Name: Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Leer hoe je met confocale en superresolutiemicroscopie de intracellulaire verkeersstromen en secretie van keldermembraaneiwitten in Drosophila-oögenese kunt visualiseren. Deze methode biedt inzicht in eiwitdynamiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn Julie Merkle dankbaar voor haar nuttige commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie R15GM137236 aan O.D. De confocale en superresolutiebeelden werden verkregen met behulp van een Zeiss LSM 900 met Airyscan 2, gekocht met NSF MRI-subsidie 2018748.

De auteurs hebben niets te onthullen.

De BM is van cruciaal belang voor embryonale en orgaanmorfogenese en fysiologische functies bij volwassenen. Bovendien fungeert de BM als een signaleringsplatform voor het vaststellen en onderhouden van epitheliale polariteit en biedt weefsels ondersteuning2. Toch zijn de mechanismen die de juiste plaatsing van BM-eiwitten reguleren slecht begrepen. Een beter begrip van de biologische routes gewijd aan de intracellulaire handel en gepolariseerde secretie van BM-eiwitten vereist een zorgvuldige ana...

Het keldermembraan (BM) is een dunne plaat van gelaagde cel-adherente extracellulaire matrix (ECM) die cruciaal is voor de epithelstructuur en morfogenese1. Het bestaat uit ~ 50 eiwitten en wordt alomtegenwoordig aangetroffen onder de epitheel- en endotheelcellen, en verwarmt skelet-, gladde en hartspiercellen en adipocyten 1,2,3. De drie belangrijkste componenten van de BM aan de basale kant van de epitheelcellen zijn Collageen IV, Perlecan en Lamininen. De BM ligt ten grondslag aan de epitheelcellen en is verantwoordelijk voor vele functies, waaronder weefselscheiding en -barrière, groei en ondersteuning, en celpolarisatie 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Zijn rol als signaleringsplatform reguleert de morfologie en differentiatie van epitheelcellen en weefsels tijdens de ontwikkeling 3,13,14. Bovendien zijn de verkeerde regulatie van de BM en /of een schending van de integriteit ervan de primaire oorzaken van veel pathologische aandoeningen, waaronder tumormetastase 2,15,16. Ondanks de essentiële functies die de BM uitvoert tijdens weefsel- en orgaanmorfogenese, zijn de componenten van de biologische route (s) gewijd aan de gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten vaag bekend.
Om de intracellulaire handel van BM-bevattende blaasjes en de secretie van BM-eiwitten door epitheelcellen te bestuderen, is het folliculaire epitheel (FE) van de Drosophila-eierstok een krachtig modelsysteem (figuur 1). Een Drosophila-eierstok bestaat uit 16-20 lange, buisachtige structuren, ovarioles genaamd (figuur 1A, B)17,18,19. Elke ovariole kan worden gezien als een eierassemblagelijn, met de leeftijdsprogressie van eikamers (die elk aanleiding geven tot een ei) die begint aan het voorste uiteinde en achterste beweegt, totdat het rijpe ei door de eileider naar buiten komt. Elke eikamer wordt ingekapseld door de FE, een monolaag van somatische follikelcellen (FCs), die de centrale kiembaancellen (GC's) omringt. De FE is sterk gepolariseerd met een duidelijke apicale-basale polariteit waarbij het apicale domein naar de kiembaan is gericht en de BM-eiwitten basaal worden uitgescheiden18,19. De VC's scheiden actief alle belangrijke componenten van de BM af, waaronder Collagen IV, Perlecan en Laminins20,21. In epitheelcellen zoals FCs worden de BM-componenten geproduceerd en vereisen ze een gespecialiseerde gepolariseerde secretieroute voor hun afzetting extracellulair. Bijvoorbeeld, in het geval van de meest voorkomende component van de BM, Collageen IV (Coll IV), zijn de details rond de gepolariseerde intracellulaire handel en secretie vaag, ondanks dat de productie en afzetting de focus is van veel studies. Coll IV wordt vertaald in het endoplasmatisch reticulum (ER), waar ook elk fibril - samengesteld uit drie polypeptiden (twee α1-ketens en één α2-keten) - wordt geassembleerd tot een drievoudige helix22. Een goede Coll IV-vouwing en -functie vereisen ER-chaperonnes en enzymen, waaronder lysyl- en prolyl-hydroxylasen zoals Plod en PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Deze posttranslationele enzymen reguleren de ER-sortering van Coll IV, omdat het verlies van elk ervoor zorgt dat Coll IV gevangen zit in de basale ER 20,23,24,25,26. Vervolgens verlaat nieuw gesynthetiseerde Coll IV de ER voor de Golgi in COPII-gecoate blaasjes. De ladingreceptor Tango1 helpt bij het verpakken van collageen in aanzienlijke Golgi-gebonden blaasjes die plaats bieden aan grote multimere eiwitten20,27. Zodra Coll IV is verpakt in intracellulaire exocytaire blaasjes, wordt het specifiek basaal uitgescheiden uit epitheelcellen. Om BM-afzetting naar de basale kant te leiden, hebben epitheelcellen een andere reeks factoren nodig die specifiek zijn gewijd aan gepolariseerde BM-secretie. Met behulp van de FE van de Drosophila-eierstok zijn enkele componenten van dit nieuwe cellulaire proces gekarakteriseerd, waaronder de nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEF's) Crag en Stratum, de GTPases Rab8 en Rab10, evenals de niveaus van de fosfoinositide PI (4,5) P2 en Kinesine 1 en 3 motoreiwitten 20,28,29,30,31 . Deze componenten zijn van cruciaal belang voor de gepolariseerde verdeling van BM-eiwitten.
Om de intracellulaire lokalisatie van BM-eiwitten in de FE te monitoren, kunnen endogene gelabelde keldermembraaneiwitten (eiwitvallen), zoals Viking-GFP (Vkg-GFP of α2 Coll IV-GFP) en Perlecan-GFP (Pcan-GFP) worden gebruikt 32,33. Van deze eiwitvallijnen is aangetoond dat ze de endogene verdeling van BM-eiwitten nauwkeurig weergeven en een gevoeligere detectie van vesiculaire handel mogelijk maken28,30. De componenten die betrokken zijn bij de gepolariseerde afzetting van BM in de FE werden voor het eerst gekarakteriseerd met behulp van eiwitvallijnen voor Vkg-GFP en Pcan-GFP 20,28,29,30. Eiwitvallen kunnen worden gebruikt in verschillende genetische achtergronden, waaronder mutanten en Gal4-lijnen 34. Bovendien kunnen eiwitvallen worden gebruikt in combinatie met fluorescerende kleurstoffen en/of fluorescentie-immunostaining, waardoor een nauwkeurige karakterisering van de lokalisatie van BM-eiwitten mogelijk is bij het vergelijken van wildtype en mutante condities35.
Om de distributie en lokalisatie van BM-eiwitbevattende blaasjes nauwkeurig en efficiënt te beoordelen, vormen confocale laserscanmicroscopie (CLSM) en beeldvormingstechnieken met superresolutie een aanzienlijk voordeel voor andere beeldvormingsbenaderingen. Deze benaderingen koppelen beeldvorming met hoge resolutie aan relatief gebruiksgemak. CLSM is een microscopietechniek die een verbeterde optische resolutie mogelijk maakt door het monster met een laser te scannen op een rasterscanmanier met behulp van galvanometers. De opening van het gaatje is een kerncomponent van een confocale microscoop. Door de onscherpe signalen van boven of onder het brandpuntsvlak te blokkeren, resulteert het gaatje diafragma in een zeer superieure resolutie in de z-as36. Dit maakt het ook mogelijk om een reeks afbeeldingen in het z-vlak te verkrijgen, een z-stack genaamd, die overeenkomen met een reeks optische secties. z-stacks maken vervolgens een 3D-beeld van het specimen, via 3D-reconstructie, met behulp van beeldbewerkingssoftware. Conventionele epifluorescentie (widefield) microscopen, in tegenstelling tot confocale microscopen, zorgen ervoor dat onscherp licht bijdraagt aan de beeldkwaliteit, waardoor de beeldresolutie en het contrastmet 36,37 afnemen. Dit maakt epifluorescentiemicroscopie een minder aantrekkelijke kandidaat bij het bestuderen van eiwitlokalisatie of colocalisatie.
