Name: Littekenontwikkeling visualiseren met behulp van SCAD Assay - een ex-situ skin scarring assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Leer de SCAD-assay voor littekenontwikkeling met huid-fascia-explanten. Deze methode maakt live imaging van fibroblastmigratie mogelijk en biedt inzicht in wondgenezingsmechanismen voor therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen alle co-auteurs van Jiang et al. 2020 voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van SCAD-methodologie13. We bedanken Dr. Steffen Dietzel en de Bioimaging-kernfaciliteit aan de Ludwig-Maximilans-Universität voor de toegang tot het Multiphoton-systeem. Y.R. werd ondersteund door de Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), de European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) en de LEO Foundation (LF-OC-21-000835).

Het onderstaande model geeft een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving van de generatie van SCAD-assay zoals kort beschreven in Jiang et al., 202013. SCAD-monsterpreparaten werden uitgevoerd na het offeren van de dieren volgens de internationale en de richtlijnen van de regering van Opper-Beieren. Dieren werden gehuisvest in de dierenfaciliteit van het Helmholtz Centre München. De kamers werden onderhouden met een optimale luchtvochtigheid en constante temperatuur met een lichtcyclus van 12 uur. Dieren werden ad libitum voorzien van voedsel en water.
1. SCAD weefselpreparaat
<ol><li>Offer pasgeboren pups op postnatale dag 0 of dag 1 (P0 of P1).</li>
	<li>Snijd voorzichtig ten minste 1,5 cm x 1,5 cm volledige dikte dorsale rughuid tot de skeletspierlaag met behulp van een steriel chirurgisch scalpel.</li>
	<li>Pel de huid met behulp van steriele gebogen tang, zodat de oppervlakkige fascia intact is met de onderliggende panniculus carnosus spier.</li>
	<li>Was het weggesneden weefsel met 50-100 ml koude DMEM / F-12-media om besmettelijk bloed te verwijderen.</li>
	<li>Was eenmaal met Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) om de levensvatbaarheid van weefsel en cellen te behouden.</li>
	<li>Plaats de huid ondersteboven (oppervlakkige fascia bovenop) in een petrischaaltje van 10 cm met DMEM/F12-media.</li>
	<li>Met behulp van een wegwerp 2 mm biopsy punch, snijd volledige dikte ronde huidstukken, ervoor zorgen dat oppervlakkige fascia intact is met onderliggende panniculus carnosus spier tot de epidermis om SCAD weefsels te genereren.</li>
	<li>Bereid en vul 200 μL DMEM/F12 (zonder fenolrood) complete media-DMEM/F12 media aangevuld met 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM niet-essentiële aminozuren en 1x Penicilline/streptomycine in individuele putjes van een 96-well plaat.</li>
	<li>Breng met behulp van een steriele tang zorgvuldig individueel SCAD-weefsel ondersteboven (fascia naar boven gericht) over en dompel het volledig onder in de putten van een 96-well plaat.</li>
	<li>Breng de plaat over naar een celkweekincubator die onder standaardomstandigheden wordt onderhouden (37 °C, 21% (v/v) zuurstof, 5% (v/v) C02 en 95% vochtigheid).</li>
</ol>2. SCAD - Weefselkweek
<ol><li>Kweek SCADs in een incubator gedurende maximaal 5 dagen.</li>
	<li>Vervang op dag 2 en dag 4 van de kweek de media door 200μl verse voorverwarmde DMEM / F12 complete media om voortdurende levensvatbaarheid van cellen en weefsels te garanderen. Vervang behandelingsstoffen tijdens elke mediawissel. OPMERKING: Zorg ervoor dat u 10 μL media in de put laat om te voorkomen dat weefsels aan de putjes blijven plakken.</li>
	<li>Bereid SCADs voor op de volgende experimenten: Live imaging (sectie 3) en Tissue Harvesting en 2D/3D immunofluorescentiekleuring (sectie 4).</li>
</ol>3. Live beeldvorming van SCADs
<ol><li>Bereid een minimum van 30 ml van 2% -3% (w / v) laagsmeltende agarose-oplossing in PBS in een glazen fles door deze in een magnetron te verwarmen totdat deze kookt.</li>
	<li>Breng de fles onmiddellijk over en koel de vloeibare agarose-oplossing in een waterbad van 40 °C.</li>
	<li>Breng het SCAD-weefsel met fascia/scar naar boven gericht over op het midden van een schotel van 35 mm.</li>
