Een high-throughput multiplexed screening voor type 1 diabetes, coeliakie en COVID-19
5 juli 2022
In lijn met de dringende behoefte aan screening op type 1 diabetes, coeliakie en coronavirusziekte 2019, hebben we een high throughput 6-Plex elektrochemiluminescentietest ontwikkeld om tegelijkertijd alle vier de eilandjesautoantilichamen, weefseltransglutaminase autoantilichamen en antilichamen tegen het receptorbindingsdomein van ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 te detecteren.
De nieuwe 6-Plex ECL-test is de eerste multiplextest die is gevalideerd en nu wordt toegepast in klinische onderzoeken voor algemene bevolkingsonderzoek. Het combineert tegelijkertijd zes autoantilichaamtests die geschikt zijn voor het screenen van type 1 diabetes, coeliakie en COVID-19 in een grote populatie. Vergeleken met de huidige standaard autoantilichaamtest kan deze techniek efficiënter meerdere auto-antilichamen tegelijkertijd screenen op meerdere auto-immuunziekten.
De implicatie van deze techniek zal de grootschalige screening haalbaarder en ziektespecifikeler maken, wat leidt tot vroege ziektevoorspelling voor preventie en een nauwkeurigere diagnose voor therapie. Voeg om te beginnen vier microliter gebiotinyleerd GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 en proinsuline-antigeeneiwit toe aan een buis met 156 microliter van 1% BSA en meng met 240 microliter overeenkomstige streptavidin-geconjugeerde linkers, 1, 2, 3, 8, 9 en 10. Incubeer het mengsel vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Aliquot 160 microliter stopoplossing in elke buis en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Neem nu 400 microliter van de mengseloplossing uit elke buis en combineer ze samen. Voeg vier microliter ruthenium-gelabeld GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 en proinsuline antigeen toe aan het mengsel.
Voeg vervolgens 1,6 milliliter stopoplossing en 3,2 milliliter PBS toe. Meng alle componenten grondig. En nu is de antigeenoplossing klaar voor gebruik in de test.
Voor een 96-well PCR plaat, aliquot zeven microliter serum per put en bedek de plaat met een afdichtingsfilm. Verwarm vervolgens de sera gedurende 30 minuten voor op 56 graden Celsius op een PCR-machine en centrifugeer de plaat gedurende één minuut kort op 100 maal G. Voeg 63 microliter bereide antigeenoplossing per put toe, meng met de sera en bedek de PCR-plaat met afdichtingsfolie om licht te voorkomen.
Schud de plaat op een shaker met een snelheid van 450 tpm gedurende twee uur bij kamertemperatuur. En incubeer vervolgens de plaat op vier graden Celsius gedurende 18 tot 24 uur. Neem een 6-Plex plaat uit de vier graden Celsius koelkast, zodat de plaat op kamertemperatuur komt.
Voeg vervolgens 150 microliter van 3% Blocker A toe aan elk putje van de 6-Plex-plaat. Bedek de plaat met folie om licht te voorkomen. Zet het bord terug in een koelkast van vier graden Celsius en incubeer een nacht.
Aan het einde van de incubatie, zodra de plaat uit de koelkast is verwijderd, verwijdert u alle buffer van de plaat. Dep het bord op de papieren handdoekjes om uit te drogen en was het driemaal met telkens 150 microliter wasbuffer per putje. Droog de plaat op het keukenpapier en aliquot 30 microliter serumantigeen incubeer uit elk putje van de nachtelijke broedende PCR-plaat in twee putjes van de 6-Plex-plaat.
Bedek de plaat met folie, leg de plaat vervolgens op een platenschudder en schud met een snelheid van 450 tpm bij kamertemperatuur gedurende een uur. Dump de aanwezige oplossing in de 6-Plex plaat en was de plaat drie keer met 150 microliter van 0,4 M natriumchloride wasbuffer per putje. Nadat de derde wasbeurt is voltooid, droogt u de plaat tegen het keukenpapier en voegt u 150 microliter leesbuffer toe aan elk putje.
De niveaus van zes autoantilichamen voor GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA en COVID-19A uit de 6-Plex ECL-test waren goed gecorreleerd met hun overeenkomstige zes enkele ECL-assay en de huidige standaard radiobindingstest. De indexwaarden voor elk monster voor alle zes antilichamen werden berekend op basis van de overeenkomstige positieve en negatieve controles. Er werd een indexwaarde waargenomen die groter was dan de cutoff-waarde, wat een positief resultaat aangaf.
Autoantilichamen in serum doorbraken het ruthenium-gelabelde antigeen naar het gebiotinyleerde antigeen en vormden een complex met een specifieke linker om een multiplexingplatform te bouwen. Deze tactiek maakt de grootschalige screening haalbaarder en efficiënter in de algemene bevolking op diabetes type één en bijkomende ziekten, wat leidt tot vroege voorspelling en preventie van de ziekten.
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe 6-Plex electrochemiluminescentie-assay die is ontworpen voor de gelijktijdige detectie van autoantistoffen gerelateerd aan type 1 diabetes, coeliakie en COVID-19. De assay is erop gericht de efficiëntie van grootschalige screening voor deze auto-immuunziekten te verbeteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Autoimmuniteit
- Klinische diagnostiek
- Electrochemiluminescentie-assays
Achtergrond
- Type 1 diabetes en coeliakie zijn auto-immuunziekten die vroege detectie vereisen.
- COVID-19 heeft nieuwe uitdagingen geïntroduceerd bij de screening op auto-immuunziekten.