Hoewel CLSM een geschikte aanpak is voor verschillende toepassingen, waaronder beeldvorming en karakterisering van de intracellulaire handel in BM-eiwitten, vormt het nog steeds een probleem bij het afbeelden van monsters onder de diffractielimiet van Abbe van licht (200-250 nm). Bij het afbeelden van dergelijke monsters kan confocale microscopie, vooral bij gebruik van een olieobjectief, resulteren in een hoge resolutie. Superresolutietechnieken overschrijden echter de limiet van confocale microscopie. Er zijn verschillende benaderingen om superresolutiemicroscopie te bereiken, elk met specifieke resolutielimieten en elk geschikt voor verschillende analyses. Deze benaderingen omvatten foto-geïnactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) of stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie (STED), gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) en Airyscan (superresolutie) microscopie 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Hoewel Airyscan een grovere resolutie heeft dan PALM / STORM, STED en SIM, kan het nog steeds een resolutie van maximaal ~ 120 nm bereiken (ongeveer twee keer de resolutie van CLSM). Bovendien is aangetoond dat deze superresolutiemicroscopiebenadering een voordeel heeft ten opzichte van SIM- en andere superresolutietechnieken bij het afbeelden van dikke monsters en monsters met een lage signaal-ruisverhoudingvan 47,48.
Airyscan is een relatief nieuwe superresolutie confocale microscopietechnologie46. In tegenstelling tot traditionele CLSM's, die de pinhole- en single point-detectors gebruiken om onscherp licht af te stoten, maakt deze superresolutiebenadering gebruik van een 32-kanaals galliumarsenidefosfide (GaAsP) fotomultiplicatorbuisgebieddetector die al het licht verzamelt op elke scanpositie45. Elk van de 32 detectoren werkt als een klein gaatje, waardoor de pinhole-grootte wordt verkleind van de traditionele 1.0 Airy Unit (A.U.) tot een verbeterde 0.2 A.U., waardoor een nog hogere resolutie en signaal-ruisverhouding mogelijk is, met behoud van de efficiëntie van een 1.25 A.U. diameter45. Bovendien resulteert de lineaire deconvolutie die Airyscan gebruikt in een tot 2x hogere resolutie45. Dit in aanmerking nemend, zijn CLSM, en specifiek superresolutiemicroscopie, zeer geschikt om BM-eiwitten en eiwitten te bestuderen die de basale afzetting van BM-eiwitten reguleren, omdat ze afbeeldingen met een zeer hoge resolutie kunnen produceren voor lokalisatie- en colokalisatiestudies, waardoor nieuwe inzichten worden verkregen in de ruimtelijke, temporele en moleculaire gebeurtenissen die deze processen beheersen.
Een alternatieve benadering van confocale microscopie die kan worden gebruikt om lokalisatie-experimenten uit te voeren, is beelddeconvolutie. Aangezien widefield-microscopie het mogelijk maakt om onscherp licht de detectoren te bereiken, kunnen wiskundige en computationele deconvolutie-algoritmen worden toegepast om onscherp licht uit beelden verkregen door widefield-microscopie te verwijderen of opnieuw toe te wijzen, waardoor de resolutie en het contrast van het beeld worden verbeterd49. Deconvolutie-algoritmen kunnen ook worden toegepast op confocale beelden om de resolutie en het contrast verder te verhogen, waardoor uiteindelijke beelden worden geproduceerd die bijna vergelijkbaar zijn met die van superresolutiemicroscopie50. Airyscan maakt gebruik van Weiner filter-gebaseerde deconvolutie samen met Sheppard's pixel hertoewijzing, wat resulteert in een sterk verbeterde ruimtelijke resolutie en signaal-ruisverhouding. Vergeleken met confocale microscopie wordt een toename van 2x in resolutie in alle drie de ruimtelijke dimensies (120 nm in x en y en 350 nm in z) waargenomen bij gebruik van deze superresolutiemicroscopietechniek45,51.
Dit manuscript biedt gedetailleerde en geoptimaliseerde protocollen om de intracellulaire handel en afzetting van BM-eiwitten te kleuren, te verwerven en te visualiseren met behulp van de FE van de Drosophila-eierstok als een modelsysteem in combinatie met confocale en superresolutiemicroscopie. Drosophila-lijnen die endogene gelabelde keldermembraaneiwitten tot expressie brengen, bijvoorbeeld Vkg-GFP en Pcan-GFP, zijn efficiënte en nauwkeurige hulpmiddelen om BM-eiwithandel en -secretie te visualiseren. Bovendien kunnen ze gemakkelijk worden gebruikt in verschillende genetische achtergronden, waaronder mutant en Gal4 / UAS-lijnen 34. Hoewel endogeen gelabelde keldermembraaneiwitten worden aanbevolen, is het gebruik van antilichamen tegen specifieke BM-eiwitten ook compatibel met de beschreven protocollen. Deze protocollen zijn vooral nuttig voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van intracellulaire handel en de secretie van BM-eiwitten