	<li>Sluit de SCAD in bij kamertemperatuur (RT) door met behulp van een Pasteur pipet langzaam 40 °C vloeibare agarose over te brengen op de 35 mm schotel. Agarose polymeriseert binnen 2 min.</li>
	<li>Voeg 2 ml voorverwarmde DMEM/F12 complete media toe (zonder fenolrode indicator).</li>
	<li>Verkrijg time-lapse-beelden van dag 0 SCADs tot 48 uur met behulp van een confocale of een multifotonenmicroscoop uitgerust met een geschikt incubatiesysteem ingesteld op 37 °C, 21% (v/v) zuurstof, 5% (v/v) C02 en 95% vochtigheid.</li>
</ol>4. Weefseloogst en 2D/3D immunofluorescentiekleuring
<ol><li>Was de weefsels op relevante tijdstippen door de media te vervangen door steriel PBS.</li>
	<li>Breng met behulp van een steriele tang zorgvuldig afzonderlijke SCADs over naar microcentrifugebuizen van 1,5 ml die 500 μL 2% paraformaldehyde bevatten om de weefsels 's nachts bij 4 °C te fixeren.</li>
	<li>Was de weefsels driemaal met PBS en ga verder met 2D/3D immunofluorescentiekleuring.</li>
	<li>3D immunofluorescentie kleuring<ol>
<li>Permeabiliseer de weefsels door te incuberen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 500 μL PBS aangevuld met 0,2% gelatine, 0,5% Triton-X100 en 0,01% Thimerosal (PBSGT) bij RT gedurende 24 uur.</li>
		<li>Bereid een voldoende hoeveelheid primaire antilichamen volgens de instructies van de fabrikant en incubeer SCAD-weefsels in 150 μL PBSGT-oplossing gedurende 24 uur bij RT. OPMERKING: Als de optimale antilichaamconcentratie voor immuunfluorescentie niet door de fabrikant wordt gemeld, moet eerdere antilichaamtitratie worden uitgevoerd op controleweefsels met verschillende concentraties (bijv. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).</li>
		<li>Was de SCADs voorzichtig drie keer met PBS om het ongebonden primaire antilichaam te verwijderen.</li>
		<li>Incubateer weefsel met 1:1000 relevante Alexa Fluor secundaire antilichamen in PBS 's nachts bij RT.</li>
		<li>Was het weefsel gedurende 30 minuten in PBS driemaal voorzichtig om overtollige ongebonden secundaire antilichamen te verwijderen.</li>
		<li>Breng het weefsel over op een 35 mm glazen bodemschaal voor confocale of multifoton beeldvorming. OPMERKING: Bij gebruik van onderdompelingsdoelstellingen in water, integreer de SCADs in 2% laag smeltpunt agarose om het weefsel te immobiliseren om driften tijdens beeldacquisitie te voorkomen</li>
	</ol>
</li>
	<li>2D immunofluorescentie kleuring<ol>
<li>Breng het weefsel over naar een cryo-mal en vul voorzichtig met optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding om het weefsel volledig onder te dompelen.</li>
		<li>Pas de oriëntatie van het weefsel voorzichtig aan en zorg voor de afwezigheid van luchtbellen om een doorsnede of een verticale sectie te verkrijgen.</li>
		<li>Plaats de vorm 20-30 min op droogijs en incubeer het blok een nacht op -80 °C.</li>
		<li>Stel de bladtemperatuur in op -25 °C en de temperatuur van het monsterblok op -17 °C. Bereid een cryosectie van 6 μm voor met behulp van een cryostaat, breng de secties over op een hechtingsschuif en bewaar de dia's in een vriezer van -20 °C.</li>
		<li>Spoel de glaasjes driemaal in PBS en incubeer de glaasjes in 5% Bovine Serum Albumin (BSA) w/v in PBST (PBS aangevuld met 0,05% Tween) gedurende 1 uur.</li>
		<li>Voeg een geschikte hoeveelheid primair antilichaam toe aan 150μl PGST en incubeer een nacht bij 4 °C OPMERKING: Als de optimale antilichaamconcentratie voor immuunfluorescentie niet door de fabrikant wordt gerapporteerd, moet eerdere antilichaamtitratie worden uitgevoerd op controlesecties met verschillende concentraties (bijv. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).</li>
		<li>Was de secties voorzichtig drie keer met PBS om het ongebonden primaire antilichaam te verwijderen.</li>
		<li>Incubeer weefsel met 1:1000 relevante Alexa Fluor secundaire antilichamen in PBS gedurende 2 uur bij RT.</li>
		<li>Was het weefsel gedurende 5 minuten in PBS driemaal voorzichtig om overtollige ongebonden secundaire antilichamen te verwijderen.</li>
		<li>Monteer de dia's met een montagemedium met DAPI en droog de dia's in het donker bij RT.</li>
