Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

PIB-MS is een nieuwe techniek die wordt gebruikt om te verrijken voor endogene fosforproteïnefosfatasen en ze interageren eiwitten uit cellen en weefsels. Het gaat om de identificatie en kwantificering van deze eiwitten met behulp van op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Deze techniek vereist niet de exogene expressie van gelabelde versies van fosforproteïnefosfatasen die de eiwitactiviteit of lokalisatie kunnen veranderen.

Ook maakt het geen gebruik van antilichamen die mogelijk niet-specifiek zijn of niet in staat zijn om onderscheid te maken tussen specifieke isovormen. Deze methode voor het onderzoeken van de PPPM kan worden geschaald voor gebruik op alles, van cellen tot klinische monsters. Verzamel om te beginnen celpellets door centrifugatie op 277 keer g gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder media en was de cellen met vijf milliliter PBS. Bereid de lysisbuffer voor zoals beschreven in het tekstprotocol en houd deze op ijs. Voeg een milliliter gekoelde lysisbuffer toe aan de monsters, homogeniseer vervolgens de monsters door sonificatie en houd de cellen op ijs tussen pulsen.

Breng de lysaten over in verse buisjes van 1,5 milliliter. Centrifugeer het gesonificeerde monster op 21, 130 maal g gedurende 15 minuten bij 4 graden Celsius. Gebruik een aliquot van het lysaat om de totale eiwitconcentratie te kwantificeren met behulp van een bicinchonininezuurtest.

Deze stap is essentieel om een gelijke eiwitconcentratie in elk monster te garanderen. Voor een fosfoproteïnefosfataseremmercontrole bereidt u twee aliquots van gelijke eiwitconcentratie voor elk monster. Lysisbuffer kan worden gebruikt om de monsters te verdunnen, zodat elke buis een gelijke eiwitconcentratie heeft.

Voeg één micromolair vrij microcystine-LR toe aan het ene aliquot en een gelijk volume DMSO aan het andere. Vortex de monsters en incubeer ze op ijs gedurende 15 minuten. De bereiding van de fosfataseremmerparels moet van tevoren of tijdens de incubatiestappen worden uitgevoerd die in de monstervoorbereidingssectie worden beschreven.

Gebruik 10 microliter vaste fosfataseremmers, of PIB-hars, voor één milligram eiwit en voeg ze toe aan een buis van 1,5 milliliter. Was de PIBs driemaal met 0,5 milliliter lysisbuffer door vortexing gevolgd door centrifugatie bij 376 maal g gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Voeg een geschikte hoeveelheid lysisbuffer toe aan de gewassen PIB's om een PIB-bufferoplossing van 50% per volume te maken.

Meng door de pipetpunt en de slurry voorzichtig te pipetteren en te draaien om de PIB's te resuspenderen. Breng 20 microliter van de drijfmest over naar een buis van 1,5 milliliter met 0,5 milliliter lysisbuffer. Draai de buizen op 376 keer g gedurende 30 seconden.

Elke buis bevat gelijke volumes PIBs erin. Gooi het supernatant weg terwijl alleen de vaste hars en maximaal 50 microliter lysisbuffer in elke buis blijven. Breng de lysaten over in de correct gelabelde buizen die PIB's bevatten.

Incubeer het lysaat met de PIBs gedurende een uur bij 4 graden Celsius met rotatie bij 8 rpm. Na incubatie met het lysaat, centrifugeer de PIBs op 376 keer g gedurende 30 seconden bij 4 graden Celsius en verwijder het supernatant. Was de kralen door 0,5 milliliter lysisbuffer toe te voegen en de buisjes om te keren Verzamel de kralen door centrifugeren en verwijder het supernatant.

Herhaal deze stap voor een totaal van drie wasbeurten. Verwijder na de laatste wasbeurt de lysisbuffer zoveel mogelijk zonder de PIB's te pipetteren. Bereid de elutiebuffer voor die 2% SDS bevat en voeg de elutiebuffer vier tot vijf keer het volume PIB's toe.

Incubeer een uur bij 65 graden Celsius om de fosfoproteïnefosfatasen uit de kralen te elueren. Centrifugeer de buizen op 376 maal g gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Verzamel het eluaat in een aparte buis en ga verder met massaspectrometrieanalyses of western blotting.