in intact epitheelweefsel met behulp van confocale en superresolutie beeldvorming. Bovendien maakt de mogelijkheid om epitheliale weefselanalyse te combineren met de uitgebreide hulpmiddelen van Drosophila genetica deze aanpak bijzonder krachtig. Ten slotte kunnen deze protocollen eenvoudig worden aangepast om de vesiculaire handel en het sorteren van andere interessante eiwitten te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>F-Actin Stain (1/500 van 66&micro;M)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>F-Actin Stain (1/100 van 66&micro;M))</td></tr><tr><td>Anti-GM130 Antibody</td><td>abcam</td><td>ab30637</td><td>Voor Golgi Stain (colocalisatie); gebruik als concentratie van 7&micro;g/uL</td></tr><tr><td>Aqua-Polymount</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>1860620</td><td>Inbeddingsmedium</td></tr><tr><td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Om de eierstokken te vetteren voor dissectie</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (30% oplossing)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td>Voor blokkeeroplossing</td></tr><tr><td>Depressieputjes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>7156101</td><td>Voor dissectie (glazen concaviteitsschuif kan in plaats daarvan worden gebruikt)</td></tr><tr><td>Dissectie naald</td><td>Fisher scientifc</td><td>13-820-024</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Incubator</td><td>Genesee Scientific/Invictus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila lijn (ZCL1700)</td><td></td><td></td><td>Morin et al., 2001</td></tr><tr><td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi lijn (TRIP lijn HMS00241)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>33594</td><td>RNAi tegen Crag</td></tr><tr><td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila lijn (CC00791)</td><td></td><td></td><td>Buszczak et al., 2007</td></tr><tr><td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td><td></td><td></td><td>Devergne et al., 2017. De expressie van Crag RNAi in de FE aansturen</td></tr><tr><td>Pincet (Dumont 5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Voor dissectie</td></tr><tr><td>Glazen Concaviteitsschuif</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>7187804</td><td>Voor dissectie (depressieputjes kunnen in plaats daarvan worden gebruikt)</td></tr><tr><td>Geit anti-Konijn IgG, Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11036</td><td>Secundaire antilichaam (GM130 antilichaam) (5 &micro;g/mL)</td></tr><tr><td>Hoechst (Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>DNA Stain (1 ug/mL)</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>Fisher Scientific: 06-666</td><td>Delicate task wipers</td></tr><tr><td>Leica Fluorescerende Stereo Microscoop&nbsp; M165 FC</td><td>Leica</td><td></td><td>Voor eierstokbeeldvorming</td></tr><tr><td>Microscoopglazen</td><td>Corning</td><td>294875X25</td><td>Microscoopglazen</td></tr><tr><td>Nutating platform rocker</td><td>Corning Life Sciences</td><td>6720</td><td>Voor eierstokfixatie en kleuring</td></tr><tr><td>Nutri-Fly BF</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>Vliegvoer</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 20% Oplossing</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Fisher Scientific: 15713</td><td>Voor PFA 4%</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing tabletten</td><td>Fisher scientific</td><td>BP2944100</td><td>Voor PBS oplossing</td></tr><tr><td>ProLong Glass Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td>Inbeddingsmedium</td></tr><tr><td>Vierkante Dekglas</td><td>Corning</td><td>285022</td><td>Dekglas voor microscoopglazen</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td>Voor PBST</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900 met Airyscan 2</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Confocale en superresolutie microscoop</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Dissectiemicroscoop</td></tr><tr><td>Zeiss Zen Software versie 3.3 (Blue Edition)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Beeldverwerving en -verwerking</td></tr></tbody></table>

confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens drosophila oogenesis

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Het keldermembraan (BM) - een gespecialiseerd vel extracellulaire matrix aanwezig aan de basale kant van epitheelcellen - is van cruciaal belang voor de vaststelling en het onderhoud van epitheliale weefselmorfologie en orgaanmorfogenese. Bovendien is de BM essentieel voor weefselmodellering, dient het als een signaleringsplatform en biedt het externe krachten om weefsels en organen te vormen. Ondanks de vele belangrijke rollen die de BM speelt tijdens normale ontwikkeling en pathologische omstandigheden, zijn de biologische routes die de intracellulaire handel van BM-bevattende blaasjes beheersen en hoe basale secretie leidt tot de gepolariseerde afzetting van BM-eiwitten slecht begrepen. Het folliculaire epitheel van de Drosophila-eierstok is een uitstekend modelsysteem om de basale afzetting van BM-membraaneiwitten te bestuderen, omdat het alle belangrijke componenten van de BM produceert en afscheidt. Confocale en superresolutie beeldvorming in combinatie met beeldverwerking in vaste weefsels maakt de identificatie en karakterisering mogelijk van cellulaire factoren die specifiek betrokken zijn bij de intracellulaire handel en afzetting van BM-eiwitten. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het kleuren en afbeelden van BM-bevattende blaasjes en gedeponeerde BM met behulp van endogene gelabelde eiwitten in het folliculaire epitheel van de Drosophila-eierstok . Dit protocol kan worden toegepast om zowel kwalitatieve als kwantitatieve vragen aan te pakken en het is ontwikkeld om high-throughput screening mogelijk te maken, waardoor factoren die betrokken zijn bij de gepolariseerde intracellulaire handel en afscheiding van blaasjes tijdens de ontwikkeling van epitheelweefsel mogelijk is.

