Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) maakt beeldvorming met superresolutie en zeer efficiënte etikettering mogelijk

Een belangrijke beperking van expansiemicroscopie is dat fluorescentie vertraagt na polymerisatie en spijsvertering. Labelretentie expansiemicroscopie, we noemen het LR-ExM, maakt gebruik van tri functionele ankers, die polymerisatie en vertering zijn. Nadat we tri-functieanker hebben gebruikt, introduceren we fluorescentie na expansiestap.

We behouden dus een goede signaal-ruisverhouding terwijl we een hoge resolutie hebben. Labelretentie-uitbreidingsmicroscopie kan worden gecombineerd met andere eerder geïntroduceerde expansiemicroscopieën en ook fluorescerende microscopieën. Het is zeer robuust in veelzijdige methode.

En voor beeldvorming met een hoge regulatie is het echt belangrijk om een verbeterd signaal te hebben. Om te beginnen kweekcellen op een 16 goed verwijderbare kamerglas met compleet medium bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Zodra het aantal cellen ongeveer 40.000 bereikt, fixeert u cellen met 100 microliter 3,2% PFA in PEM-buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Permeabiliseer vervolgens cellen met de 100 microliter permeablisatiebuffer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Incubeer cellen met de streptavidinoplossing verdund in een celblokkerende buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en spoel vervolgens kort met 200 microliter celblokkerende buffer. Incubeer vervolgens cellen met 100 microliter biotineoplossing verdund in een celblokkerende buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Daarna incubeer cellen met 100 microliter primaire antilichaamoplossing die rat anti-alfa tubuline anti-alfa tubuline antilichaam en konijn anti clathrin zware keten antilichaam gedurende ofwel 16 uur bij vier graden Celsius of een uur bij kamertemperatuur. Incubeer vervolgens cellen met 100 microliter secundaire antilichaamoplossing met tri functionele ankers, ezel anti konijn graaf MA en ezel anti rat biotine MA gedurende een uur bij kamertemperatuur. Incubeer cellen met 100 microliter 0,25% glutaaraldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de eiwitten op de hydrogel te verankeren.

Verwijder de bovenste structuur van de 16 putplaat met het scheermesje of een ander verwijdergereedschap naar keuze en houd het onderste dekselglas. Leg het afdekglas in een petrischaaltje en leg ze op ijs. Voeg 45 microliter een monomeeroplossing toe aan elke put om cellen te conditioneren.

Broed vijf minuten op ijs. Om de gelation-oplossing te maken, bereidt u een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter voor. Meng monomeer, dubbel gedestilleerd water en 10% T med.

Voeg het ammonium per sulfaat nog niet toe. Houd ondertussen de buis van de gelation-oplossing op het ijs. Voeg 10% ammoniumpersulfaat toe aan de gelatatieoplossing.

Pipetteer onmiddellijk 40 microliter gelation-oplossing op elke put terwijl u een buis met gelation-oplossing op ijs bewaart. Leg de putplaat nog drie minuten op ijs. Om de vochtigheid van de gel tijdens de incubatie van 37 graden Celsius te behouden, bedekt u de petrischaal met het deksel en doet u een paar druppels water in de petrischaal.

Terwijl u het monster beschermt tegen licht, verplaatst u het afdekglas en de petrischaal van 10 centimeter naar een incubator van 37 graden Celsius gedurende 1,5 uur voor gelation. Snijd na het bakken het afdekglas om elke gel te scheiden. Breng gels over op zes putplaten.

Voeg twee milliliter verteringsbuffer toe aan elk putje. Laat de monsters een nacht bij kamertemperatuur of vier uur bij 37 graden Celsius. Was vervolgens gels met ten minste 10 keer overtollig volume water dan het uiteindelijke gelvolume, terwijl u de wasstap vier keer herhaalt gedurende 20 tot 30 minuten per keer, en de gel zet uit met ongeveer vier vouwen in elke dimensie.

Incubeer gels in twee milliliter volume streptavidin digoxigenine kleuringsbuffer met twee tot vijf micromolar streptavidin kleurstof en / of anti-digoxigenine kleurstof gedurende 24 uur bij kamertemperatuur terwijl de monsters in het donker worden gehouden. Was en breid de gel vervolgens twee tot vier keer uit met overmatig water. Elke wasbeurt duurt ongeveer 30 minuten tot een uur.

Voor eenvoudigere visualisatie van cellen onder fluorescerende microscopie, kleur cellen met DAPI tijdens de derde wasbeurt. Verdun DAPI-voorraad in één tot 5.000 waanideeën in waswater. Incubeer de gel met een DAPI-oplossing gedurende 30 minuten tot een uur.

Was vervolgens nog twee keer met drie milliliter water. Bedek de zes put glazen bodembeeldvormingskamer met drie milliliter van 0,01% polylysine om de gelmonsters te immobiliseren. Breng vervolgens gelmonsters over naar de gecodeerde beeldkamer en beeld de monsters af met de gewenste fluorescentiescopen.

Labelretentie-expansiemicroscopie toont verbeterde fluorescentielabeling in vergelijking met eiwitretentie-expansiemicroscopie of biotine-expansiemicroscopiemonsters. Labelretentie-expansiemicroscopie toont ongeveer zes keer hoger fluorescentiesignaal in vergelijking met eiwitretentie-expansiemicroscopie. LR-ExM kan effectief kleine structuren vastleggen, zoals met clathrin gecoate putten met subdefractionlimietresolutie.

Microtubuli en clathrin gecoate putten waren co-immunovlekken met behulp van functionele ankers, NHS MA-graaf en NHS MA-biotine. Evenzo werden clathrin gecoate putten en mitochondriën gelabeld met behulp van een enzymatische eiwittagbenadering met tri functionele ankers, zoals BG MA-biotine en BC MA-graaf. Bovendien worden immunokleuring gebaseerde benadering en de enzymatische eiwittagbenadering gecombineerd om de structuur van lamin A / C en nucleopore-complex te laten zien.

Labelretentie-expansiemicroscopie werd uitgevoerd op het hersenweefsel van de muis door co-immunokleuring van de presynaptische marker, Fagot en postsynaptische marker, Homerus 1. De twee labels waren duidelijk en goed gescheiden, wat een hoge resolutie en etiketteringsefficiëntie ondersteunt. Arbeidsretentie-uitbreidingsmicroscopie is een veelzijdige en robuuste methode, die kan worden gecombineerd met andere eerder geïntroduceerde uitbreidingsmicroscopieën.

Voor beeldvorming met hoge resolutie is het belangrijk om een goede etiketteringsefficiëntie te bereiken om de moleculaire schaalstructuur beter vast te leggen. Arbeidsretentie-uitbreidingsmicroscopie is een effectieve en robuuste methode om het signaal te verbeteren.