Evaluatie van fotosynthetische efficiëntie in fotorespiratoire mutanten door chlorofylfluorescentieanalyse

Het doel van deze methode is om mutanten in de fotorespiratoire route te identificeren met behulp van een lage CO2-screening. We presenteren een methode om mutanten te identificeren die de fotorespiratie verstoren na blootstelling aan lage CO2. Een voordeel van deze methode is dat het een high throughput screening is voor zaailingen die in een relatief korte tijd kan worden gedaan.

De volgende secties geven details over zaadvoorbereiding en sterilisatie, plantengroei en lage CO2-behandeling, configureren van het fluorescentiebeeldvormingssysteem, meten kwantumopbrengst van behandelde monsters, representatieve resultaten en conclusies. Zaadbereiding en sterilisatie. Zaadbereiding bestaat uit zaadindrinking en zaadsterilisatie.

Het is belangrijk op te merken dat al deze stappen worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap om steriele omstandigheden te behouden. Alle benodigde materialen, reagentia en groeimedium worden geautoclaveerd. De gebruikte zaadlijnen zijn plgg1-1, abcb26 en WT of wild type.

Neem zaden in steriel water in een laminaire stromingskap en stratificeer vervolgens twee dagen lang bij vier graden Celsius in het donker. Bereid onder steriele omstandigheden 10 milliliter van 50% volume tot volume bleekoplossing en voeg ongeveer 20 microliter Tween 20 toe. Verwijder water uit ingebakken zaden, voeg vervolgens een milliliter bleekoplossing toe aan de microcentrifugebuis en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder de bleekoplossing met een pipet. Spoel de zaden in een milliliter steriel water om te resuspenderen. Verwijder het water zodra de zaden op de bodem zijn neergedaald.

Resuspendeer zaden in steriele 0,1% agarose oplossing. Voor zaadplating, basale mediumplaten met 1% MS medium met vitamines en 1% agar voor de teelt van de testmutanten. Snijd een pipetpunt van 200 microliter met een scheermesje.

Plaats met behulp van een pipet één zaadje in het midden van het aangewezen vierkante raster voor elke testmutant of genotype. Hier wordt een vierkante plaat met een raster van één bij één centimeter gebruikt. Dit helpt om een uniforme afstand tussen elke zaailing te houden en overlapping te voorkomen, wat later belangrijk zal zijn in de fluorescentiebeeldvorming en -analyse.

Zodra de zaden zijn verguld, wikkelt u chirurgische tape rond het deksel om af te sluiten en plaatst u deze vervolgens in de groeikamer. Plantengroei en lage CO2-behandeling. Kweek planten zeven tot negen dagen bij 20 graden Celsius onder een lichtcyclus van acht uur van 120 micromol per vierkante meter per seconde en 16 uur duisternis bij 18 graden Celsius.

Controleer planten op de zesde dag om te bepalen of ze groot genoeg zijn voor beeldvorming. Stel planten op de achtste dag na het plateren bloot aan een lage CO2. Plaats zuiveringsinstallaties in een afgesloten doos in de groeikamer met een lichtintensiteit van 200 micromol per vierkante meter per seconde gedurende 12 uur.

De lage CO2-conditie werd geconstrueerd met behulp van een luchtdichte transparante container met 100 gram natronkalk op de bodem van de container. De container werd in dezelfde groeikamer geplaatst als de besturing. De controle-installaties blijven gedurende 12 uur onder de 120 micromol per vierkante meter per seconde in omgevings-CO2.

Configureer het fluorescentiebeeldvormingssysteem. Plaats een testplaat gecentreerd onder de camera op een vaste afstand in het fluorescentiebeeldvormingssysteem. Navigeer in de instrumentsoftware naar het live-venster en vink het vakje Flitsen aan om niet-actinische meetflitsen in te schakelen.

Klik op de zoom- en scherpstelgereedschappen totdat u een volledig en scherp beeld ziet. Stel de waarde van de EL-sluiter in op nul en pas de gevoeligheid aan om een fluorescerend signaal te krijgen in het bereik van 200 tot 500 digitale eenheden. Plaats een lichtmeter in dezelfde positie als waarmee de camera-instellingen worden aangepast.

