Name: Evaluatie van fotosynthetische efficiëntie in fotorespiratoire mutanten door chlorofylfluorescentieanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Leer hoe je fotosynthetische efficiëntie evalueert in fotorespiratoire mutanten met behulp van chlorofylfluorescentieanalyse. Deze methode maakt snelle screening van Arabidopsis-zaaillen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Louisiana Board of Regents (AWD-AM210544).

1. Zaadbereiding en sterilisatie
OPMERKING: Zaadbereiding bestaat uit zaadindrinking en zaadsterilisatie. Het is belangrijk op te merken dat al deze stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap om steriele omstandigheden te behouden. Alle benodigde materialen, reagentia en groeimedia moeten worden geautoclaveerd (zie de tabel met materialen).
<ol><li>Zaadimbibatie en stratificatie OPMERKING: De gebruikte zaadlijnen zijn plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) en wild type (WT, Col-0).<ol><li>Doseer de zaden in 1,5 ml microcentrifugebuizen. Neem de zaden in steriel water in een laminaire stromingskap en stratificeer bij 4 °C in het donker gedurende 2 dagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zaadsterilisatie<ol><li>Bereid onder steriele omstandigheden 10 ml 50% (v/v) bleekoplossing en voeg ongeveer 20 μL Tween 20 toe. Voor zaadsterilisatie, verwijder water uit de ingebakken zaden, voeg 1 ml bleekoplossing toe aan de microcentrifugebuizen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Verwijder de bleekoplossing met een pipet.</li>
		<li>Spoel de zaden af in 1 ml steriel water om te resuspenderen. Verwijder het water zodra de zaden op de bodem zijn neergedaald. Herhaal stap 1.6 en stap 1.7 zeven keer.</li>
		<li>Resuspendeer de zaden in steriele 0,1% agarose oplossing.</li>
	</ol></li>
	<li>Zaadplating<ol><li>Maak een 1 L volume van Murashige & Skoog Basal Medium met vitamines en 1,0 g / L van 2-(N-morphonio) ethaansulfonzuur (MS) door 5,43 g van het poeder toe te voegen aan 500 ml gedestilleerd water. Pas de pH aan tussen 5,6 en 5,8 met kaliumhydroxide (KOH). Vul tot 1 L met gedestilleerd water.<ol><li>Splits de vloeibare oplossing in 500 ml en plaats elke helft in een kolf van 1 l met een magnetische roerstaaf. Voeg 5 g agarpoeder toe om voor elke kolf een 1% agar w/v-oplossing te verkrijgen.</li>
			<li>Autoclaaf bij 121 °C en 15 psi gedurende 30 minuten; plaats vervolgens op kamertemperatuur terwijl je langzaam roert. Giet bij het afkoelen 25 ml MS-agar in een vierkante petrischaal. Laat het stollen. OPMERKING: Deze Murashige &Skoog Basal Medium platen bevatten 1% MS medium met vitamines en 1% agar voor de teelt van de testmutanten.</li>
		</ol></li>
		<li>Snijd een pipetpunt van 200 μL met een scheermesje. Plaats één zaadje in het midden van het aangewezen vierkante raster voor elke testmutant of genotype (1 cm2 vierkant) van een vierkante MS-plaat (figuur 1) met behulp van een micropipette van 200 μL. OPMERKING: Het vierkante raster van 1 cm x 1 cm helpt om een uniforme afstand tussen de zaailingen te houden en overlapping te voorkomen, wat belangrijk zal zijn bij latere fluorescentiebeeldvorming en -analyse.</li>
		<li>Zodra de zaden zijn verguld, wikkelt u met chirurgische tape rond het deksel om af te sluiten en plaatst u het in de groeikamer in omstandigheden zoals hieronder beschreven.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Plantengroei en co2-arme behandeling
<ol><li>Laat de planten 7-9 dagen groeien bij 20 °C onder een lichtcyclus van 8 uur van 120 μmol·m−2s−1 en 16 uur duisternis bij 18 °C. Controleer de planten op de 6e dag om te bepalen of ze groot genoeg zijn voor beeldvorming. Stel de planten op de 8e dag na de beplating bloot aan een laag CO2-gehalte.</li>
	<li>Co2-arme behandeling<ol><li>Plaats na de 7-9 dagen vier van de acht platen uit de omgevingsgroeikamercondities in fotorespiratoire omstandigheden van 20 °C, continue lichtniveaus van 200 μmol·m−2s−1 en lage CO2 gedurende 12 uur.</li>
		<li>Construeer de CO2-lage toestand met behulp van een luchtdichte transparante container met 100 g natronkalk op de bodem van de container. Plaats de container in dezelfde groeikamer als de controle. Houd de controle-installatiesgedurende 12 uur onder 120 μmol·m−2s−1 in omgevings-CO 2.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Het fluorescentiebeeldvormingssysteem configureren
<ol><li>Plaats een testplaat (voorbereid volgens sectie 1 en sectie 2) gecentreerd onder de camera op een vaste afstand in het fluorescentiebeeldvormingssysteem.</li>
	<li>Navigeer in de software van het instrument naar het Live Window en vink het vakje Knipperen aan om niet-actinische meetflitsen in te schakelen.</li>
	<li>Klik op de gereedschappen Zoomen en Scherpstellen totdat een volledig en scherp beeld zichtbaar is. Gebruik hiervoor een podium of een plank om de afstand tussen de planten en de camera aan te passen. Houd de zoom, focus en afstand tot de camera constant gedurende het hele experiment.</li>
	<li>Stel de waarde van El. Shutter in op 0 en pas de gevoeligheid aan om een fluorescerend signaal te krijgen in het bereik van 200-500 digitale eenheden. OPMERKING: Een lagere El. Sluiterwaarde (0-1) zorgt ervoor dat de meetflitsen niet-actinisch zijn, terwijl een hogere waarde (2) de resolutie van de afbeelding zal verbeteren.</li>
	<li>Plaats een lichtmeter in dezelfde positie als waarmee de camera-instellingen worden aangepast.</li>
	<li>Schakel in het livevenster het selectievakje Super in om een verzadigingspuls van 800 ms te starten. Vergeet niet om het vakje elke keer aan te vinken voor een nieuwe puls.</li>
	<li>Gebruik de schuifregelaar om het percentage relatief vermogen voor de superpuls aan te passen totdat de lichtmeter 6.000-8.000 μmol·m−2s−1 aangeeft.</li>
</ol>4. Ontwerp het kwantumopbrengstprogramma
<ol><li>Importeer standaardbesturingssysteem voor het imagingsysteem. Standaard.inc opnemen Inclusief light.inc OPMERKING: De syntaxis van het programma die in dit experiment ter referentie wordt gebruikt, is voor een FluorCam-beeldvormingssysteem.</li>
	<li>Definieer de volgende globale variabelen op basis van de geconfigureerde lichtinstellingen: Sluiter = 0 Gevoeligheid = 40 Super = 65</li>
	<li>Neem de tijdstap op voor het vastleggen van gegevens: TS = 20 ms</li>
