Hydrogel-arrays maken een verhoogde doorvoer mogelijk voor screeningseffecten van matrixcomponenten en therapeutica in 3D-tumormodellen

Deze methode stelt onderzoekers in staat om systematisch te onderzoeken hoe matrix cues het fenotype van cellen in 3D-cultuur beïnvloeden. We demonstreren de procedure met behulp van culturen van GBM-cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een implementatie met hoge doorvoer, waardoor we veel matrixcondities kunnen screenen.

Deze techniek kan worden gebruikt om weefsel-mimetische matrices te ontwikkelen die specifieke functies in celkweekmodellen behouden, zoals medicijnresistentie van tumorcellen, en mogelijk nieuwe therapieën identificeren. Mary Epperson en Kelly Tamura, niet-gegradueerde onderzoekers van het Seidlits Lab, demonstreren de procedure. Begin met het bereiden van HEPES-gebufferde oplossing door HEPES-poeder op te lossen bij 20-millimolar in Hanks gebalanceerde zoutoplossing.

Stel de pH in op zeven na volledige sorptie. Los in de HEPES-gebufferde oplossing thiolated HA op zodat 6 tot 8% van de carbonzuurresiduen op elk glucuronzuur worden gemodificeerd met een thiol in een concentratie van 10 milligram per milliliter in bufferoplossing. Roer met minder dan 1.000 omwentelingen per minuut met behulp van een magnetische roerplaat op kamertemperatuur totdat deze volledig is opgelost, meestal ongeveer 45 minuten.

Terwijl HA oplost, bereidt u afzonderlijke oplossingen van 100 milligram per milliliter 8arm PEG norborneen, 100 milligram per milliliter 4arm PEG thiol, vier millimol cysteïne of cysteïnebevattend peptide en vier milligram per milliliter LAP in microcentrifugebuizen. Bereid vier millimolaire oplossingen van alle peptiden die op dit punt in een enkele hydrogel moeten worden vastgebonden. Meng de afzonderlijke oplossingen van HA, PEG norborneen, PEG thiol en cysteïne-thiol-bevattende peptiden om de uiteindelijke concentraties voor de uiteindelijke hydrogelmatrices te bereiken.

Roer met minder dan 1.000 omwentelingen per minuut op een magnetische trapplaat gedurende ten minste 30 minuten om volledig te mengen. Lijn de monsters uit met het verlichtingsapparaat met elke andere LED in een enkele kolom van de siliconen mallen of 384-well plaat. Open UV LED-parameters en voer waarden in voor intensiteit en verlichting.

Klik vervolgens op Voltooien om de verlichting te starten. Na verlichting, wanneer geplaatst in een hoek, verplaats de putplaat naar de volgende hoek en herhaal. Om putjes op de andere helft van de plaat te verlichten, tilt u de plaat uit de houder en draait u 180 graden.

Om hydrogels met verschillende mechanica te genereren, begint u met het reinigen van de glasglaasjes en siliconen mallen met behulp van tape om vuil te verwijderen. Bevestig de siliconen mallen aan de glasschuif, druk naar beneden om een goede afdichting te garanderen en verplaats eventuele luchtbellen. Pipetteer vervolgens 80 microliter hydrogel precursor-oplossing in elke siliconenmal op de glasschuif.

Plaats de glasschuif op het verlichtingsapparaat dat is uitgelijnd met elke andere LED in een enkele kolom. Stel de hydrogelvoorlopers gedurende 15 seconden bloot aan UV-licht om crosslinks te fotograferen. Zodra de verlichting is gestopt, haalt u de dia's op en maakt u de gels los van de mallen door de binnenomtrek van de mal met een fijne punt te volgen.

Verwijder siliconen mallen met een pincet of tang. Vul een 12-well plaat met twee milliliter DPBS. Verplaats verknoopte hydrogels in een individuele putplaat door een spatel nat te maken en ze voorzichtig van de glazen glijbaan te duwen.

Bereid de gewenste cellen voor als een eencellige oplossing. Verzamel glioblastoomsferoïden, ongeveer 150 micrometer in diameter, van een T-75 kolf suspensiecultuur in een conische buis van 15 milliliter. Spoel de kweekkolf af met vijf milliliter DPBS om eventuele restcellen en media te verwijderen en voeg dit volume toe aan de conische buis.

Centrifugeer de conische buis met cellen op 200 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na centrifugatie het supernatant met een serologische pipet van vijf milliliter, zorg ervoor dat de celpellet niet wordt verstoord en resuspendeert in vijf milliliter DPBS. Centrifugeer op 200 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om cellen te wassen.

