Name: Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Leer PIB-MS om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren met massaspectrometrie. Deze methode verrijkt endogene eiwitten zonder exogene expressie of antilichamen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.N.K. erkent de steun van NIH R33 CA225458 en R35 GM119455. Wij danken de laboratoria van Kettenbach en Gerber voor hun nuttige discussie.

<ol><li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li>
<li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Ser%2FThr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li>
<li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+serine%2Fthreonine+phosphatases%3A+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li>
<li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A%3A+A+highly+regulated+family+of+serine%2Fthreonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li>
<li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+promiscuity+to+precision%3A+protein+phosphatases+get+a+makeover%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li>
<li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extended+PP1+toolkit%3A+designed+to+create+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li>
<li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D-networking+by+mitotic+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li>
<li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PP1+binding+code%3A+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li>
<li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li>
<li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li>
<li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li>
<li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li>
<li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755(2013).</li>
<li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li>
<li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li>
<li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+ser%2Fthr+protein+phosphatases%3A+specificity%2C+use+and+common+forms+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li>
<li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li>
<li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li>
<li>Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-pot%2C+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMT+labeling+for+the+masses%3A+A+robust+and+cost-efficient%2C+in-solution+labeling+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li>
<li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li>
<li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet%3A+an+open-source+MS%2FMS+sequence+database+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen en geen belangenconflicten.

PIB-MS is een chemische proteomics-benadering die wordt gebruikt om het PPPome kwantitatief te profileren uit verschillende monsterbronnen in één analyse. Er is veel werk verricht met behulp van kinaseremmerkralen om het kinoom te bestuderen en hoe het verandert in kanker en andere ziektetoestanden 10,11,12,13. Toch blijft de studie van de PPPome achter. We verwachten dat deze aanpak in staat i...