	<li>Verzamel de Fo-meting door fluorescentie te bemonsteren in een aan het donker aangepaste toestand. F0duration = 2s; F0period = 200ms; OPMERKING: F0duration definieert het tijdsbereik waarover de aan het donker aangepaste fluorescentie wordt geregistreerd. F0period definieert het tijdsinterval waarover de donker-aangepaste fluorescentiemeting wordt herhaald.</li>
	<li>Noteer de Fo-metingen in gegevenstabellen. <0,F0periode.. F0duration>=>mfmsub <0s>->checkpoint,"startFo" <F0duration - F0periodicum>=>checkpoint,"endFo"; Indien < , vertegenwoordigt > de reeks fluorescentiewaarden die door de tijd zijn geïndexeerd; => slaat metingen op in een systeembestand; mfmsub vertegenwoordigt de volledige dataset voor het experiment; en checkpoint maakt een subset voor gegevens van specifieke metingen zoals startFo.</li>
	<li>Verzamel en bewaar de Fm-meting door fluorescentie te bemonsteren na een verzadigde puls. PulseDuration = 960ms; ## a1 = F0duration + 40ms a2 = a1 + 480 ms; <a1> = >SatPulse (PulseDuration); <a1 + 80ms, a1 + 160ms.a1 + PulseDuration> = >mfmsub <a1 + PulseDuration + 80ms> = >mfmsub; <a2>=>checkpoint,"startFm" <a1 + PulseDuration - 80ms> = >checkpoint,"endFm" <a2 + 80ms>=>checkpoint,"timeVisual"; Wanneer a1 en a2 variabelen zijn om de bemonsteringstijd te coördineren met de verzadigingspuls; a1 staat voor de begintijd van de Fm-meting; en a2 vertegenwoordigt de middelste tijd van de puls.</li>
</ol>5. Meten van de kwantumopbrengst van de behandelde monsters
<ol><li>Direct na de behandeling bedek de platen met aluminiumfolie gedurende 15 minuten voor donkere aanpassing. Verwijder de folie om de kwantumopbrengst van fotosysteem II te meten met een pulsamplitude-gemodificeerde fluorometer. Plaats vervolgens de zaailingplaat direct onder de camera en voer het kwantumopbrengstprotocol uit dat te vinden is in de GitHub-repository.</li>
	<li>Download het quantum_yield protocol van GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) of gebruik een vergelijkbaar ontworpen programma uit sectie 4. Gebruik de software van de fluorometer om het programmabestand te openen door op het mappictogram te klikken en naar de bestandslocatie te navigeren.</li>
	<li>Voer het kwantumopbrengstprogramma uit door op het rode bliksempictogram te klikken.</li>
	<li>Nadat het protocol is voltooid, navigeert u naar het preanalysevenster . Verdeel de plaat in afzonderlijke zaailingen met behulp van de selectiegereedschappen om alle pixels voor elke zaailing op de plaatafbeelding te markeren. Klik op Achtergronduitsluiting om gemarkeerde achtergrondpixels te verwijderen, zodat alleen het zaailinggebied overblijft.</li>
	<li>Klik op Analyseren om fluorescentiegegevens te genereren voor elke zaailing op de plaatafbeelding. Pas het fluorescentiewaardebereik handmatig aan om consistente minimum- en maximumwaarden tussen alle platen weer te geven.</li>
	<li>Klik op Numeriek-gemiddelde in het tabblad Experiment | | exporteren Numeriek. Selecteer Alle gegevens en per kolom en klik op OK om een tekstbestand met QY-metingen voor elke zaailing te genereren.</li>
</ol>6. Het gegevensbestand openen
<ol><li>Open het tekstbestand in een spreadsheet voor analyse. Van de koppen met het gebiedsnummer, de grootte van pixels, Fm, Ft, Fq en QY, identificeert u het gebiedsnummer voor het kerngenotype (WT of testmutant) en QYmax. Voer een paarsgewijze t-test uit met betrekking tot wildtype om significantie te bepalen. Gegevens worden geïnterpreteerd als significant verschillend wanneer p-waarden lager zijn dan 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Peterhansel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorespiration%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Photorespiration.</a> Arabidopsis Book. 8, 0130(2010).</li>
<li>Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+analysis+as+tool+for+the+discovery+of+transport+proteins+in+photorespiration%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration.</a> Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).</li>
<li>Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+closing+the+remaining+gaps+in+photorespiration--the+essential+but+unexplored+role+of+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards closing the remaining gaps in photorespiration--the essential but unexplored role of transport proteins.</a> Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).</li>
<li>Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+costs+of+photorespiration+to+food+production+now+and+in+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The costs of photorespiration to food production now and in the future.</a> Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).</li>
<li>South, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid+sodium+symporter+BASS6+can+transport+glycolate+and+is+involved+in+photorespiratory+metabolism+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).</li>
<li>Pick, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGG1%2C+a+plastidic+glycolate+glycerate+transporter%2C+is+required+for+photorespiration+and+defines+a+unique+class+of+metabolite+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters.</a> Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).</li>
<li>Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+proteins+enabling+plant+photorespiratory+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism.</a> Plants. 10 (5), 880(2021).</li>
<li>Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+fluorescence+screening+of+Arabidopsis+thaliana+for+CO2+sensitive+photorespiration+and+photoinhibition+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants.</a> Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).</li>
<li>Ogawa, T., Sonoike, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+mutants+using+chlorophyll+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Screening of mutants using chlorophyll fluorescence.</a> Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).</li>
<li>Kleffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+chloroplast+proteome+reveals+pathway+abundance+and+novel+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions.</a> Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).</li>
<li>Hempel, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Molecular+characterization+of+the+plastid-localized+ABC+protein+TAP1+in+Arabidopsis+thaliana%22">Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Stavanger. Ph.D. thesis (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of belangenconflicten.

