Het uitpluizen van het samenspel tussen Natural Killer Cells en Nociceptor Neurons

Gezien het feit dat nociceptorneuronen verschillende neuropeptiden afscheiden en dat NK-cel de receptor voor deze neuropeptiden tot expressie bracht, besloten we een co-kweekmethode te ontwikkelen om het samenspel tussen de NK-cel en de nociceptorneuronen te bestuderen. Een dergelijke reductionistische methode zou nuttig kunnen zijn om te bestuderen hoe nociceptorneuronen de antitumorfunctie van NK-cellen beheersen, en het zou ook interessant kunnen zijn om te bestuderen hoe NK-cellen de eliminatie van gewonde neuronen controleerden. De procedure wordt gedemonstreerd door Ali Ahmadi, een voormalige masterstudent uit mijn lab.

Om de natuurlijke killer of NK-celisolatie en -cultuur te beginnen, verzamelt u de muizen milt in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 500 microliter steriele PBS en homogeniseert u vervolgens de milt met behulp van een stamper. Verdun vervolgens de cellen met één milliliter steriel PBS en filter het mengsel door een 50 micron celzeef in een conische buis van 50 milliliter. Vul het gefilterde homogenaatvolume aan tot 10 milliliter met steriel PBS.

Tel de cellen in 10 microliter van het verdunde homogenaat met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de resterende cellen gedurende vijf minuten bij 500 G en verwijder het supernatant. Resuspendeer vervolgens de cellen op 10 tot de achtste cellen per milliliter in aangevuld RPMI 1640-medium.

Zuiver de milt NK-cellen magnetisch met behulp van een NK-celisolatiekit van de muis en bevestig de zuiverheid van NK-cellen met behulp van flowcytometrie. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer, gevolgd door centrifugatie na vijf minuten bij 500 G en verwijder vervolgens het supernatant. Voor het stimuleren van de gepelletiseerde NK-cellen resuspensie deze cellen in IL-2 en IL-15 aangevuld RPMI 1640 kweekmedium.

Kweek twee keer 10 tot de zesde NK-cellen per milliliter in een 96-well U-bodemplaat gedurende 48 uur. Bedek 24 uur voor de NK-celstimulatie de 96-wellsplaat met 100 microliter per putje laminine en incubeer deze gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder na incubatie de oplossing en laat de putten aan de lucht drogen in de bioveiligheidskast.

Bevestig vervolgens de geëuthanaseerde muis op het bord in een buikligging. Til de huid op en snijd de huid langs de dorsale kolom. Knip het lumbosacrale gewricht af en scheid het heiligbeen van de lumbale wervelkolom met een schaar.

Scheid vervolgens de wervelkolom door de spieren en ribben aan beide zijden in de schedelrichting te snijden totdat de basis van de schedel is bereikt. Gebruik een schaar om de wervelkolom bij het atlantooccipitale gewricht af te snijden. Verwijder vervolgens de spier en het vetweefsel van de wervelkolom.

Pin en open de wervelkolom om het ruggenmerg te verwijderen voordat u toegang krijgt tot het dorsale wortelganglion of DRG in de tussenwervelforamina verbonden met het ruggenmerg via de dorsale wortel. Oogst vervolgens de DRG's in een conische buis van 15 milliliter gevuld met 10 milliliter ijskoude aangevulde DMEM. Centrifugeer vervolgens het preparaat gedurende vijf minuten bij 200 G bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.

Voeg een 250 microliter PBS toe met één milligram per milliliter collagenase IV en 2,4 eenheden per milliliter dispase II.Incubeer deze DRG met collagenase-dispase-oplossing gedurende 80 minuten met milde agitatie. Om de enzymen te inactiveren, voegt u vijf milliliter aangevuld DMEM-medium toe en centrifugeert u de oplossing bij 200 G.Verwijder na vijf minuten voorzichtig het supernatant met een pipet en laat ongeveer 100 microliter van het supernatant achter om ongewenst celverlies te voorkomen. Voeg vervolgens een milliliter aangevuld DMEM-medium toe aan de cellen en gebruik een pipetpistool en drie glazen Pasteur-pipetten van afnemende grootte om de DRG voorzichtig te tritureren in een eencellig preparaat.

