Flowcytometrische analyse van biomarkers voor het detecteren van functionele defecten van menselijk sperma

Deze techniek biedt een praktische benadering om meerdere functionele biomarkers van menselijke spermatozoa te schatten door middel van flowcytometrie zonder substantiële afbreuk te doen aan de kwaliteit van het experiment als gevolg van langere wachttijden. Deze techniek kan een praktische en betrouwbare toolkit zijn voor de diagnose van onvruchtbaarheid en evaluatie van de spermafunctie op zowel de bank als in bed, en een aanvulling vormen op het routinematige spermaonderzoek. Deze procedure wordt uitgevoerd met het Accuri C6-platform en kan met kleine aanpassingen worden toegepast op andere commerciële platforms.

Incubeer om te beginnen het spermamonster bij 37 graden Celsius en maak het monster gedurende een uur volledig vloeibaar. Om de zaadcellen te tellen, mengt u het vloeibare spermamonster grondig, voegt u vervolgens 10 microliter sperma toe aan een spermatelkamer en scant u het glaasje in een spermaklasse-analysator. Tel ten minste zes gebieden en 400 spermatozoa om de spermaconcentratie te schatten.

Voor detectie van apoptose van sperma voegt u met behulp van annexine-5 FITC PI-kleuring 10 tot de zesde zaadcellen toe aan een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Was de cellen met 500 microliter koude PBS. Centrifugeer vervolgens de zaadcelsuspensie en gooi het supernatans weg voordat u de cellen opnieuw suspendeert in 200 microliter bindingsbuffer.

Voeg vervolgens twee microliter FITC-annexine-5 en twee microliter PI toe. Draai de cellen voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker voordat u ze in de flowcytometer plaatst voor analyse. Voor analyse van het mitochondriale membraanpotentiaal, of MMP, met behulp van de JC-1-sonde, voegt u twee keer 10 tot de zesde zaadcellen toe aan een buis van 1,5 milliliter en centrifugeert. Na centrifugeren de zaadcelsuspensie opnieuw suspenderen in een JC-1-werkoplossing van één milliliter.

Draai de cellen zachtjes en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius in het donker. Centrifugeer opnieuw de suspensie, gooi het supernatans weg en was de pellet twee keer met één milliliter PBS. Suspendeer vervolgens de geverfde zaadcellen opnieuw in één milliliter PBS in een flowcytometerbuis en plaats de buis onmiddellijk in de flowcytometer voor analyse.

Gebruik vervolgens Carbonylcyanide, m-chloorfenylhydrazon, of CCCP als positieve controle. Suspendeer de zaadcellen opnieuw in een milliliter CCCP-werkoplossing en draai ze voorzichtig in een draaikolk voordat ze gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur worden geïncubeerd. Centrifugeer na incubatie de suspensie, gooi het supernatant weg en voer de stappen uit om MMP te analyseren met behulp van de JC-1-sonde, zoals gedemonstreerd.

Voor spermachromatinestructuurtest, of SCSA, ontdooit u het spermamonster in een waterbad van 37 graden Celsius en verdunt u het met TNE-buffer tot een concentratie van één tot twee keer 10 tot de zesde cellen per milliliter. Voeg vervolgens 200 microliter van het verdunde monster toe aan een reageerbuis met flowcytometer en meng het met 400 microliter zure oplossing. Kleur het monster met 1,2 milliliter acridine-sinaasappeloplossing.

Gebruik een referentiemonster als interne standaard voor het instellen en kalibreren van de flowcytometer. Verdun het monster met vier graden Celsius TNE-buffer tot een concentratie van één tot twee keer 10 tot de zesde cellen per milliliter en voer de stappen voor SCSA uit, zoals aangetoond. Open de flowcytometersoftware en start de cytometer.

Om monstergegevens te verzamelen, laadt u een controlemonster op de flowcytometer en klikt u op Uitvoeren om de gegevensverzameling te starten. Maak puntplots voor het bekijken van gegevens. Selecteer de parameters van de XY-as en geef lineair weer om gegevens op te geven.

Selecteer vervolgens een veelhoekige poort en pas deze toe om de spermapopulatie af te bakenen voor analyse. Stel voor apoptose van sperma de FL1 in als de X-as en FL2 als de Y-as. Om vervolgens de levende apoptotische of necrotische cellen te isoleren, tikt en sleept u de kwadrantpoort om de spermapopulaties terug te brengen tot vier specifieke populaties.

Stel voor MMP FL1 in als de X-as en FL2 als de Y-as. Maak vervolgens een veelhoekige poort om de spermapopulaties terug te brengen tot twee specifieke populaties. Stel voor SCSA de FL4 in als de X-as en FL1 als de Y-as.

Teken de poort, stel een hoek van 45 graden in om signalen van cellulair afval uit te sluiten. Bereken 10.000 zaadcellen voor elk monster voor sperma-apoptose-, MMP- en SCSA-analyses, stel een runlimiet in om aan te geven wanneer moet worden gestopt met het verzamelen van gegevens, fluïdische snelheid, afhankelijk van het aantal cellen en drempel om vuil en ruis te elimineren. Pas deze instellingen toe op alle monsters.

Stel indien nodig de kleurcompensatie in om fluorescerende overloop te corrigeren. Pipeteer het monster voorzichtig terug voordat u het op de flowcytometer plaatst. Voer vervolgens de naam van het voorbeeld in en klik op Uitvoeren.

Zodra de uitvoering is voltooid, slaat u de voorbeeldgegevens op als FCS-bestand door een bestandsnaam op te geven voor verdere analyse. De meting van apoptose van sperma met behulp van annexine-vijf FITC PI-kleuring wordt hier getoond. Deze analyse omvatte een negatieve controle van ongekleurde zaadcellen om compensatie en kwadranten in te stellen.

In een monster met sperma-apoptose werden de resultaten uitgedrukt als de percentages levensvatbare of levende vroeg-apoptotische of apoptotische, laat-apoptotische en necrotische cellen. De sperma-subpopulatie met hoge en lage MMP wordt hier weergegeven. Een spermamonster van goede kwaliteit vertoonde een hoge oranje en lage groene fluorescentie.

Omgekeerd vertoonde een spermamonster van slechte kwaliteit een lage oranje en hoge groene fluorescentie. De SCSA-cytogrammen van een vruchtbare en onvruchtbare man worden hier getoond. De zaadcelpopulatie werd geïdentificeerd als normaal met een hoge DNA-stabiliteit, DNA-fragmentatie-index en celresten.

Het spermamonster moet bij 37 graden Celsius worden geïncubeerd en gedurende maximaal een uur volledig vloeibaar worden gemaakt.