De hierin beschreven methoden kunnen worden gebruikt om de intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten in gepolariseerde epitheelcellen, zoals de FE van de Drosophila-eierstok , efficiënt en nauwkeurig in beeld te brengen en te karakteriseren. Vervolgens bieden we verwachte resultaten die zijn verkregen met behulp van de beschreven methoden, evenals nuttig advies en mogelijke valkuilen. Om dit te doen, wordt Vkg-GFP, een endogeen gelabelde Vkg (Drosophila Col IV) gebruikt. Dezelfde resultaten kun...

Het keldermembraan is essentieel voor weefsel- en orgaanmorfogenese tijdens de ontwikkeling. Om de mechanismen die leiden tot de juiste plaatsing van deze structuur beter te begrijpen, beschrijft het gepresenteerde protocol methoden om de intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten in epitheelcellen te visualiseren en te karakteriseren met behulp van confocale en superresolutiemicroscopie.

Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Dit protocol maakt de karakterisering van de intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten mogelijk met behulp van de Drosophila-array als modelsysteem. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat het hoge resolutie beeldvorming van de intracellulaire handel van keldermembraaneiwitten mogelijk maakt met behulp van endogene eiwitten en Airyscan superresolutiemicroscopie. Hoewel dit protocol is ontwikkeld om de intracellulaire handel van keldermembraaneiwitten in beeld te brengen, kan het worden uitgebreid om de handel in andere eiwitten van belang en andere biologische systemen, waaronder celcultuur en organoïden, te bestuderen.Om te beginnen, na het ontleden van Drosophila-eierstokken in PBS onder een ontleedbereik, voegt u een milliliter fixatieoplossing toe en fixeert u de eierstokken gedurende 15 minuten op een nutating-platform. Verwijder de fixatieoplossing en voer twee snelle wasbeurten uit, elk met één milliliter PBST. Door de microcentrifugebuizen vijf tot zes keer voorzichtig om te keren en vervolgens vier lange wasbeurten van elk 10 minuten uit te voeren met één milliliter PBST op een nootvormende platformrocker.Na het uitvoeren van fixatie en wassen, verwijdert u PBST, voegt u vervolgens een milliliter blokkerende oplossing toe en blokkeert u de eierstokken op een nootvormende platformknop gedurende minimaal een uur. Verwijder vervolgens de blokkerende oplossing en voeg 300 microliter primaire antilichaamoplossing toe, die primaire antilichamen bevat die in hun juiste concentraties in de blokkerende oplossing zijn verdund. Incubeer 's nachts op een nootachtige platformrocker bij 4 graden Celsius.Na het verwijderen van de primaire antilichaamoplossing, voert u twee snelle wasbeurten en vier lange wasbeurten uit, zoals eerder aangetoond, verwijdert u PBST en voegt u 500 microliter secundaire antilichaamoplossing toe die fluorescerende secundaire antilichamen bevat die de gebruikte primaire antilichamen detecteren. Incubeer de eierstokken in de secundaire antilichaamoplossing op een nutating platform rocker gedurende twee uur bij kamertemperatuur en voer vervolgens twee snelle wasbeurten en vier lange wasbeurten uit in PBST zoals eerder gedemonstreerd op een nutating platform rocker. Gebruik na de laatste wasbeurt een P-1000-pipet om de eierstokken voorzichtig op en neer in de buis te pipetteren om de eikamers te scheiden.Laat de eikamers naar de bodem zakken door de buis vijf tot 10 minuten rechtop te houden. Verwijder vervolgens PBST met een Pasteur-pipet en laat ongeveer 50 microliter over. Verwijder daarna zoveel mogelijk van de resterende PBST met een P-200 pipet en voeg twee druppels montagemedium toe, genoeg om gelijkmatig over een afdekslip te verspreiden.Om het viskeuze montagemedium gemakkelijk over te brengen naar de schuif van de microcentrifugebuis, snijdt u het uiteinde van een P-200 pipetpunt af. Breng vervolgens langzaam alle eierkamers in het montagemedium over naar de glazen schuif en zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan. Onder een ontleedmicroscoop spreidt u voorzichtig de montagemedia en gescheiden eierkamers uit met behulp van een nieuwe P-200 pipetpunt of tang om een gebied te bedekken dat ongeveer zo groot is als een afdekslip.Plaats met behulp van een tang voorzichtig de afdekslip onder een hoek op de eikamers om bubbels te voorkomen en bewaar de glijbaan bij kamertemperatuur op een plat oppervlak in het donker gedurende twee dagen om te polymeriseren. Zodra de montagemedia zijn uitgehard, kan de dia een paar weken bij 4 graden Celsius in het donker worden bewaard voor beeldvorming. Om de intracellulaire lokalisatie van keldermembraaneiwitten te visualiseren, stelt u het doel in op 63x en plaatst u voorzichtig een druppel dompelolie op de lens en plaatst u vervolgens de dia op het objectief met de afdekslip naar het doel gericht om het monster te lokaliseren.Zoek het interessante gebied met behulp van het oculair van de epifluorescente microscoop en selecteer vervolgens een configuratie met de juiste instellingen voor de fluoroforen om af te beelden zoals beschreven in het manuscript. Zodra de configuratie is ingesteld, maakt u een