Adem het supernatant op met een serologische pipet van vijf milliliter, zorg ervoor dat de celpellet niet wordt verstoord en resuspendeer vervolgens cellen in twee milliliter celdissociatiereagens. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten. Voeg drie milliliter compleet medium toe en pipetteer voorzichtig drie tot vijf keer om de sferoïden af te breken tot een eencellige suspensie.

Centrifugeer de eencellige suspensie bij 400 maal G gedurende vijf minuten tot pelletcellen bij kamertemperatuur. Aspirateer het supernatant met een serologische pipet van vijf milliliter en zorg ervoor dat de celpellet niet wordt verstoord. Resuspend cellen in één milliliter compleet medium.

Verwijder een deel van de cellen om te tellen met behulp van een hemocytometer. Verdun dit deel tweevoudig met trypan blue, dat cellen met een gecompromitteerde levensvatbaarheid doordringt. Tel alleen de levende, kleurloze cellen.

Bepaal het aantal cellen dat nodig is voor inkapseling. Breng een volume media met het totale aantal benodigde cellen over in een steriele microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Draai vijf minuten lang op 400 maal G bij kamertemperatuur.

Aspirateer het supernatant met een micropipette en zorg ervoor dat de celpellet niet wordt verstoord. Resuspendeer de celpellet in de hydrogel precursoroplossing en meng goed door vier tot vijf keer op en neer te pipetteren met een micropipette van 1.000 microliter. Laad de cellen in een herhalingspijptterset om 10 microliter af te geven.

Om bubbels en ongelijke dosering te voorkomen, primeert u de herhaalde pipetter door een extra één tot twee keer in een afvalcontainer te doseren. Doseer in elke put van een 384-well plaat 10 microliter cellen gesuspendeerd in hydrogeloplossing van de herhaalde pipetter. Gebruik de LED-array om elke put met cel gedurende 15 seconden te verlichten om de gewenste mechanische eigenschappen te bereiken.

Voeg 40 microliter volledige media toe aan elk putje dat de cellen bevat. Voeg 50 microliter DPBS toe aan niet-experimentele droge putten rond de gels om verliezen als gevolg van verdamping te minimaliseren. Voeg voor glioblastoomcellen 40 microliter van het mediabevattende medicijn toe om de uiteindelijke gewenste concentratie te bereiken, te beginnen drie dagen na inkapseling.

Voeg 10 microliter CCK8-reagens toe aan elk putje dat de cellen bevat. Incubeer gedurende één tot vier uur, volgens de instructies van de fabrikant. Lees absorptiewaarden op 450 nanometer voor alle putten na incubatie.

AFM-ondervraging van micronschaalgebieden aan de oppervlakken van enkele hydrogels toonde aan dat hydrogels met zachtere gemiddelde Young's moduli ook kleinere modulibereiken hadden dan stijvere hydrogels. 3D-culturen van GS122-cellen gezaaid met dichtheden van 2.500.000 cellen per milliliter vertoonden aanzienlijk hogere viabiliteiten bij beoordeling na zeven dagen in cultuur in vergelijking met die gezaaid bij dichtheden van 500.000 cellen per milliliter. GS122-cellen vertoonden overlevingswinsten in de acht kilopascal-conditie wanneer osteopontine-afgeleide peptiden werden opgenomen in de matrix, terwijl de opname van integrine-bindende sialoproteïne of tenascine C-afgeleide peptiden minimale overlevingsvoordelen opleverde, zoals cultuur en matrices met het gember RGD-peptide.

Daarentegen leverden geen peptiden overlevingswinst op in de 0,8 kilopascal kweekconditie. Zowel GS122- als GS304-cellen verspreiden zich wanneer ze worden gekweekt in zachte of stijve hydrogelmatrices, waaronder RGD-bevattende peptiden. GS122-cellen vertonen een vergelijkbaar gebrek aan verspreiding in zowel 0,8 als 8 kilopascal met osteopontine.

GS122 vertoonde echter alleen een verhoogde weerstand tegen temozolomide in de acht kilopascals-toestand. Ten slotte kan dit geminiaturiseerde 3D-kweekplatform worden gebruikt om menselijke cellen van andere tumortypen te kweken, waaronder levensvatbare organoïden van terminaal gedifferentieerde neuro-endocriene prostaatkankercellen. Na deze procedure kunnen verdere technieken zoals single-cell RNA sequencing worden gebruikt om celfenotypen verder te karakteriseren.