Om de PIB's te regenereren, incubeer ze in 2% SDS-oplossing met rotatie bij 8 rpm gedurende een uur bij kamertemperatuur. Was de kralen drie tot vijf keer in 25 millimol Tris-HCl pH 7,5 met rotatie gedurende 30 minuten per wasbeurt. Bewaar PIBs in 25 millimolar Tris HCL pH 7,5 met natriumazide.

Voor massaspectrometrie-analyse variëren methoden voor gegevensfiltering en -analyse en kunnen deze worden uitgevoerd door de onderzoeker of een kernfaciliteit. Nadat u de onbewerkte gegevens hebt vergeleken met een soortspecifieke proteoomdatabase, filtert u de zoekresultaten en exporteert u deze als een Microsoft Excel-werkblad. Analyseer de gegevens in drievoud.

Voor labelvrije kwantificering gebruikt u MS1-piekgebiedmetingen om de gegevens te kwantificeren. Om PPP-subeenheden en hun interactoren de novo te identificeren, vergelijkt u biologische triplicaten van microcystine-LR-geremde en DMSO-behandelde monsters. Filter de gegevens zodat alleen eiwitten met een totaal aantal peptiden van meer dan één op ten minste twee van de drie dmso-controlebehandelde monsters aanwezig zijn.

Om eiwitten uit te filteren die niet-specifiek aan de hars binden, verwijdert u de eiwitten waarin het totale aantal peptiden in de met microcystine-LR behandelde toestand hoger is dan dat voor een PPP-katalytische subeenheid. Sluit veel voorkomende verontreinigingen zoals keratine, collageen, ribosomale eiwitten en heterogene nucleaire ribonucleoproteïnen uit van de analyse. Een CSV-bestand is essentieel voor het importeren van de gegevens in Perseus.

Importeer gefilterde gegevens in Perseus door te klikken op Algemene matrixupload in het gedeelte Laden. Transformeer de gegevens door naar Basistransformatie te gaan, de gegevens te selecteren en de transformatiefunctie op te geven als logboekbasis 2 van x. Reken ontbrekende waarden uit een normale verdeling toe door naar Imputatie te gaan, Ontbrekende waarden uit normale verdeling vervangen, de gegevens te selecteren en de breedte en het terugschakelen voor de berekening op te geven.

Voer kwantielnormalisatie uit door naar Normaliseren, Kwantielnormalisatie te gaan. Annoteer de gegevens door naar Annot-rijen, Categorische annotatierijen te gaan. Voer de T-test van de student uit door naar Tests, Twee-steekproeftests te gaan, de groepen te selecteren, de uit te voeren test en de methode voor correctie van meerdere hypothesetests zoals gebruikt voor afkapping.

Deze functie berekent ook de log 2-verhoudingen. Fosfoproteïnefosfaotaten en hun interactoren werden geïdentificeerd in de HeLa-cellen met behulp van een PIB pull-down experiment, gevolgd door labelvrije kwantificering van eiwitrijkdom in met DMSO behandelde en microcystine-LR-behandelde monsters. Vulkaanplot van massaspectrometrie-analyse identificeerde specifieke PIB-bindmiddelen weergegeven in rode, katalytische subeenheden in blauw en nieuwe kandidaat PPP-subeenheden, of interagerende eiwitten, in wit.

Niet-specifieke bindmiddelen werden grijs weergegeven. Scatter plot van log2 gebied van de DMSO-behandelde HeLa cel lysaat toonde aan dat de abundanties sterk gecorreleerd waren, wat wijst op reproduceerbaarheid van de gegevens. Netwerkanalyse van alle fosforproteïnefosfatase-subeenheden en interagerende eiwitten toonde aan dat deze eiwitten specifieke interactoren waren in de PIB-pull-down.

Globale proteomics-analyses kunnen worden uitgevoerd en de resultaten kunnen worden vergeleken met de PIB-analyse om te bepalen of de PPPome-samenstelling wordt aangedreven door PPP-abundantie of gereguleerd door posttranslationele mechanismen. PIB-MS is een breed toepasbaar hulpmiddel dat ons in staat heeft gesteld om verschillen in PPP-expressiepatronen onder verschillende omstandigheden te identificeren, zoals interfase versus mitotische monsters of verschillen tussen kankercellijnen.