afbeelding van het voorbeeld door Live onder acquisitiemodus te selecteren en de zoom tussen 2 en 4x aan te passen om het scangebied van het voorbeeld te optimaliseren. Selecteer voor elk afzonderlijk kanaal een track onder Kanaal en klik op Live.Pas de hoofdversterking en het laservermogen aan terwijl u het bereikindicatorgereedschap gebruikt en volg alle richtlijnen om verzadigde pixels te voorkomen zoals beschreven in het manuscript, terwijl u hetzelfde herhaalt voor elk kanaal. Klik in het schakelvenster Acquisitiemodus onder Afbeeldingsgrootte op SR om de mogelijkheden van de detector te maximaliseren en de framegrootte automatisch aan te passen. Houd het gemiddelde op Geen in de Airyscan-modus, omdat dit meestal niet nodig is en de scantijd zal verkorten.In sommige gevallen kan een gemiddelde van 2x echter de signaal-ruisverhouding verbeteren en klik vervolgens op Snap om een afbeelding te verkrijgen. Om een Z-stack te verkrijgen, klikt u op het selectievakje Z-Stack onder het tabblad Acquisitie. Selecteer vervolgens het gewenste kanaal om het monster te observeren.Bijvoorbeeld, het DAPI-kanaal en klik op Live om een live scan te starten, stel vervolgens een bereik in voor de Z-stack met behulp van de fijnstelknop op de microscoop. Stel daarna de eindpunten van de Z-stack in door op Eerst instellen en Laatste instellen te klikken. Voor een optimale 3D-reconstructie stelt u het interval voor de Z-stack lager in dan 0,5 micrometer om de stapgrootte toe te wijzen en klikt u op Experiment starten om de acquisitie van de Z-stack te starten.Zodra de afbeeldingen of Z-stack is verkregen, klikt u op de optie Verwerking en vervolgens op Methode en selecteert u Airyscan Processing. Voer Automatisch filter uit om te starten en voer indien nodig verdere handmatige verwerking uit door de superresolutiewaarde te wijzigen om de beste resultaten voor het monster te verkrijgen. Nadat de optimale SR-waarde is bepaald, klikt u op Toepassen om een bewerkte afbeelding te genereren.In het geval van Z-stack-afbeeldingen, verwerk u als één Z-slice of als de hele Z-stack door op het vak 3D-verwerking te klikken. Om eiwithandel in 3D te visualiseren na de verwerving van een Z-stack, genereert u een 3D-afbeelding door op het 3D-pictogram in het voorbeeldvenster te klikken, dat verschijnt in het weergavebeheergedeelte van de Airyscan-verwerkte afbeelding. Gebruik vanuit de verschillende 3D-weergaveopties Surface- of Gemengde weergaven wanneer u de structuur van blaasjes bekijkt.Voor de afbeelding van de hoogste kwaliteit selecteert u de instelling Nauwkeurig, omdat de instelling Snelste minder nauwkeurig is en leidt tot een slechte 3D-weergave. Zodra de afbeelding is gegenereerd, manipuleert u de 3D-afbeelding door in te zoomen en te roteren om scherp te stellen op een voorkeurslocatie. Nadat de weergave is verkregen, selecteert u onder het tabblad 3D weergegeven resolutie en klikt u vervolgens op Afbeelding maken, waardoor een momentopname van de afbeelding wordt gemaakt in dezelfde richting als deze werd bekeken en kan worden opgeslagen en geëxporteerd in verschillende bestandsindelingen.Confocale microscopie kan worden gebruikt om de intracellulaire lokalisatie en afzetting van keldermembraaneiwitten zoals Viking-GFP te visualiseren wanneer de acquisitieparameters zijn geoptimaliseerd. Wanneer acquisitie en beeldverwerking correct worden uitgevoerd, verhoogt superresolutiemicroscopie de beeldresolutie in vergelijking met confocale microscopie. Zoals geïllustreerd door de beter gedefinieerde beelden in de intracellulaire handel van keldermembraaneiwitten, zoals Viking.Orthogonale projectie maakt de visualisatie mogelijk van de algehele verdeling van blaasjes en compartimenten met keldermembraaneiwitten in een enkel beeld met behulp van confocale of superresolutie beeldvorming. Een 3D-reconstructie door het samenstellen van een stapel optische Z-secties genomen door confocale of superresolutie beeldvorming werd gebruikt om de lokalisatie en distributie van intracellulaire keldermembraaneiwitten te beoordelen. Beeldvorming met superresolutie kan worden gebruikt om de precieze lokalisatie van keldermembraaneiwitten in mutante omstandigheden te bepalen.In Crag knockdown epitheelcellen hopen keldermembraaneiwitten zich bijvoorbeeld zowel apisch als basaal op, wat aangeeft dat het de gepolariseerde afscheiding van keldermembraaneiwitten regelt. Confocale en superresolutiemicroscopie kan ook worden gebruikt in colokalisatie-experimenten. Deze figuur toont bijvoorbeeld de gedeeltelijke co-lokalisatie van Viking-GFP en een Golgi-marker, GM-130, die bevestigt dat Viking vóór secretie naar de Golgi wordt gesorteerd.Om de handel in keldermembraaneiwitten efficiënt in beeld te brengen met behulp van superresolutiemicroscopie, raden we aan om de eierstokken zorgvuldig te monteren en bijzondere aandacht te besteden aan het instellen van de acquisitie- en convolutieparameters. Dit protocol is geoptimaliseerd om de intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten te visualiseren. Het kan echter gemakkelijk worden aangepast om de handel in andere interessante eiwitten efficiënt in beeld te brengen.

