Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis

Dit protocol maakt de karakterisering van de intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten mogelijk met behulp van de Drosophila-array als modelsysteem. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat het hoge resolutie beeldvorming van de intracellulaire handel van keldermembraaneiwitten mogelijk maakt met behulp van endogene eiwitten en Airyscan superresolutiemicroscopie. Hoewel dit protocol is ontwikkeld om de intracellulaire handel van keldermembraaneiwitten in beeld te brengen, kan het worden uitgebreid om de handel in andere eiwitten van belang en andere biologische systemen, waaronder celcultuur en organoïden, te bestuderen.

Om te beginnen, na het ontleden van Drosophila-eierstokken in PBS onder een ontleedbereik, voegt u een milliliter fixatieoplossing toe en fixeert u de eierstokken gedurende 15 minuten op een nutating-platform. Verwijder de fixatieoplossing en voer twee snelle wasbeurten uit, elk met één milliliter PBST. Door de microcentrifugebuizen vijf tot zes keer voorzichtig om te keren en vervolgens vier lange wasbeurten van elk 10 minuten uit te voeren met één milliliter PBST op een nootvormende platformrocker.

Na het uitvoeren van fixatie en wassen, verwijdert u PBST, voegt u vervolgens een milliliter blokkerende oplossing toe en blokkeert u de eierstokken op een nootvormende platformknop gedurende minimaal een uur. Verwijder vervolgens de blokkerende oplossing en voeg 300 microliter primaire antilichaamoplossing toe, die primaire antilichamen bevat die in hun juiste concentraties in de blokkerende oplossing zijn verdund. Incubeer 's nachts op een nootachtige platformrocker bij 4 graden Celsius.

Na het verwijderen van de primaire antilichaamoplossing, voert u twee snelle wasbeurten en vier lange wasbeurten uit, zoals eerder aangetoond, verwijdert u PBST en voegt u 500 microliter secundaire antilichaamoplossing toe die fluorescerende secundaire antilichamen bevat die de gebruikte primaire antilichamen detecteren. Incubeer de eierstokken in de secundaire antilichaamoplossing op een nutating platform rocker gedurende twee uur bij kamertemperatuur en voer vervolgens twee snelle wasbeurten en vier lange wasbeurten uit in PBST zoals eerder gedemonstreerd op een nutating platform rocker. Gebruik na de laatste wasbeurt een P-1000-pipet om de eierstokken voorzichtig op en neer in de buis te pipetteren om de eikamers te scheiden.

Laat de eikamers naar de bodem zakken door de buis vijf tot 10 minuten rechtop te houden. Verwijder vervolgens PBST met een Pasteur-pipet en laat ongeveer 50 microliter over. Verwijder daarna zoveel mogelijk van de resterende PBST met een P-200 pipet en voeg twee druppels montagemedium toe, genoeg om gelijkmatig over een afdekslip te verspreiden.

Om het viskeuze montagemedium gemakkelijk over te brengen naar de schuif van de microcentrifugebuis, snijdt u het uiteinde van een P-200 pipetpunt af. Breng vervolgens langzaam alle eierkamers in het montagemedium over naar de glazen schuif en zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan. Onder een ontleedmicroscoop spreidt u voorzichtig de montagemedia en gescheiden eierkamers uit met behulp van een nieuwe P-200 pipetpunt of tang om een gebied te bedekken dat ongeveer zo groot is als een afdekslip.

Plaats met behulp van een tang voorzichtig de afdekslip onder een hoek op de eikamers om bubbels te voorkomen en bewaar de glijbaan bij kamertemperatuur op een plat oppervlak in het donker gedurende twee dagen om te polymeriseren. Zodra de montagemedia zijn uitgehard, kan de dia een paar weken bij 4 graden Celsius in het donker worden bewaard voor beeldvorming. Om de intracellulaire lokalisatie van keldermembraaneiwitten te visualiseren, stelt u het doel in op 63x en plaatst u voorzichtig een druppel dompelolie op de lens en plaatst u vervolgens de dia op het objectief met de afdekslip naar het doel gericht om het monster te lokaliseren.

Zoek het interessante gebied met behulp van het oculair van de epifluorescente microscoop en selecteer vervolgens een configuratie met de juiste instellingen voor de fluoroforen om af te beelden zoals beschreven in het manuscript. Zodra de configuratie is ingesteld, maakt u een afbeelding van het voorbeeld door Live onder acquisitiemodus te selecteren en de zoom tussen 2 en 4x aan te passen om het scangebied van het voorbeeld te optimaliseren. Selecteer voor elk afzonderlijk kanaal een track onder Kanaal en klik op Live.

Pas de hoofdversterking en het laservermogen aan terwijl u het bereikindicatorgereedschap gebruikt en volg alle richtlijnen om verzadigde pixels te voorkomen zoals beschreven in het manuscript, terwijl u hetzelfde herhaalt voor elk kanaal. Klik in het schakelvenster Acquisitiemodus onder Afbeeldingsgrootte op SR om de mogelijkheden van de detector te maximaliseren en de framegrootte automatisch aan te passen. Houd het gemiddelde op Geen in de Airyscan-modus, omdat dit meestal niet nodig is en de scantijd zal verkorten.