Verdun tijdens het werken in een bioveiligheidskast runderserumalbumine of BSA in steriel PBS tot een eindconcentratie van 15% en bewaar één milliliter aliquot bij min 20 graden Celsius. Om een BSA-gradiënt in een conische buis van 15 milliliter te creëren, voegt u twee milliliter steriele PBS toe en doseert u vervolgens langzaam een milliliter 15% BSA-oplossing aan de onderkant van de buis. Verstoor het verloop niet door de pipet voorzichtig te verwijderen.

Voeg met behulp van een P200-pipet de triturated ganglia-suspensie met de neuronen toe aan de zijkant van de buis in de gradiënt. Stel vervolgens de versnelling en vertraging in op het minimum om het neuron met de BSA-gradiënt gedurende 12 minuten bij 200 G te centrifugeren.Na de centrifugatie verwijdert u al het supernatant met een pipet en resuspendeert u de cellen in 500 microliter Neurobasal. Plaat 10, 000 neuronen per put in een laminine-gecoate platte bodem 96-well plaat.

Om de aanhechting van de neuronen mogelijk te maken, incubeer je de 96-well plaat 's nachts bij 37 graden Celsius. Om te beginnen met co-cultiveren, verwijder je langzaam de Neurobasal uit de neuroncultuur. Na 48 uur stimulatie met IL-2 en IL-15, resuspensie de NK-cellen en voeg 10 toe aan de vijfde NK-cellen per put aan de neuroncultuur.

Co-kweek de cellen in aangevulde Neurobasal MX bij 37 graden Celsius. Verzamel en was de cellen na 48 uur driemaal met PBS en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 500 G bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg voordat u de cellen kleurt met één tot 1.000 verdunde levensvatbaarheidskleurstof eFluor 780 gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.

Was en centrifugeer de cellen zoals gedemonstreerd, gevolgd door behandeling met CD 1632 gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om niet-specifieke plaatsen op de cellen te blokkeren, gevolgd door het verzamelen en wassen van de cellen met PBS driemaal. Na de volgende cyclus van wassen en centrifugatie, kleur de cellen met BV421, anti-NK-1.1, fluoresceïne isothiocyanaat anti-NKp46 en phycoerythrin anti-GM-CSF gedurende 15 minuten. Nogmaals, verzamel en was de cellen driemaal met PBS, centrifugeer ze en gooi het supernatant weg, resuspenseer de cellen vervolgens in 500 microliter FACS-buffer en immunofenotypeer de NK-cellen met behulp van flowcytometrie.

Wanneer ze alleen werden gekweekt, brachten NK-cellen basale niveaus tot expressie van granulocytenmacrofaagkoloniestimulerende factor of GM-CSF en NKp46. Wanneer co-gekweekt met DRG-neuronen geoogst van nociceptor intacte muizen, verminderde capsaïcinestimulatie de EXPRESSIE VAN NK-cellen van GM-CSF. De capsaïcine had geen invloed op NK-celactivaties wanneer ze samen werden gekweekt met DRG-neuronen geoogst van nociceptor-geableerde muizen.

Het niveau van NKp46 werd niet beïnvloed. De belangrijkste stappen in dit protocol is de DRG-dissociatie en isolatie. Het idee is om maximale neuronale levensvatbaarheid te behouden door het maken van bubbels te vermijden en de juiste maat pipet te gebruiken.

Na het protocol kan de onderzoeker RNA-sequencing of qPCR gebruiken om transcriptverandering in FACS-gezuiverde cellen te meten, of ze kunnen ELISA gebruiken om de secretie van cytokine of neuropeptiden te meten. Een dergelijk samenspel onthult dat de NK-celfunctie waarschijnlijk is afgestemd door nociceptorneuron. En deze overspraak kan belangrijk zijn in biologische processen, variërend van zenuwletsel, bacteriële en virale infectie tot maligniteiten.