De experimentele methoden die in dit artikel worden beschreven, hebben enkele voordelen en beperkingen. Een voordeel is dat deze methode veel plantenzaailingen kan screenen, hoewel enkele voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om besmetting van de plantmediaplaat tijdens het beplatings- en groeiproces te voorkomen. Daarom is het van cruciaal belang om de Arabidopsis-platen af te dichten met chirurgische tape. Een ander voordeel van dit experiment is dat het een kortere fotorespiratoire stressperiode van 12 uur heeft ...

Abiotische stressomstandigheden die vaak worden gezien op de velden van boeren kunnen de gewasopbrengsten negatief beïnvloeden door de fotosynthetische efficiëntie te verminderen. Schadelijke omgevingsomstandigheden zoals hittegolven, klimaatverandering, droogte en zoutgehalte van de bodem kunnen abiotische stress veroorzaken die de beschikbaarheid van CO2 verandert en de reactie van een plant op hoge lichtstress vermindert. De twee grootste terrestrische koolstoffluxen zijn fotosynthese en fotorespiratie, die essentieel zijn voor plantengroei en gewasopbrengsten. Veel van de belangrijke eiwitten en enzymen die betrokken zijn bij deze processen zijn gekarakteriseerd onder laboratoriumomstandigheden en geïdentificeerd op genetisch niveau1. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt bij het begrijpen van fotosynthese en fotorespiratie, blijven veel stappen, waaronder transport tussen plantenorganellen, onkarakteristiek 2,3.
Fotorespiratie, de op een na grootste koolstofflux in planten na fotosynthese, begint wanneer het enzym Rubisco zuurstof in plaats van koolstofdioxide fixeert op ribulose 1,5 bisfosfaat (RuBP), waardoor de remmende verbinding 2-fosfoglycolaat (2PG)1 wordt gegenereerd. Om de remmende effecten van 2PG te minimaliseren en de voorheen vaste koolstof te recyclen, hebben C3-planten het multi-organellaire proces van fotorespiratie ontwikkeld. Fotorespiratie zet twee moleculen van 2PG om in één molecuul 3-fosfoglyceraat (3PGA), dat opnieuw in de C3-koolstoffixatiecyclus kan komen1. Fotorespiratie converteert dus slechts 75% van de eerder vaste koolstof van de generatie van 2PG en verbruikt ATP in het proces. Als gevolg hiervan is het proces van fotorespiratie een aanzienlijke weerstand van 10% -50% op het fotosynthetische proces, afhankelijk van de beschikbaarheid van water en de temperaturen van het groeiseizoen4.
De enzymen die betrokken zijn bij fotorespiratie zijn al tientallen jaren een onderzoeksgebied, maar slechts een klein aantal transporteiwitten is op genetisch niveau gekarakteriseerd, hoewel er ten minste 25 transportstappen betrokken zijn bij het proces 5,6,7. De twee transporteiwitten die direct betrokken zijn bij de beweging van koolstof die wordt gegenereerd in het fotorespiratieproces zijn de plastadische glycolaat/glyceraattransporter PLGG1 en de galzuurnatriumsymporter BASS6, die beide betrokken zijn bij de export van glycolaat uit de chloroplast 5,6.
Onder omgevingstemperatuur [CO2] fixeert Rubisco ongeveer 20% van de tijd een zuurstofmolecuul aan RuBP1. Wanneer planten worden blootgesteld aan lage [CO2], nemen de fotorespiratiesnelheden toe, waardoor lage [CO2] een ideale omgeving is om te testen op mutanten die belangrijk kunnen zijn onder verhoogde fotorespiratiestress. Het testen van aanvullende vermeende chloroplast transport eiwit T-DNA lijnen onder lage CO2 gedurende 24 uur en het meten van veranderingen in chlorofyl fluorescentie leidde tot de identificatie van bass6-1 plantenlijnen die een fotorespiratie mutant fenotype5 aantoonden. Verdere karakterisering toonde aan dat BASS6 een glycolaattransporter is in het binnenmembraan van de chloroplast.
