Analyse van astrocytengebiedvolume en tegels in dikke vrij zwevende weefselsecties

Begrijpen hoe astrocyten zich ontwikkelen en hun complexe morfologie vaststellen, is essentieel om te begrijpen hoe de hersenen zich ontwikkelen en functioneren. Dit protocol beschrijft hoe de belangrijkste aspecten van de morfologie van astrocyten in hersenweefsel kunnen worden geanalyseerd. Dit protocol maakt gebruik van een aangepaste code om het volume van astrocyten in dikke weefselsecties te meten.

Deze strategie kan ook worden toegepast om de hoeveelheid territoriumoverlapping tussen naburige astrocyten te meten. Door dit protocol te combineren met genetische manipulatie van astrocyten, kunnen onderzoekers direct de rol van specifieke eiwitten en routes in astrocytenontwikkeling en astrocyten-astrocyteninteractie onderzoeken Om te beginnen, bereid een nieuwe oplossing van TBST door 1 milliliter van 10% Triton X toe te voegen aan een buis van 50 milliliter en de buis te vullen tot 50 milliliter met TBS. Bereid 2 milliliter blokkerings- en antilichaamoplossingen voor elk brein voor door geitenserum en TBST te combineren in een Buis van 15 milliliter.

Label vervolgens een plaat met 24 putten om verschillende monsters in verschillende rijen in verschillende oplossingen in verschillende kolommen te plaatsen, voeg vervolgens een milliliter TBST toe aan de eerste drie kolommen met het label was 1, was 2 en was 3 en voeg 1 milliliter blokkerende oplossing toe aan de vierde kolom. Bereid een glazen plectrum voor door het uiteinde van een 5,75-inch Pasteur-pipet in een kleine haak te smelten met behulp van een Bunsen-brander, breng vervolgens weefselsecties over van de 12-wellsplaat in de was 1 kolom van de 24-well plaat met behulp van de pick, was de secties vervolgens gedurende 10 minuten elk in wash 1, 2, en 3 putten door de glazen pikhouweel te gebruiken om de secties van de ene put naar de volgende over te brengen, gevolgd door het gedurende een uur incuberen van de secties in de blokkerende oplossing. Bereid q milliliter primaire antilichaamoplossing door het antilichaam aan de antilichaamoplossing toe te voegen, vervolgens de vortex kort en centrifugeer gedurende 5 minuten bij meer dan of gelijk aan 4.000 keer g bij 4 graden Celsius.

Incubeer vervolgens de secties in primair antilichaam gedurende 2 tot 3 nachten bij 4 graden Celsius tijdens het schudden. Na primaire antilichaamincubatie, aspirateer de dag-1 TBST uit de wasputten, voeg dan 1 milliliter nieuwe TBST toe aan elke wasput en verplaats de secties in de eerste wasput. Vervolgens incubeer secties in secundair antilichaam gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.

Na secundaire antilichaamincubatie, aspirateer de dag-2 TBST uit de wasputten, voeg vervolgens 1 milliliter nieuwe TBST toe aan elke wasput en verplaats de secties in de eerste wasput. Haal tijdens de laatste wasbeurt de montagemedia uit 4 graden Celsius en laat het opwarmen tot kamertemperatuur, bereid vervolgens een 2-op-1 mengsel van TBS en gedeïoniseerd water en voeg het toe aan een petrischaal. Bereid vervolgens een microscoopglaasje voor door 800 microliter 2-op-1 mengsel van TBS en gedeïoniseerd water aan het oppervlak toe te voegen.

Breng de secties van de was 3-put over naar de petrischaal en breng vervolgens met een fijne kwast de secties één voor één over van de petrischaal in de vloeistof op de dia. Rangschik vervolgens de secties zorgvuldig zodat ze plat op de dia liggen met behulp van de kwast. Verwijder voorzichtig overtollige vloeistof van de dia met een P-1000 pipet, gevolgd door vacuümaspiratie.

Zodra alle overtollige vloeistof uit de dia is verwijderd, gebruikt u een transferpipet om onmiddellijk 1 druppel montagemedia aan elke sectie toe te voegen en legt u voorzichtig een afdeksel over de schuif. Laat montagemedia zich een paar minuten verspreiden en verwijder vervolgens overtollige bevestigingsmedia die onder de afdeksel vandaan komen door vacuümaspiratie. Sluit daarna alle vier de randen van de afdekslip af met heldere nagellak.

Laat dia's 30 minuten drogen bij kamertemperatuur en bewaar ze dan plat bij 4 graden Celsius. Lokaliseer met behulp van een 10x-objectief individuele cellen voor beeldvorming en noteer het specifieke hersengebied of subregio dat relevant is voor het experiment, en bepaal vervolgens met behulp van de focusknop of de hele astrocyt zich in de sectie bevindt. Schakel daarna over naar een olieobjectief met een hogere vergroting en breng de cel in beeld.