Eiwitfosforylering regelt de meeste cellulaire processen, inclusief maar niet beperkt tot de reactie op DNA-schade, groeifactorsignalering en de passage door mitose 1,2,3. In zoogdiercellen worden de meeste eiwitten op een bepaald moment gefosforyleerd op een of meer serine-, threonine- of tyrosineresiduen, waarbij fosfostropenen en fosfoothreonines ongeveer 98% van alle fosforyleringsplaatsen uitmaken 2,3. Hoewel kinasen uitgebreid zijn bestudeerd in cellulaire signalering, is de rol van PPP's in de regulatie van dynamische cellulaire processen nog steeds in opkomst.
Fosforyleringsdynamiek wordt gecontroleerd door het dynamische samenspel tussen kinasen en fosfatasen. In zoogdiercellen zijn er meer dan 400 eiwitkinasen die serine / threoninefosforylering katalyseren. Meer dan 90% van deze sites wordt gedefosforyleerd door fosfoproteïnefosfatasen (PPP's), een kleine familie van enzymen die bestaat uit PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT en PPZ 2,3. PP1 en PP2A zijn verantwoordelijk voor de meerderheid van fosfosforrine en fosfotheonine defosforylering in een cel 2,3,4. Het opmerkelijke verschil in aantal tussen kinasen en fosfatasen en het gebrek aan specificiteit van PPP katalytische subeenheden in vitro leidden tot de overtuiging dat kinasen de belangrijkste determinant zijn van fosforylering 2,3. Meerdere studies hebben echter aangetoond dat fosfatasen substraatspecificiteit vaststellen door de vorming van multimere holo-enzymen 5,6,7,8,9. PP1 is bijvoorbeeld een heterodimeer dat bestaat uit een katalytische subeenheid en op een gegeven moment een van de meer dan 150 regulerende subeenheden 6,7,8. Omgekeerd is PP2A een heterotrimeer dat wordt gevormd uit een steiger (A), een regulerende (B) en een katalytische (C) subeenheid 2,3,9. Er zijn vier verschillende families van PP2A regulerende subeenheden (B55, B56, PR72 en striatine), elk met meerdere genen, splicevarianten en lokalisatiepatronen 2,3,9. Het multimere karakter van PPP's vult de leemte in het aantal kinasen en PPP-katalytische subeenheden. Het creëert echter analytische uitdagingen voor het bestuderen van PPP-signalering. Om PPP-signalering uitgebreid te analyseren, is het van cruciaal belang om de verschillende holo-enzymen in een cel of weefsel te onderzoeken. Er is grote vooruitgang geboekt bij het bestuderen van het menselijke kinoom door het gebruik van kinaseremmerparels, multiplexremmerparels of kinobeads genoemd, een chemische proteomische strategie waarbij kinaseremmers worden geïmmobiliseerd op kralen en massaspectrometrie wordt gebruikt om verrijkte kinasen en hun interactoren te identificeren 10,11,12,13.
We hebben een vergelijkbare aanpak vastgesteld om PPP-biologie te bestuderen. Deze techniek omvat affiniteitsvangst van PPP-katalytische subeenheden met behulp van kralen met een geïmmobiliseerde, niet-selectieve PPP-remmer genaamd microcystine-LR (MCLR) genaamd fosfataseremmerparels (PIBs)14,15. In tegenstelling tot andere methoden die de endogene tagging of expressie van exogene PPP-subeenheden vereisen die de eiwitactiviteit of lokalisatie kunnen veranderen, maakt PIB-MS de verrijking mogelijk van endogene PPP-katalytische subeenheden, hun bijbehorende regulerende en steigerende subeenheden en interagerende eiwitten (het PPPome genoemd) uit cellen en weefsels op een bepaald tijdstip of onder specifieke behandelingsomstandigheden. MCLR remt PP1, PP2A, PP4-6, PPT en PPZ bij nanomolaire concentraties, waardoor PIB's zeer effectief zijn in het verrijken voor de PPPome16. Deze methode kan worden geschaald voor gebruik op elk uitgangsmateriaal, van cellen tot klinische monsters. Hier beschrijven we in detail het gebruik van PIB's en massaspectrometrie (PIB-MS) om het endogene PPPome en de modificatietoestanden efficiënt vast te leggen, te identificeren en te kwantificeren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> Figuur 1: Visuele samenvatting van het PIB-MS protocol. In een PIB-MS-experiment kunnen monsters worden verkregen in verschillende vormen, van cellen tot tumoren. Het monster wordt verzameld, gelyseerd en gehomogeniseerd voorafgaand aan PPP-verrijking. Ter verrijking voor PPP's wordt het lysaat geïncubeerd met PIB's met of zonder PPP-remmer, zoals MCLR. De PIB's worden vervolgens gewassen en PPP's worden geëlueerd in denatureringsomstandigheden. De monsters worden voorbereid voor massaspectrometrie-analyse door de verwijdering van detergentia door sp3-eiwitverrijking, tryptische vertering en ontzouting. Monsters kunnen dan optioneel TMT-gelabeld worden voorafgaand aan massaspectrometrie analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