Dit artikel beschrijft in detail een protocol dat vergelijkbaar is met wat aanvankelijk werd gebruikt om BASS6 te identificeren als een fotorespiratietransporter, die afkomstig was van een lijst met vermeende transporteiwitten in het chloroplastmembraan8 Dit protocol kan worden gebruikt in een high-throughput experiment dat Arabidopsis T-DNA-mutanten of EMS-gegenereerde mutante planten karakteriseert als een manier om genen te identificeren die belangrijk zijn voor het handhaven van fotosynthetische efficiëntie onder een reeks abiotische stress zoals hitte, hoge lichtstress, droogte en CO2-beschikbaarheid . Het screenen van plantenmutanten met behulp van chlorofylfluorescentie is in het verleden gebruikt om snel genen te identificeren die belangrijk zijn voor het primaire metabolisme9. Met maar liefst 30% van het Arabidopsis-genoom dat genen bevat die coderen voor eiwitten met een onbekende of slecht gekarakteriseerde functie, zou stress-geïnduceerde analyse van fotosynthetische efficiëntie inzicht kunnen geven in moleculaire functies die niet onder gecontroleerde omstandigheden in mutante planten worden waargenomen10. Het doel van deze methode is om mutanten van de fotorespiratoire route te identificeren met behulp van een lage CO2-screening . We presenteren een methode om mutanten te identificeren die de fotorespiratie verstoren na blootstelling aan lage CO2. Een voordeel van deze methode is dat het een high-throughput screening is voor zaailingen die in een relatief korte tijd kan worden gedaan. De secties van het videoprotocol geven details over zaadvoorbereiding en sterilisatie, plantengroei en lage CO2-behandeling , de configuratie van het fluorescentiebeeldvormingssysteem, de meting van de kwantumopbrengst van de behandelde monsters, representatieve resultaten en conclusies.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>VWR</td><td>10810-070</td><td>container voor zaadsterilisatie</td></tr><tr><td>agarose</td><td>VWR</td><td>9012-36-6</td><td>chemisch middel gebruikt om zaden op te schorsen voor eenvoudig beplaten</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana zaden (abcb26)</td><td>ABRC, besteld via TAIR www.arabidopsis.org</td><td>SALK_085232</td><td>Arabidopsis-zaden gebruikt als experimentele groep</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana zaden (plgg1-1)</td><td>ABRC, besteld via TAIR www.arabidopsis.org</td><td>SALK_053469C</td><td>ouder Arabidopsis-zaden&nbsp;</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana zaden (WT)</td><td>ABRC, besteld via TAIR www.arabidopsis.org</td><td>Col-0</td><td>Arabidopsis wild type zaden gebruikt als controlegroep</td></tr><tr><td>&nbsp;bleach&nbsp;</td><td>clorox</td><td>generiek bleekmiddel&nbsp;</td><td>chemisch middel gebruikt om zaden te steriliseren</td></tr><tr><td>Carbolime absorber</td><td>Medline products</td><td>S232-104-001</td><td>CO2 absorber</td></tr><tr><td>Gesloten FluorCam</td><td>Photon Systems Instruments</td><td>FC 800-C</td><td>Fluorescentiebeeldvormer</td></tr><tr><td>FluoroCam FC 800-C</td><td>Photon Systems Instruments</td><td>Gesloten FluorCam FC 800-C/1010-S</td><td>Fluorescentiebeeldvormer</td></tr><tr><td>FluoroCam7</td><td>Photon Systems Instruments</td><td>Gesloten FluorCam FC 800-C/1010-S</td><td>Fluorescentiebeeldanalysesoftware</td></tr><tr><td>Gelzan (plantenagar)</td><td>Phytotech labs</td><td>71010-52-1</td><td>chemisch middel gebruikt om MS-media als platen te verstevigen&nbsp;</td></tr><tr><td>glaskolf 1 L</td><td>Fisherbrand</td><td>FB5011000</td><td>container voor het maken en autoclaven van MS-media</td></tr><tr><td>groeikamer</td><td>caron</td><td>7317-50-2</td><td>groeikamer gebruikt om planten te kweken</td></tr><tr><td>Murashige &amp; Skoog basaal medium met vitaminen &amp; 1,0 g/L MES (MS)</td><td>Phytotech labs</td><td>M5531&nbsp;</td><td>groeimedium voor Arabidopsis-zaailingen&nbsp;</td></tr><tr><td>kaliumhydroxide (KOH)</td><td>Phytotech labs</td><td>1310-58-3</td><td>maak als 1 M oplossing voor pH-aanpassing</td></tr><tr><td>spider lights</td><td>Mean Well Enterprises</td><td>XLG-100-H-AB</td><td>lichten gebruikt in de lichttest&nbsp;</td></tr><tr><td>Vierkante petrischaal met raster, steriel</td><td>Simport Scientific</td><td>D21016</td><td>gebruikt om MS-media voor Arabidopsis-zaailingen vast te houden</td></tr><tr><td>chirurgisch pleister</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td>tape gebruikt om platen te verzegelen</td></tr><tr><td>tween 20</td><td>biorad</td><td>&nbsp;9005-64-5</td><td>oppervlakteactieve stof gebruikt om zaadsterilisatie te ondersteunen</td></tr></tbody></table>

