Snelle, kostenefficiënte, enzymvrije passaging van menselijke pluripotente stamcellen op voedingscellen door ethyleendiaminetetra-azijnzuur-gemedieerde dis-adhesie

Dit protocol biedt een snelle, kostenefficiënte methode voor enzymvrije passaging van menselijke pluripotente stamcellen die op voedingscellen zijn gekweekt. Het voordeel van dit protocol is dat er geen dure voedingsvrije kweekmedia en groeisubstraten nodig zijn, het risico van volledige dissociatie door enzymen wordt vermeden en het risico van stamcellen die overgaan naar een geprimed toestand wordt verminderd. De procedure zal worden gedemonstreerd door Hege Brincker Fjerdingstad, dagelijks manager van de Noorse kernfaciliteit voor menselijke pluripotente stamcellen.

Om te beginnen worden zaad 0,5 bij 10 tot de macht 6 menselijke fibroblasten, hierna te noemen feedercellen, in een T 75-kweekkolf met 20 milliliter IMDM met 10% FBS, hierna te noemen feedercelmedium, tot de macht verheven. Wanneer de voedingscellen 90% samenvloeiing hebben bereikt, verwijdert u het medium en wast u de cellen drie keer met 10 milliliter DPBS om remming van trypsine door factoren in het medium te voorkomen. Voeg twee milliliter trypsine EDTA toe aan de kolf en incubeer ongeveer vijf minuten bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, terwijl u met het blote oog de loslating van de voedingscellen observeert.

Zodra de onthechting begint, blijft u de dissociatie van de cellen onder een microscoop observeren om ervoor te zorgen dat alle aggregaten worden gedissocieerd in afzonderlijke cellen. Voeg vervolgens vijf milliliter vers, voorverwarmd feedercelmedium toe aan de kolf om de trypsine-EDTA te inactiveren en hang de feedercellen voorzichtig op door te pipetteren. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 milliliter, sluit de buis af en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 G.

Verwijder de saté voorzichtig zonder de pellet te verstoren en suspendeer deze opnieuw in vier milliliter vers voedingscelmedium. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de voedingscellen grondig opnieuw zijn gesuspendeerd, telt u ze met behulp van een celtelkamer en berekent u het aantal cellen dat nodig is voor het kweken van de HSC's en HI PSC's op weefselkweekschalen van 35 millimeter. Om vervolgens mitotische arrestatie door gammastraling uit te voeren, brengt u het juiste aantal feedercellen over naar een centrifugebuis van 50 milliliter en voegt u het feedercelmedium toe tot een totaal volume van vijf milliliter.

Transporteer onmiddellijk bij kamertemperatuur naar een gammabestralingsmachine en bestraal om de cellen mitotisch te stoppen. Zodra de voedingscellen mitotisch zijn gestopt onder een weefselkweekkap, suspendeert u de cellen opnieuw in het voedingscelmedium om een celconcentratie van 1,5 bij 10 te verkrijgen, verhoogd tot de macht 5 per milliliter. Voeg 2 milliliter van de feedercelsuspensie toe aan een schaal van 35 millimeter en breng de schaal over naar 37 graden Celsius en 5%kooldioxide-incubator.

Voor een gelijkmatige verdeling van de cellen beweegt u de schaal langzaam maar stevig op de plank van de couveuse naar voren en naar achteren. Pauzeer vervolgens en voer dezelfde actie van links naar rechts uit voordat u de deur van de couveuse sluit. Vervang na 24 uur het feedercelmedium door IMDM met 10% serumvervanging.

Vervang IMDM met 10% serumvervangingsmedium uit de kweekschaal met mitotisch gestopte voedingscellen door 1,2 milliliter voorverwarmd HESC-medium met basisvezelblastgroeifactor of BFGF, 30 minuten voor de overdracht van kolonies. Verwijder vervolgens het medium uit een kweekschaal met HSC's of HI PSC's en was de kolonies met één milliliter DPBS om losse cellen en celresten te verwijderen. Voeg een milliliter 0,5 millimolaire EDTA toe en incubeer gedurende één minuut bij 37 graden Celsius.

Vervang vervolgens met een pipet van één milliliter de EDTA-oplossing door één milliliter HESC-medium dat BFGF bevat. Trituer voorzichtig met dezelfde pipet om de kolonies los te maken van de cellaag van de feeder totdat de laag loskomt en zich in een aparte klomp op zichzelf vouwt. Duw de cellaag van de feeder met een pipetpunt naar de rand van de kweekput.

Gebruik een nieuwe pipet van één milliliter om de gesuspendeerde kolonies over te brengen naar een nieuwe kweekschaal met voedingscellen en HESC-medium dat BFGF bevat, en splits ze in een verhouding van één op vijf. Breng de schaal over naar een broedmachine en beweeg deze voorzichtig heen en weer om de gelijkmatige verdeling van de kolonies te vergemakkelijken. De HESC-kolonies die met EDTA werden geoogst, waren homogener in grootte en vorm dan de machinaal geoogste kolonies.

De celdichtheid in de geoogste en opnieuw geplateerde kolonies was vergelijkbaar voor EDTA-gebaseerde oogst en mechanisch oogsten. De mechanisch geoogste kolonies hadden een grotere neiging om necrose te ontwikkelen in hun centrale regio's, terwijl kolonies die met EDTA waren geoogst een doorschijnend uiterlijk vertoonden met duidelijke randen. QPCR-analyse toonde een stabiele expressie van stamheidsmarker in het mRNA voor de kolonies, verkregen na 20 passages met behulp van mechanisch of EDTA-gebaseerd oogsten.

Soortgelijke waarnemingen werden gedaan met immunochemische kleuring op eiwitniveaus voor de kolonies verkregen na 20 passages met behulp van mechanische of EDTA-gebaseerde oogst. Embryoïde lichamen gegenereerd uit de HSC's verkregen na 20 passages met behulp van beide methoden bevatten een mengsel van cellen die algemeen beoordeelde markers voor het ectoderm, mesoderm en endoderm tot expressie brengen. Verder vertoonde op QPCR gebaseerde genetische analyse van veel voorkomende genomische afwijkingen een bescheiden afwijking van een referentie diploïde chromosomaal patroon.

Het is belangrijk om de blootstelling aan EDTA te beperken tot één minuut. Langere blootstelling kan leiden tot te veel dissociatie. Het is ook belangrijk om de voedingscellaag goed opzij te trekken, zodat deze niet in de weg zit bij het overbrengen van de menselijke embryonale stamcellen of door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen naar een nieuwe kweekschaal.

De overgang naar kweek en de voervrije omstandigheden waar EDTA vaak wordt gebruikt voor ziekteverwekkers is eenvoudig en we veranderen niets aan de manier waarop de cellen worden behandeld.