plaat in een bevochtigde kamer bij 37 graden Celsius gedurende 18 tot 20 uur. Aspirateer het supernatant om de planktoncellen te verwijderen.

Was de resterende biomassa voorzichtig met 150 microliter HBSS om de niet-gehechte cellen te verwijderen. Herhaal dit minstens twee keer om alle planktoncellen te verwijderen. Voeg 100 microliter 20% normaal humaan serum verdund in HBSS druppelsgewijs toe aan de gewassen biofilm en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius om de biofilm te opsoniseren.

Aspirateer de serumoplossing en was de biofilms druppelsgewijs met 150 microliter HBSS. Aspirateer de HBSS en laat putten achter met opsonized biofilms. Voeg luminol toe aan de neutrofielen die opnieuw in HBSS zijn gesuspendeerd om een uiteindelijke concentratie van vijf micromolaire luminol te vormen.

Deze oplossing is klaar voor gebruik voor groepen A en C.Voeg neutrofielen gemengd met luminol toe aan de putten met opsonized biofilms. Bereid voor groep D 50 micromolaire luminoloplossing in HBSS in een aparte buis zonder neutrofielen en voeg deze toe aan de put met de biofilm. Aliquot 350 microliter neutrofielen gemengd met luminol en voeg PMA toe met een uiteindelijke concentratie van 500 nanogram per milliliter aan het mengsel.

Voeg voor groep B de neutrofielen uit dit mengsel toe aan putjes zonder biofilm. Dit dient als een positieve controle. Centrifugeer de plaat op 270 RCF gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius.

Zorg ervoor dat de plaatlezer is ingesteld op 37 graden Celsius, de luminescentie en kinetische aflezing gedurende 60 minuten met intervallen van drie minuten. Plaats de plaat in de plaatlezer om de ROS-productie door neutrofielen gedurende 60 minuten te meten. Gebruik een fluorescerende stam van S.aureus, zoals USA300, die GFP tot expressie brengt om microscopiebeelden te vergemakkelijken.

Incubeer neutrofielen met 100 micromolaire BCD gedurende 30 minuten in een rocker bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide in de atmosfeer. Zorg ervoor dat de monsters in het donker worden geïncubeerd en beperk de blootstelling aan licht. Om overtollige BCD te wassen, centrifugeer neutrofielen op 270 RCF gedurende vijf minuten en aspirateer het supernatant.

Suspensie de neutrofielen opnieuw in verse HBSS. Voeg vervolgens ethidium homodimeer-1 toe aan de BCD-gekleurde neutrofielen in een uiteindelijke concentratie van vier micromolar om neutrofielen en bacteriële dood te controleren. Was de biofilm met HBSS en voeg 150 microliter neutrofielen toe aan de S.aureus-biofilm die in microverschuivingen is gekweekt.

Incubeer de microslides in een bevochtigde kamer gedurende 30 minuten. Het aantal bacteriële cellen zal worden gebaseerd op de celtellingen verkregen uit de 18-uurs biofilmplating. Beeld de neutrofiele biofilminteractie af met behulp van fluorescerende kanalen die overeenkomen met fluorescerende kleurstoffen, of excitatie- en emissiegolflengten van eiwitten.

Bacteriële groeimedia minimaliseerden de levensvatbaarheid van neutrofielen tot ongeveer 60% na 30 minuten incubatietijd. Zoogdiercelkweekmedia hadden echter geen invloed op de levensvatbaarheid van neutrofielen en kunnen ook de groei van S.aureus-biofilms ondersteunen. Neutrofielen behandeld met PMA gebruikt als controle vertoonden een verhoogde ROS-productie.

Bij afwezigheid van biofilms vertoonden neutrofielen behandeld met PMA een robuuste ROS-productie. In aanwezigheid van S.aureus-biofilm nam de totale ROS-productie door neutrofielen behandeld met PMA af, terwijl bij afwezigheid van PMA neutrofielen uitsluitend vertrouwden op hun interactie met de biofilm, waardoor de ROS-productie verder werd verminderd. Widefield fluorescerende microscopie onthulde dat veel neutrofielen gelokaliseerd waren aan de oppervlakte, terwijl een paar zich in de S.aureus-biofilms bevonden.

De meeste S.aureus-cellen die interactie hadden met neutrofielen waren dood, terwijl een paar in leven bleven zoals bepaald door LIVE / DEAD-kleuring. Ethidium homodimeer-1-gekleurde biofilms onthulden een fractie van de dode S.aureus-populatie binnen de biofilm. Het effect van het wassen van de biofilm en neutrofielen na 30 minuten incubatie om niet-gehechte neutrofielen te verwijderen, onthulde dat ongeveer 33% van de dode neutrofielen nog steeds aan de biofilm was gehecht.

De hier genoemde protocollen kunnen ook worden gebruikt om andere functionaliteiten van neutrofielen verder te bestuderen, zoals fagocytose en de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen wanneer neutrofielen biofilms tegenkomen.