Voorbereiding en morfologische analyse van Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Neurale kamcellen emigreren uit schedelneuraalplooien in embryo's of wanneer ze in cultuur worden geplaatst. Dit biedt een handige methode om primaire migrerende neurale crest-cellen te isoleren zonder celdissociatie. Terwijl neurale crestmigratie meestal plaatsvindt binnen de driedimensionale embryonale omgeving, maakt tweedimensionale cultuur visualisatie en onderzoek van migratiegerelateerde processen mogelijk.

Hoewel er craniale neurale vouwcultuurprotocollen bestaan, vereist deze methode training en organismespecifieke stappen. Deze video demonstreert technieken om de reproduceerbare voorbereiding van kuiken craniale neurale vouwculturen te vergemakkelijken. Beginners worstelen vaak met het ontleden en plating van neurale plooien en het beoordelen van cultuurresultaten.

Door de dissectierichtlijnen te volgen en de hier beschreven morfometrische analyse toe te passen, kunnen consistente, kwantitatieve resultaten worden verkregen. Plaats om te beginnen de bevruchte eieren rechtop in een bevochtigde incubator bij 38 graden Celsius. Nadat u de eieren uit de incubator hebt verwijderd, desinfecteert u de schelpen door 70% ethanol grondig te spuiten en te laten drogen.

Gebruik voor het bevestigen en kleuren van de culturen glazen afdekglijders die in een weefselkweekschaal met meerdere putten zijn geplaatst en pipetteer voldoende fibronectine-oplossing om de bodem van de put te bedekken. Vervang vervolgens het deksel en incubeer de plaat met fibronectine-oplossing in een bevochtigde incubator bij 38 graden Celsius gedurende ten minste een uur terwijl neurale plooien worden ontleed. Gebruik een stompe tang om een klein gaatje in de schaal te prikken op 1/4 tot 1/3 van de lengte van het ei.

Steek de stompe tang voorzichtig in het kleine gat en zorg ervoor dat de dooier niet wordt verstoord. Snijd vervolgens de eierschaal rond het ei door, verwijder de bovenkant van de eierschaal en plaats het embryo voor isolatie. Bereid het embryo voor door voorzichtig de platte rand van een gesloten stompe tang te gebruiken om overtollig albumine op het oppervlak van de dooier die het embryo bedekt weg te vegen.

Gebruik een tang om een filterpapieren steunframe over het embryo te plaatsen, met het embryo in het raam van het frame. Druk zachtjes op het filtreerpapier om aan de dooier te hechten. Knip rond de buitenkant van het filterpapierframe met een dissectieschaar.

Gebruik een tang of schaartips om de rand van het frame vast te pakken en til het embryo voorzichtig weg van de dooier. Plaats het embryo met de papierlijstzijde naar beneden in een petrischaaltje van 60 of 100 milliliter gevuld met Ringer's met penstreep. Bewaar de schaal met embryo's op ijs als je ze verzamelt voor een RNA- of eiwitgevoelige downstream-toepassing.

Breng een embryo over naar een schone schaal met Ringer's pen-strep-oplossing. Zwaai het embryo voorzichtig heen en weer om alle dooiers die het zicht verduisteren op te ruimen en wissel de Pen-streptokokkenoplossing van de Ringer in of breng het over naar een vers gerecht als het troebel wordt. Plaats het embryo dorsaal en frame met de zijkant naar boven onder een ontleedmicroscoop.

Laat het embryo op het papieren frame liggen om het uitgerekt en op zijn plaats te houden. Verwijder vervolgens het vitellinemembraan en gebruik een tang om de neurale plooien bloot te leggen. Neem weefsel caudaal op aan de uitdijende optische blaasjes en rostral aan de achterhersenen, waar rhombomere vernauwingen net beginnen te verschijnen.

Snijd met behulp van een veerschaar voorzichtig de neurale plooien van de middenhersenen weg. Zorg ervoor dat u het dorsale aspect van de neurale vouw verwijdert met minimale verontreiniging van de neurale buis en niet-neuraal ectoderm, en breng de neurale plooien over naar een schone schaal met Ringer's pen-strep-oplossing met behulp van een P20-pipettor of een steriele glazen Pasteur-pipet gespoeld met dooierAchtige Ringer's pen-strep-oplossing. Bewaar verzamelde plooien op ijs terwijl extra plooien worden ontleed.