evaluatie van fotosynthetische efficiëntie in fotorespiratoire mutanten door chlorofylfluorescentieanalyse

Evaluation of Photosynthetic Efficiency in Photorespiratory Mutants by Chlorophyll Fluorescence Analysis

Fotosynthese en fotorespiratie vertegenwoordigen de grootste koolstoffluxen in het primaire metabolisme van planten en zijn noodzakelijk voor het overleven van planten. Veel van de enzymen en genen die belangrijk zijn voor fotosynthese en fotorespiratie zijn al tientallen jaren goed bestudeerd, maar sommige aspecten van deze biochemische routes en hun kruisverwijzing met verschillende subcellulaire processen zijn nog niet volledig begrepen. Veel van het werk dat de genen en eiwitten heeft geïdentificeerd die belangrijk zijn in het plantenmetabolisme, is uitgevoerd in sterk gecontroleerde omgevingen die mogelijk niet het beste weergeven hoe fotosynthese en fotorespiratie functioneren onder natuurlijke en landbouwomgevingen. Gezien het feit dat abiotische stress resulteert in verminderde fotosynthetische efficiëntie, is de ontwikkeling van een high-throughput scherm dat zowel abiotische stress als de impact ervan op fotosynthese kan monitoren noodzakelijk.
Daarom hebben we een relatief snelle methode ontwikkeld om te screenen op abiotische stress-geïnduceerde veranderingen in fotosynthetische efficiëntie die niet-gekarakteriseerde genen met rollen in fotorespiratie kunnen identificeren met behulp van chlorofylfluorescentieanalyse en lage CO2-screening . Dit artikel beschrijft een methode om veranderingen in fotosynthetische efficiëntie in overgedragen DNA (T-DNA) knock-out mutanten in Arabidopsis thaliana te bestuderen. Dezelfde methode kan worden gebruikt voor het screenen van door ethylmethaansulfonaat (EMS) geïnduceerde mutanten of suppressorscreening. Het gebruik van deze methode kan genkandidaten identificeren voor verder onderzoek in het primaire metabolisme van planten en abiotische stressreacties. Gegevens van deze methode kunnen inzicht geven in de genfunctie die mogelijk niet wordt herkend tot blootstelling aan verhoogde stressomgevingen.