		<li>Stel de secties voor met behulp van een fluorescentiemicroscoop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Longaker, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+skin+wounds+in+the+fetal+environment+heal+with+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation.</a> Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).</li>
<li>desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+wound+healing%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and wound healing: an update.</a> Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).</li>
<li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).</li>
<li>Tripathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+scars+and+keloids%3A+a+review+and+current+treatment+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities.</a> Biomedical Dermatology. 4, 11(2020).</li>
<li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing--Aiming+for+perfect+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276 (5309), 75-81 (1997).</li>
<li>Correa-Gallegos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+repair+of+deep+wounds+by+mobilized+fascia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patch repair of deep wounds by mobilized fascia.</a> Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).</li>
<li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+wounds+and+its+burden%3A+An+updated+compendium+of+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).</li>
<li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), 2151(2015).</li>
<li>Leavitt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prrx1+fibroblasts+represent+a+pro-fibrotic+lineage+in+the+mouse+ventral+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis.</a> Cell Reports. 33 (6), 108356(2020).</li>
<li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li>
<li>Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparisons+of+the+morphology%2C+migration%2C+cell+adhesions%2C+and+actin+cytoskeleton+of+fibroblasts+in+four+different+three-dimensional+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li>
<li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653(2020).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807(2021).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+wound+healing%3A+an+emphasis+on+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%3A+Official+Journal+of+International+Society+for+Bioengineering+and+the+Skin+%28ISBS%29+%5Band%5D+International+Society+for+Digital+Imaging+of+Skin+%28ISDIS%29+%5Band%5D+International+Society+for+Skin+Imaging+%28ISSI%29%22%5BJournal%5D)">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li>
<li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+Animal+models+of+wound+healing%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li>
</ol>

Alle auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Er zijn al verschillende modellen ontwikkeld om littekenvorming na letsel te begrijpen. Hoewel er in dit opzicht veel vooruitgang is geboekt, zijn de werkelijke mechanismen nog steeds niet duidelijk. In tegenstelling tot de vorige techniek bevat het SCAD-model alle celtypen en cutane lagen, waardoor de complexiteit van native skin18,19 behouden blijft. Deze methodologie is in staat om fundamentele datasets te genereren die belangrijk zijn voor het begrijpen van m...

Wondgenezing is een proces van herstel van gebroken wonden. Weefselletsels bij ongewervelde dieren resulteren in gedeeltelijke of volledige regeneratie. Daarentegen reageren zoogdieren op diep letsel door littekens, een proces dat is afgestemd op het snel afdichten van wonden met dichte pluggen van matrixvezels die het doorgebroken gebied minimaliseren en tegelijkertijd de gewonde site permanent vervormen 1,2,3. Grote brandwonden op de huid of diepe open wonden bij zoogdieren resulteren in pathologische fenotypen zoals hypertrofische of keloïde littekens 4,5. Deze uitbundige littekens veroorzaken een enorme belasting voor klinische en wereldwijde gezondheidszorgsystemen. Alleen al in de VS kost littekenbeheer jaarlijks ongeveer $ 10 miljard 6,7. Daarom is de ontwikkeling van relevante methodologieën nodig om de fundementale processen en mechanismen die betrokken zijn bij littekenvorming beter te begrijpen.