Nadat u de kweekschaal uit de incubator hebt verwijderd, gebruikt u een pipettor of Pasteur-pipet om de fibronectine-oplossing uit de afdekslips, schotel of put te verwijderen. Nadat u het met fibronectine bedekte substraat hebt gespoeld met Ringer's pen-strep-oplossing, voegt u een geschikt volume complete kweekmedia toe aan de schaal of put. Om het plastic te blokkeren en te voorkomen dat het weefsel plakt, gebruikt u een P20- of P200-pipettor en spoelt u de pipetpunt af met de pen-strepoplossing van Yolky Ringer.

Breng vervolgens de geïsoleerde neurale plooien over naar het midden van de met fibronectine gecoate afdekslip en zorg ervoor dat zo weinig mogelijk Ringer's pen-strep-oplossing wordt overgedragen. Nadat je de explantaten 10 tot 15 minuten hebt laten bezinken, plaats je ze in een bevochtigde kamer bij 38 graden Celsius door de kweekschaal langzaam en voorzichtig met vergulde neurale plooien te dragen. Verwijder de kweekmedia met een Pasteur-pipet en spoel de putjes af met filtergesteriliseerd PBS.

Voeg 4% paraformaldehyde toe en bewaar het op een platform shaker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder aan het einde van de incubatie paraformaldehyde, spoel de putjes drie keer met PBS en voeg PBST toe dat 5% serum bevat. Nu pipetteer 30 microliter 200-nanomolar Oregon Green geconjugeerd falloidine op een glad oppervlak voor elke afdekslip.

Verwijder met behulp van een tang de afdekslip van het PBST-serum met 5%, zodat de cellen naar boven gericht zijn. Voer overtollige vloeistof af door de rand van de afdekplaat kort aan te raken tegen een delicate taakwisser. Plaats voorzichtig elke afdekselcelzijde naar beneden op de druppel verdund falloïdine en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Til na de incubatietijd de afdeksel van de kleuringsoplossing op en plaats deze terug in de kweekschaal, draai deze om zodat de celzijde omhoog is. Zorg ervoor dat u de afdekslip bedekt met PBST en plaats deze gedurende 10 minuten op een platformschudder, waarbij u de afdekslips bedekt en in het donker houdt. Verwijder PBST en herhaal het tweemaal wassen van de afdekslips voor in totaal drie wasbeurten van 10 minuten.

Plaats een druppel montagemedia op een microscoopglaasje. Monteer de cover slip cell met de zijkant naar beneden door de cover slip langzaam onder een hoek op de montagemedia te laten zakken om te voorkomen dat er bubbels ontstaan en laat de media instellen voordat ze in beeld worden gebracht. Maak ten slotte een afbeelding van de gekleurde cellen en exporteer ze als TIFF-bestanden.

De neurale kuifcellen begonnen binnen drie tot vier uur na incubatie uit de aanhangende neurale vouwexplantaten te komen en de migratie werd na ongeveer 20 uur voltooid. De migrerende neurale crest-cellen werden gelabeld met behulp van HNK-1 en de meeste cellen bleken HNK-1-positief te zijn. De gemigreerde neurale topcellen werden gevisualiseerd door filamenteuze actine te kleuren met falloïdine.

Afbeeldingen van de met falloidine bevlekte cellen werden verwerkt met Behulp van ImageJ om een drempelafbeelding te produceren waarin cellen zwart leken met een witte achtergrond. Het drempelbeeld werd geanalyseerd en verschillende metingen werden weergegeven in contrasterende staafdiagrammen of vioolplots. Het gemiddelde oppervlak van de 69 geanalyseerde cellen was bijvoorbeeld ongeveer 802,11 vierkante micrometer, variërend van 60,27 tot 2.664,53 vierkante micrometer.

Circulariteit weerspiegelt de uitsteekpuitsteekbaarheid van de cel en varieert van 0,101 tot 0,875. De lagere waarden duiden op een langwerpige vorm, terwijl een waarde van één een perfecte cirkel aangeeft. De meeste cellen vertoonden een langwerpige vorm, die het gemakkelijkst te zien is in de vioolplot.

Migrerende neurale kamcellen in dit veld hadden een gemiddelde beeldverhouding van ongeveer 2,13, en een beeldverhouding van één duidt op een symmetrische vorm. Zorgvuldige excisie en explantbeplating zijn cruciaal voor succesvolle culturen. Laat neurale plooien gedurende 10 tot 15 minuten met de gesneden kant naar beneden zakken en breng vervolgens langzaam over naar de couveuse om de hechting te bevorderen.

Variaties op deze technieken omvatten voorbijgaande genetische manipulatie voorafgaand aan het kweken en time-lapse beeldvorming tijdens incubatie. Bovendien maakt dit protocol het mogelijk om premigratory en migrerende neurale crest celpopulaties te verzamelen voor analyse op omics-niveau.