PIB-MS omvat lysis en klaring van cellen of weefsels, incubatie van het lysaat met PIBs, elutie en analyse van het eluaat via western blotting of op massaspectrometrie gebaseerde benaderingen (figuur 1). De toevoeging van vrije MCLR kan worden gebruikt als een controle om specifieke PIB-bindmiddelen te onderscheiden van niet-specifieke interactoren. Voor de meeste toepassingen kan een labelvrije aanpak worden gebruikt om eiwitten in eluaten direct te identificeren. In gevallen waarin een grotere precisie in kwantificering of de identificatie van soorten met een lage abundantie nodig is, kan verdere verwerking met tandem mass-tag (TMT) -etikettering worden gebruikt om de dekking te vergroten en de input te verminderen.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Honeywell</td><td>AH015-4</td><td>VOORZORG: ACN is ontvlambaar en giftig; draag handschoenen en werk in een chemisch afzuigkap.</td></tr><tr><td>Anhydrous Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-100ML</td><td>VOORZORG: ACN is ontvlambaar en giftig; draag handschoenen en werk in een chemisch afzuigkap.</td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>model no. 5424</td><td></td></tr><tr><td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td><td>Acros Organics</td><td>410991000</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>model no. 5810 R 15 amp version</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Dounce tissue grinder</td><td>Fisherbrand Pellet Pestles</td><td>12-141-363</td><td></td></tr><tr><td>Empore solid phase extraction disk, C18</td><td>CDS Analytical</td><td>76333-132</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>KRITIEK: Andere buizen kunnen polymeer in het monster lekken en de analyse vervuilen.</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>KRITIEK: Andere buizen kunnen polymeer in het monster lekken en de analyse vervuilen.</td></tr><tr><td>Extraction plate manifold</td><td>Waters</td><td>WAT097944</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes, 50 mL</td><td>VWR</td><td>21008</td><td></td></tr><tr><td>Generic blunt end needle and plunger</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generic magnetic separation rack</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen chloride (HCl)</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH3028</td><td>VOORZORG: HCl is corrosief; draag handschoenen en werk in een chemisch afzuigkap.</td></tr><tr><td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td></td></tr><tr><td>Incubator, 65 &deg;C</td><td>VWR</td><td>model no. 1380FM</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>Methanol for HPLC (MeOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-4L-R</td><td>VOORZORG: MeOH is ontvlambaar en giftig; draag handschoenen en werk in een chemisch afzuigkap.</td></tr><tr><td>Microcystin LR (MCLR)</td><td>Cayman Chemical</td><td>10007188</td><td>VOORZORG: MCLR is giftig; draag handschoenen bij het hanteren en vermijd contact met de huid.</td></tr><tr><td>PBS, 1&times; without calcium and magnesium, pH 7.4 &plusmn; 0.1</td><td>Corning</td><td>&nbsp;21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td><td>Fisher Scientific</td><td>M1095310001</td><td></td></tr><tr><td>PIBs</td><td></td><td></td><td>Zie Moorhead et al., 2007 voor protocol voor de generatie van PIBs.</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips, 10 &mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>22491504</td><td>KRITIEK: Andere tips kunnen polymeer in monsters lekken en de analyse vervuilen.</td></tr><tr><td>Pipette tips, 1000 &mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>22491555</td><td>KRITIEK: Andere tips kunnen polymeer in monsters lekken en de analyse vervuilen.</td></tr><tr><td>Pipette tips, 200 &mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>22491539</td><td>KRITIEK: Andere tips kunnen polymeer in monsters lekken en de analyse vervuilen.</td></tr><tr><td>plastic syringe, 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail III</td><td>Research Products International</td><td>P50700-1</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated benchtop centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>model no. 5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-687-12Q</td><td>8 rpm rotatie</td></tr><tr><td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td><td>Waters</td><td>WAT058957</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1311-1</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing grade modified trypsin</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>EMD Chemicals</td><td>SX0299-1</td><td>VOORZORG: Sodium azide is explosief en giftig; draag handschoenen, werk in een chemisch afzuigkap en vermijd contact met metalen.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td><td></td><td>model no. SFX 250</td><td></td></tr><tr><td>SPE C18 desalting plate</td><td>Waters</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td><td>Cytiva</td><td>6.51521E+13</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>model no. 5350</td><td></td></tr><tr><td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &times; 0.8 mg per tag</td><td>ThermoFisher</td><td>A37725</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Honeywell</td><td>T6508-25ML</td><td>VOORZORG: TFA is corrosief en irriteert de huid bij contact. Draag handschoenen en oogbescherming en werk in een chemisch afzuigkap.</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td><td>Thermo Scientific</td><td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water LC-MS</td><td>Honeywell</td><td>LC365-4</td><td></td></tr></tbody></table>