De resultaten tonen plaatbeelden van ruwe en fluorescentiebeelden van omgevings- en CO2-screening van WT- en testmutanten. Elke plantlet wordt gelabeld op gebiedsnummer, met overeenkomstige fluorescentiemetingen gegeven als QY. De gegevens worden geëxporteerd als een tekstbestand en kunnen worden geopend in een spreadsheet voor analyse (zie Aanvullende tabel S1). Mutantenlijnen plgg1-1 en abcb26 werden geselecteerd om de positieve en negatieve identificatie van genen geassoci...

We beschrijven een benadering om veranderingen in fotosynthetische efficiëntie in planten te meten na behandeling met lage CO2 met behulp van chlorofylfluorescentie.

Evaluatie van fotosynthetische efficiëntie in fotorespiratoire mutanten door chlorofylfluorescentieanalyse

Photosynthesis and photorespiration represent the largest carbon fluxes in plant primary metabolism and are necessary for plant survival. Many of the ...

Het doel van deze methode is om mutanten in de fotorespiratoire route te identificeren met behulp van een lage CO2-screening. We presenteren een methode om mutanten te identificeren die de fotorespiratie verstoren na blootstelling aan lage CO2. Een voordeel van deze methode is dat het een high throughput screening is voor zaailingen die in een relatief korte tijd kan worden gedaan.De volgende secties geven details over zaadvoorbereiding en sterilisatie, plantengroei en lage CO2-behandeling, configureren van het fluorescentiebeeldvormingssysteem, meten kwantumopbrengst van behandelde monsters, representatieve resultaten en conclusies. Zaadbereiding en sterilisatie. Zaadbereiding bestaat uit zaadindrinking en zaadsterilisatie.Het is belangrijk op te merken dat al deze stappen worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap om steriele omstandigheden te behouden. Alle benodigde materialen, reagentia en groeimedium worden geautoclaveerd. De gebruikte zaadlijnen zijn plgg1-1, abcb26 en WT of wild type.Neem zaden in steriel water in een laminaire stromingskap en stratificeer vervolgens twee dagen lang bij vier graden Celsius in het donker. Bereid onder steriele omstandigheden 10 milliliter van 50% volume tot volume bleekoplossing en voeg ongeveer 20 microliter Tween 20 toe. Verwijder water uit ingebakken zaden, voeg vervolgens een milliliter bleekoplossing toe aan de microcentrifugebuis en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Verwijder de bleekoplossing met een pipet. Spoel de zaden in een milliliter steriel water om te resuspenderen. Verwijder het water zodra de zaden op de bodem zijn neergedaald.Resuspendeer zaden in steriele 0,1% agarose oplossing. Voor zaadplating, basale mediumplaten met 1% MS medium met vitamines en 1% agar voor de teelt van de testmutanten. Snijd een pipetpunt van 200 microliter met een scheermesje.Plaats met behulp van een pipet één zaadje in het midden van het aangewezen vierkante raster voor elke testmutant of genotype. Hier wordt een vierkante plaat met een raster van één bij één centimeter gebruikt. Dit helpt om een uniforme afstand tussen elke zaailing te houden en overlapping te voorkomen, wat later belangrijk zal zijn in de fluorescentiebeeldvorming en -analyse.Zodra de zaden zijn verguld, wikkelt u chirurgische tape rond het deksel om af te sluiten en plaatst u deze vervolgens in de groeikamer. Plantengroei en lage CO2-behandeling. Kweek planten zeven tot negen dagen bij 20 graden Celsius onder een lichtcyclus van acht uur van 120 micromol per vierkante meter per seconde en 16 uur duisternis bij 18 graden Celsius.Controleer planten op de zesde dag om te bepalen of ze groot genoeg zijn voor beeldvorming. Stel planten op de achtste dag na het plateren bloot aan een lage CO2. Plaats zuiveringsinstallaties in een afgesloten doos in de groeikamer met een lichtintensiteit van 200 micromol per vierkante meter per seconde gedurende 12 uur.De lage CO2-conditie werd geconstrueerd met behulp van een luchtdichte transparante container met 100 gram natronkalk op de bodem van de container. De container werd in dezelfde groeikamer geplaatst als de besturing. De controle-installaties blijven gedurende 12 uur onder de 120 micromol per vierkante meter per seconde in omgevings-CO2.Configureer het fluorescentiebeeldvormingssysteem. Plaats een testplaat gecentreerd onder de camera op een vaste afstand in het fluorescentiebeeldvormingssysteem. Navigeer in de instrumentsoftware naar het live-venster en vink het vakje Flitsen aan om niet-actinische meetflitsen in te schakelen.Klik op de zoom- en scherpstelgereedschappen totdat u een volledig en scherp beeld ziet. Stel