- Huidige screeningsmethoden zijn vaak inefficiënt en tijdrovend.
- Multiplex-assays kunnen de screeningscapaciteiten verbeteren door meerdere antilichamen gelijktijdig te testen.
Doel van de studie
- Om een high-throughput assay te ontwikkelen voor de gelijktijdige detectie van meerdere autoantilichamen.
- Om de assay te valideren voor gebruik in klinische studies.
- Om vroege ziektevoorspelling en preventie te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van antigeenoplossingen met behulp van gebiotineerde en ruthenium-gelabelde eiwitten.
- Incubatie van serummonsters met de bereide antigeenoplossingen.
- Gebruik van een 96-well PCR-plaat voor de monsterverwerking.
- Correlatie van resultaten met standaardassays om de multiplex-benadering te valideren.
Belangrijkste resultaten
- De 6-Plex ECL-assay vertoonde een sterke correlatie met traditionele enkelvoudige assays.
- Indexwaarden duidden op positieve resultaten voor autoantilichamen in serummonsters.
- De assay maakt een efficiënte screening van meerdere auto-immuunziekten mogelijk.
- De resultaten ondersteunen de haalbaarheid van grootschalige populatiescreening.
Conclusies
- De 6-Plex ECL-assay is een veelbelovend instrument voor de vroege detectie van auto-immuunziekten.
- Deze methode verhoogt de efficiëntie van screeningprocessen.
- Het biedt potentieel voor het verbeteren van patiëntresultaten door vroege interventie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
De gevalideerde 6-Plex ECL-assay maakt high-throughput, gemultiplexte detectie van autoantistoffen voor type 1 diabetes, coeliakie en COVID-19 mogelijk, waarmee wordt voldaan aan de behoefte aan efficiënte, ziekte-specifieke populatiescreening. Dit platform vergroot het voorspellende vertrouwen bij het vroegste buigpunt in het continuüm van ontdekking naar diagnose, wat risico-gecorrigeerde portfoliobeslissingen voor onderzoek naar auto-immuunziekten en infectieziekten ondersteunt. De adoptie ervan als primair screeninginstrument demonstreert de impact op bedrijfsniveau op translationele en preklinische workflows.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Maakt gelijktijdige analyse van meerdere auto-immuun- en virale targets mogelijk in één assayformaat.
- Verbetert biologische risicoreductie door ziekte-specifieke autoantilichaamprofielen te onderscheiden.
- Ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid voor vroege ziektevoorspelling en preventiestrategieën.
- Faciliteert portfolio-triage door multiplexed, kwantitatieve read-outs te bieden voor targetvalidatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde multiplex-systemen voor voor downstream screening en biomarker-workflows.
- Standaardiseert assay-condities om reproduceerbaarheid en kwantitatieve vergelijkbaarheid tussen monsters te waarborgen.
- Maakt schaalbare high-throughput screening mogelijk met minimale serumvolume-vereisten.
- Ondersteunt betrouwbare evaluatie van de effecten van verbindingen of interventies op meerdere ziekterelevante biomarkers.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante biomarkerstrategieën voor translationele continuïteit van ontdekking tot klinische validatie.
- Levert kwantitatieve resultaten die risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling in preklinische pipelines informeren.
- Verbetert voorspellende risicoreductie door multiplex autoantistofprofielen te correleren met het begin en het verloop van de ziekte.
Integratie van Pipeline & Workflow
De 6-Plex ECL-assay integreert op het grensvlak van vroege ontdekking, lead-identificatie en translationeel onderzoek, waardoor een naadloze overgang van hypothesetoetsing naar preklinische validatie mogelijk is.
- Discovery Biology: Ondersteunt robuuste hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door middel van gemultiplexte auto-antilichaamdetectie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor high-throughput screening-omgevingen.
- Analytics: Biedt indexwaarden en op cutoff-waarden gebaseerde beslispunten voor vergelijkingen tussen condities en statistische analyse.
- Translationeel Onderzoek: Slaat de brug tussen discovery en klinische validatie door biomarkerdetectie af te stemmen op ziekterelateerde eindpunten.
- Enterprise Hergebruik: Creëert een herbruikbaar, schaalbaar platform voor toekomstige gemultiplexte screening-initiatieven.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in vroege stadia van onderzoek naar auto-immuunziekten en infectieziekten.
- Operationele waarde: Stroomlijnt workflows door standaardisatie, reproduceerbaarheid en high-throughput schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliobeheer mogelijk door het leveren van gemultiplexte, bruikbare gegevens.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en het verder brengen van kandidaten op basis van robuust, gemultiplexd biomarkerbewijs.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de ontwikkeling van multiplexe immunoassays en elektrochemiluminescentie-detectie.
- Vraagt om toegang tot gespecialiseerde instrumentatie voor ECL-uitlezingen en high-throughput plate-handling.
- Maakt cross-team standaardisatie van assayprotocollen en data-analysepijplijnen noodzakelijk.
- Kan aanpassingen vereisen voor gebruik met verschillende monster types of ziektemodellen naarmate de behoeften van de portfolio evolueren.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van rigoureuze validatie ten opzichte van gevestigde single-plex en radio-binding assays.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Create Linker‐Coupled Antigen Solution
2:36
Preparation of Antigen Labeled Serum and the 6‐Plex Plate
3:54
Serum/Antigen Incubates Transfer into the 6‐Plex Plate
4:42
Washing the 6‐Plex Plate and Reading Buffer Addition
5:11
Results: Comparison of Antibody Levels Study Between the Single and the 6‐Plex ECL Assay
5:59
Conclusion