Terwijl u door het oogstuk kijkt, gebruikt u de focusknop om van de bovenkant naar de onderkant van de cel te gaan en inspecteert u vervolgens visueel de cel om ervoor te zorgen dat de hele cel zich in de sectie bevindt. Gebruik de acquisitieparameters van de confocale microscopen en pas de acquisitieparameters aan om een geschikte signaal-ruisverhouding en detailniveau te verkrijgen, gebruik vervolgens 2x zoom voor een 40x-objectief en geen zoom als je een 60x- of een 63x-objectief gebruikt. Stel de boven- en ondergrenzen van de Z-stack in met een stapgrootte van 0,5 micrometer, zodat de hele astrocyt wordt vastgelegd met de eerste en laatste beelden zonder fluorescerende labeling van de cel.

Voordat u met de analyse begint, installeert u het convex hull-extensiebestand, XtspotsConvexHull, door het bestand in de rtmatlab-submap van de XT-map te plakken. Gebruik de Imaris File Converter om afbeeldingen naar IMS-indeling te converteren. Open vervolgens een afbeeldingsbestand in de beeldanalysesoftware en selecteer de knop 3D-weergave om de afbeelding in de 3D-modus te bekijken, zodat de cel voldoet aan de opnamecriteria.

Als u een oppervlak wilt maken, klikt u op het blauwe pictogram Nieuwe oppervlakken toevoegen en maakt u vervolgens een interessegebied rond de cel door dimensies in te voeren in de vakken onder de grootte van het gereedschap voor het maken van oppervlakken of door de randen van het gele vak te slepen. Pas vervolgens de absolute drempelintensiteit aan door de gele balk of invoerwaarden in het vak te slepen, zodat het grijze oppervlak zoveel mogelijk van het celsignaal vult zonder de grens van de cel te overschrijden. Klik daarna op de groene pijl om het genereren van het oppervlak te voltooien.

Inspecteer het nieuw gegenereerde oppervlak zorgvuldig en verwijder alle oppervlaktestukken die geen deel uitmaken van de cel door ze te selecteren en klik vervolgens op het gereedschap Potlood bewerken, gevolgd door de optie Verwijderen. Om de resterende oppervlaktestukken te verenigen, klikt u op het pictogram Trechterfilter om alles te selecteren, klikt u vervolgens op het pictogram Potlood bewerken en selecteert u de optie Verenigen. Klik op het oranje pictogram Nieuwe vlekken toevoegen en selecteer het juiste bronkanaal in de vervolgkeuzelijst en voer vervolgens een geschatte XY-diameterwaarde van 0,400 micrometer in het vak in.

Klik vervolgens op de groene pijl om het maken van de vlekken te voltooien en selecteer vervolgens de vlekken opnieuw. Klik op het pictogram Filter en selecteer Kortste afstand tot oppervlakken Oppervlakken X, waarbij oppervlakken X het oppervlak is dat wordt geanalyseerd in de vervolgkeuzelijst, zodat zowel de aan/uit-knoppen van de onderdrempel als de bovenste drempel groen zijn. Voer vervolgens een minimale afstand van min 1,0 micrometer in het onderste drempelvak en een maximale afstand van 0,1 micrometer in het bovenste drempelvak in en klik vervolgens op de knop Sectie dupliceren naar nieuwe vlekken, zodat de nieuw gemaakte vlekken zijn geselecteerd in het linkerbovenpaneel van het softwarevenster.

Klik daarna op het Gear Tools-pictogram en klik vervolgens slechts één keer op de Convex Hull-plug-in en wacht tot het MATLAB-venster verschijnt en vervolgens verdwijnt, wat resulteert in een solide romp in de 3D-weergave. Zorg er in het linkerbovenpaneel voor dat Convex Hull of Spots X Selection, Shortest Distance where Spots X Selection is the Newly Created Spots is geselecteerd en klik vervolgens op de romp om deze te selecteren. Klik vervolgens op het pictogram Grafiekstatistieken.

Zorg ervoor dat op het tabblad Selectie is geselecteerd in de bovenste vervolgkeuzelijst en kies vervolgens Volume in de onderste vervolgkeuzelijst, noteer vervolgens het volume van de romp en sla het bestand op en ga verder met de volgende afbeelding. Het territoriumvolume van astrocyten werd gemeten in astrocyten die een op membraan gericht rood fluorescerend eiwit tot expressie brachten. Knockdown van het met astrocyten verrijkte celadhesiemolecuul, hepaCAM, vermindert het volume van het astrocytengebied aanzienlijk.

Mozaïekanalyse met dubbele markers werd gebruikt om muizen te genereren waarbij wild type astrocyten een rood fluorescerend eiwit tot expressie brengen en hepaCam knock-out astrocyten een groen fluorescerend eiwit tot expressie brengen. Het percentage territoriumoverlapping tussen naburige rode en groene fluorescerende eiwitastrocytenparen werd berekend. De muizen met genetische modificatie van hepaCAM en groene astrocyten vertoonden een significant verhoogd percentage van het territoriumoverlappingsvolume met hun rode wilde buren in vergelijking met astrocytenparen met alleen wildtype.

Dit resultaat toont aan dat hepaCAM nodig is voor een normaal astrocytengebiedsvolume en astrocytentetettet. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de cel voldoet aan de inclusiecriteria. Een onvolledige cel heeft een kleiner territoriumvolume en kan uw algehele resultaten en conclusies beïnvloeden.