de waarde van de EL-sluiter in op nul en pas de gevoeligheid aan om een fluorescerend signaal te krijgen in het bereik van 200 tot 500 digitale eenheden. Plaats een lichtmeter in dezelfde positie als waarmee de camera-instellingen worden aangepast.Vink in het livevenster het vakje Super aan om een verzadigingspuls te starten die 800 milliseconden duurt. Gebruik de schuifregelaar om het percentage relatief vermogen voor de Superpuls aan te passen totdat de lichtmeter 6.000 tot 8.000 micromol per vierkante meter per seconde leest. Meet de kwantumopbrengst van behandelde monsters.Direct na de behandeling, afdek platen met aluminiumfolie gedurende 15 minuten voor donkere aanpassing. Verwijder folie om de kwantumopbrengst van fotosysteem twee te meten met een pulsamplitude gemodificeerde fluorometer. Plaats vervolgens de zaailingplaat direct onder de camera en voer het kwantumopbrengstprotocol uit dat te vinden is in onze GitHub-repository.Download het Quantum Yield Protocol van GitHub. Gebruik een fluorometersoftware om het programmabestand te openen door op het mappictogram te klikken en naar de bestandslocatie te navigeren. Voer het quantum yield-protocol uit door op het rode bliksempictogram te klikken.Nadat het protocol is voltooid, navigeert u naar het venster voor de pre-analyse. Verdeel de plaat in afzonderlijke zaailingen door alle pixels voor elke zaailing op de plaatafbeelding te markeren. Klik op Achtergronduitsluiting om gemarkeerde achtergrondpixels te verwijderen, zodat alleen het zaailinggebied overblijft.Klik op analyseren om fluorescentiegegevens te genereren voor elke zaailing op de plaatafbeelding. Pas het fluorescentiewaardebereik handmatig aan om consistente minimum- en maximumwaarden tussen alle platen weer te geven. Klik op het tabblad Experiment op Exporteren en vervolgens op Numeriek.Klik op Numeriek gemiddelde om een tekstbestand te genereren met de kwantumopbrengst voor elke zaailing. Open het tekstbestand en de spreadsheet voor analyse. De spreadsheet bevat het gebiedsnummer, de grootte van de pixels, Fm, Ft, Fq en QY. Ten eerste moeten we het gebiedsnummer identificeren voor het overeenkomstige genotype, of het nu gaat om een wild type of een testmutant, Resultaten.Hier zijn de plaatfoto's van onbewerkte en fluorescentiebeelden van omgevings- en co2-lage screening van wilde typen en testmutanten. Elke plaat wordt gelabeld op oppervlaktenummer met overeenkomstige fluorescentiemetingen als kwantumopbrengst of QY. De gegevens worden geëxporteerd als een tekstbestand en kunnen worden geopend in een spreadsheet voor analyse. De donkere aangepaste Fv/Fm quantum yield efficiencies van wilde types en mutanten worden gevisualiseerd door box en whisker plots.Om het statistische verschil tussen wilde typen en testmutanten te testen, werd een paarsgewijze T-test gebruikt met een P-waarde van minder dan 0,05. Hier gebruiken we de fotorespiratoire mutantenlijn met verminderde kwantumopbrengst Fv/ Fm als testmutant om de efficiëntie van onze screeningsmethode te controleren. Onze resultaten tonen aan dat testmutanten een aanzienlijk lagere kwantumopbrengstefficiëntie hebben in vergelijking met de wilde typen.Dit geeft aan dat onze screeningsmethode in staat is om fotorespiratoire mutanten te identificeren met behulp van lage CO2-screening. Conclusies. Een belangrijk ding om te onthouden tijdens het gebruik van dit protocol is om ervoor te zorgen dat Arabidopsis-zaailingen groot genoeg zijn om fluorescentie te meten, maar niet zo groot dat de planten elkaar zouden overlappen tijdens beeldvorming. Het heeft de voorkeur om de zaailingen af te beelden als de eerste echte bladeren om te proberen de bladgrootte en bladhoeken uniform te houden.Dit protocol kan worden gebruikt als een high throughput screening voor zaailingen. Beeldvorming van elke plaat is relatief snel en heeft het potentieel om meer dan 1.000 zaailingen per dag te screenen. Chlorofylfluorescentieanalyse stelde ons in staat om fotorespiratoire mutanten te identificeren met behulp van een lage CO2-screening, wat belangrijk is voor het handhaven van de fotorespiratie-efficiëntie.Dit protocol is niet beperkt tot Arabidopsis en heeft het potentiële gebruik voor abiotische stressresponsexperimenten.

evaluation-photosynthetic-efficiency-photorespiratory-mutants

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de reconstituurtie van licht-oogstcomplexen in vitro. Deze integrale membraaneiwitten coördineren chlorofylen en carotenoiden en zijn verantwoordelijk voor het oogsten van licht in hogere planten en groene algen.