een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

De meeste cellulaire processen worden gereguleerd door dynamische eiwitfosforylering. Meer dan driekwart van de eiwitten is gefosforyleerd en fosfoproteïnefosfatasen (PPP's) coördineren meer dan 90% van alle cellulaire serine / threonine-defosforylering. Deregulering van eiwitfosforylering is betrokken bij de pathofysiologie van verschillende ziekten, waaronder kanker en neurodegeneratie. Ondanks hun wijdverspreide activiteit zijn de moleculaire mechanismen die PPP's beheersen en die gecontroleerd door PPP's slecht gekarakteriseerd. Hier wordt een proteomische benadering beschreven die fosfataseremmerparels en massaspectrometrie (PIB-MS) wordt genoemd om PPP's, hun posttranslationele modificaties en hun interactoren in slechts 12 uur te identificeren en te kwantificeren met behulp van een cellijn of weefsel. PIB-MS maakt gebruik van een niet-selectieve PPP-remmer, microcystine-LR (MCLR), geïmmobiliseerd op sepharose-kralen om endogene PPP's en hun bijbehorende eiwitten te vangen en te verrijken (het PPPome genoemd). Deze methode vereist geen exogene expressie van gelabelde versies van PPP's of het gebruik van specifieke antilichamen. PIB-MS biedt een innovatieve manier om de evolutionair geconserveerde PPP's te bestuderen en ons huidige begrip van defosforyleringssignalering uit te breiden.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> Figuur 2: Identificatie van specifieke PIBs-bindmiddelen. (A) Een verscheidenheid aan weefseltypen of cellen kan worden geanalyseerd via PIB-MS. HeLa-cellen in biologisch triplicaat werden behandeld met DMSO of de PPP-remmer MCLR, geïncubeerd met PIB's, en geanalyseerd via LC-MS / MS. (B) Vulka...