In sommige gevallen kan een gemiddelde van 2x echter de signaal-ruisverhouding verbeteren en klik vervolgens op Snap om een afbeelding te verkrijgen. Om een Z-stack te verkrijgen, klikt u op het selectievakje Z-Stack onder het tabblad Acquisitie. Selecteer vervolgens het gewenste kanaal om het monster te observeren.

Bijvoorbeeld, het DAPI-kanaal en klik op Live om een live scan te starten, stel vervolgens een bereik in voor de Z-stack met behulp van de fijnstelknop op de microscoop. Stel daarna de eindpunten van de Z-stack in door op Eerst instellen en Laatste instellen te klikken. Voor een optimale 3D-reconstructie stelt u het interval voor de Z-stack lager in dan 0,5 micrometer om de stapgrootte toe te wijzen en klikt u op Experiment starten om de acquisitie van de Z-stack te starten.

Zodra de afbeeldingen of Z-stack is verkregen, klikt u op de optie Verwerking en vervolgens op Methode en selecteert u Airyscan Processing. Voer Automatisch filter uit om te starten en voer indien nodig verdere handmatige verwerking uit door de superresolutiewaarde te wijzigen om de beste resultaten voor het monster te verkrijgen. Nadat de optimale SR-waarde is bepaald, klikt u op Toepassen om een bewerkte afbeelding te genereren.

In het geval van Z-stack-afbeeldingen, verwerk u als één Z-slice of als de hele Z-stack door op het vak 3D-verwerking te klikken. Om eiwithandel in 3D te visualiseren na de verwerving van een Z-stack, genereert u een 3D-afbeelding door op het 3D-pictogram in het voorbeeldvenster te klikken, dat verschijnt in het weergavebeheergedeelte van de Airyscan-verwerkte afbeelding. Gebruik vanuit de verschillende 3D-weergaveopties Surface- of Gemengde weergaven wanneer u de structuur van blaasjes bekijkt.

Voor de afbeelding van de hoogste kwaliteit selecteert u de instelling Nauwkeurig, omdat de instelling Snelste minder nauwkeurig is en leidt tot een slechte 3D-weergave. Zodra de afbeelding is gegenereerd, manipuleert u de 3D-afbeelding door in te zoomen en te roteren om scherp te stellen op een voorkeurslocatie. Nadat de weergave is verkregen, selecteert u onder het tabblad 3D weergegeven resolutie en klikt u vervolgens op Afbeelding maken, waardoor een momentopname van de afbeelding wordt gemaakt in dezelfde richting als deze werd bekeken en kan worden opgeslagen en geëxporteerd in verschillende bestandsindelingen.

Confocale microscopie kan worden gebruikt om de intracellulaire lokalisatie en afzetting van keldermembraaneiwitten zoals Viking-GFP te visualiseren wanneer de acquisitieparameters zijn geoptimaliseerd. Wanneer acquisitie en beeldverwerking correct worden uitgevoerd, verhoogt superresolutiemicroscopie de beeldresolutie in vergelijking met confocale microscopie. Zoals geïllustreerd door de beter gedefinieerde beelden in de intracellulaire handel van keldermembraaneiwitten, zoals Viking.

Orthogonale projectie maakt de visualisatie mogelijk van de algehele verdeling van blaasjes en compartimenten met keldermembraaneiwitten in een enkel beeld met behulp van confocale of superresolutie beeldvorming. Een 3D-reconstructie door het samenstellen van een stapel optische Z-secties genomen door confocale of superresolutie beeldvorming werd gebruikt om de lokalisatie en distributie van intracellulaire keldermembraaneiwitten te beoordelen. Beeldvorming met superresolutie kan worden gebruikt om de precieze lokalisatie van keldermembraaneiwitten in mutante omstandigheden te bepalen.

In Crag knockdown epitheelcellen hopen keldermembraaneiwitten zich bijvoorbeeld zowel apisch als basaal op, wat aangeeft dat het de gepolariseerde afscheiding van keldermembraaneiwitten regelt. Confocale en superresolutiemicroscopie kan ook worden gebruikt in colokalisatie-experimenten. Deze figuur toont bijvoorbeeld de gedeeltelijke co-lokalisatie van Viking-GFP en een Golgi-marker, GM-130, die bevestigt dat Viking vóór secretie naar de Golgi wordt gesorteerd.

Om de handel in keldermembraaneiwitten efficiënt in beeld te brengen met behulp van superresolutiemicroscopie, raden we aan om de eierstokken zorgvuldig te monteren en bijzondere aandacht te besteden aan het instellen van de acquisitie- en convolutieparameters. Dit protocol is geoptimaliseerd om de intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten te visualiseren. Het kan echter gemakkelijk worden aangepast om de handel in andere interessante eiwitten efficiënt in beeld te brengen.