Vink in het livevenster het vakje Super aan om een verzadigingspuls te starten die 800 milliseconden duurt. Gebruik de schuifregelaar om het percentage relatief vermogen voor de Superpuls aan te passen totdat de lichtmeter 6.000 tot 8.000 micromol per vierkante meter per seconde leest. Meet de kwantumopbrengst van behandelde monsters.

Direct na de behandeling, afdek platen met aluminiumfolie gedurende 15 minuten voor donkere aanpassing. Verwijder folie om de kwantumopbrengst van fotosysteem twee te meten met een pulsamplitude gemodificeerde fluorometer. Plaats vervolgens de zaailingplaat direct onder de camera en voer het kwantumopbrengstprotocol uit dat te vinden is in onze GitHub-repository.

Download het Quantum Yield Protocol van GitHub. Gebruik een fluorometersoftware om het programmabestand te openen door op het mappictogram te klikken en naar de bestandslocatie te navigeren. Voer het quantum yield-protocol uit door op het rode bliksempictogram te klikken.

Nadat het protocol is voltooid, navigeert u naar het venster voor de pre-analyse. Verdeel de plaat in afzonderlijke zaailingen door alle pixels voor elke zaailing op de plaatafbeelding te markeren. Klik op Achtergronduitsluiting om gemarkeerde achtergrondpixels te verwijderen, zodat alleen het zaailinggebied overblijft.

Klik op analyseren om fluorescentiegegevens te genereren voor elke zaailing op de plaatafbeelding. Pas het fluorescentiewaardebereik handmatig aan om consistente minimum- en maximumwaarden tussen alle platen weer te geven. Klik op het tabblad Experiment op Exporteren en vervolgens op Numeriek.

Klik op Numeriek gemiddelde om een tekstbestand te genereren met de kwantumopbrengst voor elke zaailing. Open het tekstbestand en de spreadsheet voor analyse. De spreadsheet bevat het gebiedsnummer, de grootte van de pixels, Fm, Ft, Fq en QY. Ten eerste moeten we het gebiedsnummer identificeren voor het overeenkomstige genotype, of het nu gaat om een wild type of een testmutant, Resultaten.

Hier zijn de plaatfoto's van onbewerkte en fluorescentiebeelden van omgevings- en co2-lage screening van wilde typen en testmutanten. Elke plaat wordt gelabeld op oppervlaktenummer met overeenkomstige fluorescentiemetingen als kwantumopbrengst of QY. De gegevens worden geëxporteerd als een tekstbestand en kunnen worden geopend in een spreadsheet voor analyse. De donkere aangepaste Fv/Fm quantum yield efficiencies van wilde types en mutanten worden gevisualiseerd door box en whisker plots.

Om het statistische verschil tussen wilde typen en testmutanten te testen, werd een paarsgewijze T-test gebruikt met een P-waarde van minder dan 0,05. Hier gebruiken we de fotorespiratoire mutantenlijn met verminderde kwantumopbrengst Fv/ Fm als testmutant om de efficiëntie van onze screeningsmethode te controleren. Onze resultaten tonen aan dat testmutanten een aanzienlijk lagere kwantumopbrengstefficiëntie hebben in vergelijking met de wilde typen.

Dit geeft aan dat onze screeningsmethode in staat is om fotorespiratoire mutanten te identificeren met behulp van lage CO2-screening. Conclusies. Een belangrijk ding om te onthouden tijdens het gebruik van dit protocol is om ervoor te zorgen dat Arabidopsis-zaailingen groot genoeg zijn om fluorescentie te meten, maar niet zo groot dat de planten elkaar zouden overlappen tijdens beeldvorming. Het heeft de voorkeur om de zaailingen af te beelden als de eerste echte bladeren om te proberen de bladgrootte en bladhoeken uniform te houden.

Dit protocol kan worden gebruikt als een high throughput screening voor zaailingen. Beeldvorming van elke plaat is relatief snel en heeft het potentieel om meer dan 1.000 zaailingen per dag te screenen. Chlorofylfluorescentieanalyse stelde ons in staat om fotorespiratoire mutanten te identificeren met behulp van een lage CO2-screening, wat belangrijk is voor het handhaven van de fotorespiratie-efficiëntie.

Dit protocol is niet beperkt tot Arabidopsis en heeft het potentiële gebruik voor abiotische stressresponsexperimenten.