Hier presenteren we een protocol voor de verrijking van endogene fosfoproteïnefosfatasen en hun interagerende eiwitten uit cellen en weefsels en hun identificatie en kwantificering door op massaspectrometrie gebaseerde proteomica.

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS is een nieuwe techniek die wordt gebruikt om te verrijken voor endogene fosforproteïnefosfatasen en ze interageren eiwitten uit cellen en weefsels. Het gaat om de identificatie en kwantificering van deze eiwitten met behulp van op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Deze techniek vereist niet de exogene expressie van gelabelde versies van fosforproteïnefosfatasen die de eiwitactiviteit of lokalisatie kunnen veranderen.Ook maakt het geen gebruik van antilichamen die mogelijk niet-specifiek zijn of niet in staat zijn om onderscheid te maken tussen specifieke isovormen. Deze methode voor het onderzoeken van de PPPM kan worden geschaald voor gebruik op alles, van cellen tot klinische monsters. Verzamel om te beginnen celpellets door centrifugatie op 277 keer g gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.Verwijder media en was de cellen met vijf milliliter PBS. Bereid de lysisbuffer voor zoals beschreven in het tekstprotocol en houd deze op ijs. Voeg een milliliter gekoelde lysisbuffer toe aan de monsters, homogeniseer vervolgens de monsters door sonificatie en houd de cellen op ijs tussen pulsen.Breng de lysaten over in verse buisjes van 1,5 milliliter. Centrifugeer het gesonificeerde monster op 21, 130 maal g gedurende 15 minuten bij 4 graden Celsius. Gebruik een aliquot van het lysaat om de totale eiwitconcentratie te kwantificeren met behulp van een bicinchonininezuurtest.Deze stap is essentieel om een gelijke eiwitconcentratie in elk monster te garanderen. Voor een fosfoproteïnefosfataseremmercontrole bereidt u twee aliquots van gelijke eiwitconcentratie voor elk monster. Lysisbuffer kan worden gebruikt om de monsters te verdunnen, zodat elke buis een gelijke eiwitconcentratie heeft.Voeg één micromolair vrij microcystine-LR toe aan het ene aliquot en een gelijk volume DMSO aan het andere. Vortex de monsters en incubeer ze op ijs gedurende 15 minuten. De bereiding van de fosfataseremmerparels moet van tevoren of tijdens de incubatiestappen worden uitgevoerd die in de monstervoorbereidingssectie worden beschreven.Gebruik 10 microliter vaste fosfataseremmers, of PIB-hars, voor één milligram eiwit en voeg ze toe aan een buis van 1,5 milliliter. Was de PIBs driemaal met 0,5 milliliter lysisbuffer door vortexing gevolgd door centrifugatie bij 376 maal g gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Voeg een geschikte hoeveelheid lysisbuffer toe aan de gewassen PIB's om een PIB-bufferoplossing van 50% per volume te maken.Meng door de pipetpunt en de slurry voorzichtig te pipetteren en te draaien om de PIB's te resuspenderen. Breng 20 microliter van de drijfmest over naar een buis van 1,5 milliliter met 0,5 milliliter lysisbuffer. Draai de buizen op 376 keer g gedurende 30 seconden.Elke buis bevat gelijke volumes PIBs erin. Gooi het supernatant weg terwijl alleen de vaste hars en maximaal 50 microliter lysisbuffer in elke buis blijven. Breng de lysaten over in de correct gelabelde buizen die PIB's bevatten.Incubeer het lysaat met de PIBs gedurende een uur bij 4 graden Celsius met rotatie bij 8 rpm. Na incubatie met het lysaat, centrifugeer de PIBs op 376 keer g gedurende 30 seconden bij 4 graden Celsius en verwijder het supernatant. Was de kralen door 0,5 milliliter lysisbuffer toe te voegen en de buisjes om te keren Verzamel de kralen door centrifugeren en verwijder het supernatant.Herhaal deze stap voor een totaal van drie wasbeurten. Verwijder na de laatste wasbeurt de lysisbuffer zoveel mogelijk zonder de PIB's te pipetteren. Bereid de elutiebuffer voor die 2% SDS bevat en voeg de elutiebuffer vier tot vijf keer het volume PIB's toe.Incubeer een uur bij 65 graden Celsius om de fosfoproteïnefosfatasen uit de kralen te elueren. Centrifugeer de buizen op 376 maal g gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Verzamel het eluaat in een aparte buis en ga verder met massaspectrometrieanalyses of western blotting.Om de PIB's te regenereren, incubeer ze in 2% SDS-oplossing met rotatie bij 8 rpm gedurende een uur bij kamertemperatuur. Was de kralen drie tot vijf keer in 25 millimol Tris-HCl pH 7,5 met rotatie gedurende 30 minuten per wasbeurt. Bewaar PIBs in 25 millimolar Tris HCL pH 7,5 met natriumazide.Voor massaspectrometrie-analyse variëren methoden voor gegevensfiltering en -analyse en kunnen deze worden uitgevoerd door de onderzoeker of een kernfaciliteit. Nadat u de onbewerkte gegevens hebt vergeleken met een soortspecifieke proteoomdatabase, filtert u de zoekresultaten en exporteert u deze als een Microsoft Excel-werkblad. Analyseer de gegevens in drievoud.Voor labelvrije kwantificering gebruikt u MS1-piekgebiedmetingen om de gegevens te kwantificeren. Om PPP-subeenheden en hun interactoren de novo te identificeren, vergelijkt u biologische triplicaten van microcystine-LR-geremde en DMSO-behandelde monsters. Filter de gegevens zodat alleen eiwitten met een totaal aantal peptiden van meer dan één op ten minste twee van de drie dmso-controlebehandelde monsters aanwezig zijn.Om eiwitten uit te filteren die niet-specifiek aan de hars binden, verwijdert u de eiwitten waarin het totale aantal peptiden in de met microcystine-LR behandelde toestand hoger is dan dat voor een PPP-katalytische subeenheid. Sluit veel voorkomende verontreinigingen zoals keratine, collageen, ribosomale eiwitten en heterogene nucleaire ribonucleoproteïnen uit van de analyse. Een CSV-bestand is essentieel voor het importeren van de gegevens in Perseus.Importeer gefilterde gegevens in Perseus door te klikken op Algemene matrixupload in het gedeelte Laden. Transformeer de gegevens door naar Basistransformatie te gaan, de gegevens te selecteren en de transformatiefunctie op te geven als logboekbasis 2 van x. Reken ontbrekende waarden uit een normale verdeling toe door naar Imputatie te gaan, Ontbrekende waarden uit normale verdeling vervangen, de gegevens te selecteren en de breedte en het terugschakelen voor de berekening op te geven.Voer kwantielnormalisatie uit door naar Normaliseren, Kwantielnormalisatie te gaan. Annoteer de gegevens door naar Annot-rijen, Categorische annotatierijen te gaan. Voer de T-test van de student uit door naar Tests, Twee-steekproeftests te gaan, de groepen te selecteren, de uit te voeren test en de methode voor correctie van meerdere hypothesetests zoals gebruikt voor afkapping.Deze functie berekent ook de log 2-verhoudingen. Fosfoproteïnefosfaotaten en hun interactoren werden geïdentificeerd in de HeLa-cellen met behulp van een PIB pull-down experiment, gevolgd door labelvrije kwantificering van eiwitrijkdom in met DMSO behandelde en microcystine-LR-behandelde monsters. Vulkaanplot van massaspectrometrie-analyse identificeerde specifieke PIB-bindmiddelen weergegeven in rode, katalytische subeenheden in blauw en nieuwe kandidaat PPP-subeenheden, of interagerende eiwitten, in wit.Niet-specifieke bindmiddelen werden grijs weergegeven. Scatter plot van log2 gebied van de DMSO-behandelde HeLa cel lysaat toonde aan dat de abundanties sterk gecorreleerd waren, wat wijst op reproduceerbaarheid van de gegevens. Netwerkanalyse van alle fosforproteïnefosfatase-subeenheden en interagerende eiwitten toonde aan dat deze eiwitten specifieke interactoren waren in de PIB-pull-down.Globale proteomics-analyses kunnen worden uitgevoerd en de resultaten kunnen worden vergeleken met de PIB-analyse om te bepalen of de PPPome-samenstelling wordt aangedreven door PPP-abundantie of gereguleerd door posttranslationele mechanismen. PIB-MS is een breed toepasbaar hulpmiddel dat ons in staat heeft gesteld om verschillen in PPP-expressiepatronen onder verschillende omstandigheden te identificeren, zoals interfase versus mitotische monsters of verschillen tussen kankercellijnen.