In Vitro Reconstructie van Licht-oogsten Complexen van planten en groene algen

Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de plant groei gedrag en vooral fenotypen op een reproduceerbare wijze. Variabele en op de dezelfde tijd stabiel lichtomstandigheden, tonen we hoe te verstrekken. Goede analyses, is afhankelijk van voldoende monster getallen en geldige statistische evaluaties.

Analyse van Arabidopsis thaliana groei gedrag in verschillende kwaliteiten van het licht

We beschrijven een nieuwe technische benadering voor het bestuderen van fotosynthetische responsen in hogere planten waarbij gelijktijdige metingen van chlorofyl een fluorescentie-en blad reflectie met behulp van een pam en een spectrale Radiometer voor de detectie van signalen van de zelfde blad gebied in Arabidopsis.

Evaluatie van fotosynthetisch gedrag door gelijktijdige metingen van blad reflectantie en Chlorofylfluorescentie analyses

Snelle herhalingssnelheid fluorometer (FRRf) is een nuttige methode voor het meten van fotosysteem II fotofysiologie en primaire productiviteit. Hier beschrijven we een protocol om PSII-fotofysiologie van epizoïsche alg, Colacium sp. op substraat zoöplankton te meten met behulp van cuvette-type FRRf.

Het meten van fotofysiologie van attached stage van Colacium sp. door een Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Het protocol introduceert een high-throughput methode voor het meten van de ontspanning van niet-fotochemische quenching door pulsamplitude gemoduleerde chlorofyl fluorometrie. De methode wordt toegepast op in het veld gekweekte Glycine max en kan worden aangepast aan andere soorten om te screenen op genetische diversiteit of broedpopulaties.

High-Throughput analyse van niet-fotochemische blussing in gewassen met behulp van pulsamplitude gemoduleerde chlorofylfluorometrie

De meeste zwemmende fotoautotrofe organismen vertonen foto-geïnduceerde gedragsveranderingen (fotogedrag). Het huidige protocol observeert het genoemde fotogedrag in het modelorganisme Chlamydomonas reinhardtii.

Observatie van Photobehavior in Chlamydomonas reinhardtii

Het huidige protocol beschrijft stapsgewijze autofluorescentiebeeldvorming en evaluatie van fycobiliproteïneveranderingen in rode algen op basis van spectrale analyse. Dit is een labelvrije en niet-destructieve methode om cellulaire aanpassing aan extreme habitats te evalueren, wanneer alleen schaars materiaal beschikbaar is en cellen langzaam of helemaal niet groeien onder laboratoriumomstandigheden.

Autofluorescentie beeldvorming om de fysiologie van rode algen te evalueren

Hier beschrijven we een geavanceerd hulpmiddel dat is ontworpen voor het monitoren van de biosynthese van chlorofyl tijdens de vroege stadia van de de-etiolatie van Arabidopsis-zaailingen . De nieuwe methodologie biedt niet-invasieve real-time chlorofylfluorescentiebeeldvorming met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Niet-invasieve test voor bepaling van de kinetiek van chlorofylbiosynthese tijdens vroege stadia van de-etiolatie van Arabidopsis

Dit manuscript beschrijft een niet-destructieve, hoogdoorvoerbenadering voor autonome veldmetingen van fotosysteem II kwantumefficiëntie, spectrale reflectie en plantenarchitectuur, waardoor grootschalige canopy-fotosynthese fenotypering mogelijk is in agronomische en veredelingsveldproeven.

Hoogwaardige screening in het veld van fotosynthetische efficiëntie in gewasplanten met behulp van een autonome robot

Met behulp van hoogfrequente elektrische stimulatie, beslag-achtige activiteit kan worden geïnduceerd...

Neurocircuit Testen voor epileptische aanvallen mutanten van Drosophila</em

Leer hoe je fotosynthetische efficiëntie evalueert in fotorespiratoire mutanten met behulp van chlorofylfluorescentieanalyse. Deze methode maakt snelle screening van Arabidopsis-zaaillen mogelijk.

Evaluatie van fotosynthetische efficiëntie in fotorespiratoire mutanten door chlorofylfluorescentieanalyse

Meer video's verkennen