confocal-super-resolution-imaging-polarized-intracellular-trafficking

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Source: Wagner, K. et al., Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the visualization of membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged TRPL proteins. It details the preparation of transgenic flies for imaging, the capture of fluorescence images of photoreceptor cells, and the quantification of TRPL trafficking by measuring relative eGFP fluorescence in the...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells

Dit document toont het gebruik van een snelle scanning confocale microscoop om het celgedrag rechtstreeks via puparium. Bij het verlaten van het popstadium intact, kan deze methode waarneming en meting van dynamische celprocessen in een stadium van Drosophila ontwikkeling die moeilijk rechtstreeks te bestuderen.

Imaging Door de Pupal zaak van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

De rechtopstaande beeldvormingsmethode die in dit protocol wordt beschreven, maakt de gedetailleerde visualisatie mogelijk van de polen van een zich ontwikkelend Drosophila melanogaster -ei. Deze uiteinden-op-weergave biedt een nieuw perspectief op de arrangementen en morfologieën van meerdere celtypen in het folliculaire epitheel.

Rechtop Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor superresolutie live-cell imaging in intact weefsel. We hebben de voorwaarden gestandaardiseerd voor beeldvorming van een zeer gevoelige volwassen stamcelpopulatie in zijn inheemse weefselomgeving. Deze techniek omvat het balanceren van temporele en ruimtelijke resolutie om de directe observatie van biologische verschijnselen in levend weefsel mogelijk te maken.

Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Hier worden niet-invasieve methoden beschreven voor de lokalisatie van fotoreceptormembraaneiwitten en de beoordeling van retinale degeneratie in het drosophila samengestelde oog met behulp van eGFP-fluorescentie.

Onderzoek naar membraaneiwithandel in drosophila-fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implementatie van expansiemicroscopie in vroege Drosophila-embryo's om beeldvorming met superresolutie te bereiken met behulp van een conventionele confocale microscoop met laserscanning.

Expansiemicroscopie gebruiken om Drosophila-embryo's in het geheel fysiek te vergroten voor beeldvorming met superresolutie

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Deze protocollen beschrijven hoe de organisatie en occluderende functie van geplooide septaatverbindingen in controle- en mutante Drosophila-embryonale epitheel karakteriseerd kunnen worden.

Immunokleuring en kleurstofpenetratie-experimenten om kerngeplooide septaat-junction-eiwitten te definiëren in het embryonale epitheel van Drosophila

Leer hoe je met confocale en superresolutiemicroscopie de intracellulaire verkeersstromen en secretie van keldermembraaneiwitten in Drosophila-oögenese kunt visualiseren. Deze methode biedt inzicht in eiwitdynamiek.

Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis (Video) | JoVE Journal

Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis

Meer video's verkennen