a-mass-spectrometry-based-approach-to-identify-phosphoprotein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Beschrijving van een kwantitatieve fosforylering procedure met behulp van cryolysis, ureum solubilziation, HILIC fractionering en IMAC verrijking van gefosforyleerde peptiden.

Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae</em

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Fosforylering van eiwitten is een centrale eigenschap van hoe cellen informatie in hun extracellulaire milieu interpreteren en hierop reageren. Hier presenteren we een hoogdoorlaatscreeningprotocol met behulp van kinasen gezuiverd uit zoogdiercellen om snel kinasen te identificeren die een substraat(s) van belang fosforyleren.

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening

Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

Dit protocol beschrijft een procedure om uitpakken en verrijken van phosphopeptides van prostaatkanker cellijnen of weefsels voor een analyse van de phosphoproteome via massa spectrometrie gebaseerde proteomics.

Verrijking van de Phosphopeptide in combinatie met kwantitatieve Label-vrije Spectrometrie van de massa te onderzoeken van de Phosphoproteome in prostaatkanker

Hier presenteren we een protocol voor co-immunoprecipitation en een op-kraal enzymatische activiteit assay gelijktijdig het bestuderen van de bijdrage van specifieke proteïne domeinen van plasmamembraan receptoren aan zowel de enzym werving en de enzymactiviteit.

Co-immunoprecipitation Assay voor het bestuderen van functionele interacties tussen receptoren en enzymen

We kenmerkten een nieuwe kinase eiwit met behulp van robuuste biochemische benaderingen: Western Blot analyse met een dedicated specifieke antilichaam op verschillende cel lijnen en weefsels, interacties door coimmunoprecipitation experimenten, kinase activiteit gedetecteerd door westerse Vlek gebruikend een phospho-specifiek antilichaam en door γ [32P] ATP etikettering.

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Dit protocol richt zich op de identificatie van eiwitten die binden aan inositol fosfaten of fosfoinositides. Het maakt gebruik van affiniteits chromatografie met biotinyleerd inositol fosfaten of fosfoinositides die zijn geïmmobiliseerd via streptavidine aan agarose of magnetische kralen. Inositol fosfaat of fosfoinositide bindende eiwitten worden geïdentificeerd door Western blotting of massaspectrometrie.

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Het huidige protocol beschrijft monstervoorbereiding en gegevensanalyse om eiwitfosforylering te kwantificeren met behulp van een verbeterde single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

Een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering

Posttranslationele modificaties (PTM's) veranderen eiwitstructuren en -functies. Methoden voor de gelijktijdige verrijking van meerdere PTM-typen kunnen de dekking in analyses maximaliseren. We presenteren een protocol met behulp van dual-functionele Ti(IV)-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie gevolgd door massaspectrometrie voor de gelijktijdige verrijking en analyse van eiwit N-glycosylatie en fosforylering in pancreasweefsels.

Een spin-tipverrijkingsstrategie voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels

Leer PIB-MS om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren met massaspectrometrie. Deze methode verrijkt endogene eiwitten zonder exogene expressie of antilichamen.

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Meer video's verkennen