In de afgelopen jaren heeft een breed scala aan studies bij muizen heterogene fibroblastpopulaties onthuld met verschillende functionele potenties op basis van hun oorsprong op bepaalde huidlocaties 8,9,10. In de achterhuid identificeerden Rinkevich et al., 2015, dat een specifieke fibroblastpopulatie met een vroege embryonale expressie van Engrailed-1 (En1), epf (engrailed positive fibroblast) genoemd, bijdraagt aan cutane littekens bij verwonding. Omgekeerd draagt een andere fibroblastlijn zonder voorgeschiedenis van ingebakken expressie, Engrailed negative fibroblast (ENF), niet bij aan littekenvorming8. Het in kaart brengen van deze En1-afstammingslijnen met behulp van Cre-gestuurde transgene muislijnen gekruist naar fluorescentie reporter muislijnen zoals R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) maakt visualisatie van EPF- en ENF-populaties mogelijk.
Het bestuderen van fibroblastmigratie in vivo gedurende meerdere dagen wordt beperkt door ethische en technische beperkingen. Bovendien is het technisch een technische uitdaging om samengestelde, virale en neutraliserende antilichaambibliotheekschermen te moduleren om routes te moduleren die betrokken zijn bij littekens. Eerder gebruikte in vitro of ex vivo modellen missen het vermogen om fibroblastmigratie en littekenvorming in echte huidmicro-omgevingen, uniformiteit in littekenontwikkeling en weefselcomplexiteit die in vivo huidomgevingen emuleertte visualiseren 11,12. Om de bovenstaande beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we een ex vivo littekentest genaamd SCAD (SCar-achtig weefsel in A Dish)13,14. Deze eenvoudige test kan worden uitgevoerd door een huid van 2 mm van volledige dikte met de epidermis, de dermis en de subcutane fasciaregio's te exciëren en deze gedurende maximaal 5 dagen te kweken in dmso-media met serumsupplement. Littekens gegenereerd door SCAD repliceren op betrouwbare wijze transcriptomische en proteomische kenmerken van in vivo littekens. Bovendien maken SCADs gegenereerd uit relevante transgene muislijnen (bijv. En1-muizen) gekruist met fluorescerende reportermuislijnen de visualisatie van fibroblastmigratiedynamiek en littekenontwikkeling met een ongekende resolutie mogelijk. Bovendien kan dit model eenvoudig worden aangepast voor toepassingen met een hoge doorvoer (bijv. compound library, antilichaambibliotheek of virale screening)13,14. In dit artikel beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om SCADs en daaropvolgende downstream verwerkingstoepassingen te genereren om cellulaire en matrixdynamiek in littekenontwikkeling te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>10% Tween 20, Nonionic Detergent</td><td>Biorad Laboratories</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin, Cold ethanol fract</td><td>Sigma</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL</td><td>LIFE Technologies</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td><td>Fisher scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>Adhesion slides</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL</td><td>LIFE Technologies</td><td>&nbsp;10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G met DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>00 4959 52</td><td>Montagemedium met DAPI</td></tr><tr><td>Forceps gebogen met fijne punten met geleidingspen van roestvrij staal (pincet) 125 mm lengte</td><td>Fisher Scientific</td><td>12381369</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine uit varkenshuid</td><td>Sigma</td><td>G2500-100G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement-100 mL</td><td>LIFE Technologies</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL</td><td>LIFE Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Gas incubatiesysteem voor CO2 en O2</td><td>Ibidi</td><td>11922</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Verwarmingssysteem</td><td>Ibidi</td><td>10915</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 rechtopstaande microscoop - Multifoton excitatie 680&ndash;1300 nm</td><td>Leica</td><td></td><td>Uitgerust met een 25x water-dipping objectief (HC IRAPO L 25x/1.00&thinsp;W) in combinatie met een afstembare laser (Spectra-Physics, InSight DS&thinsp;+&thinsp;Single)</td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>LIFE Technologies</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose,25 g</td><td>Biozym /Lonza</td><td>859081</td><td></td></tr><tr><td>OCT Embedding Matrix</td><td>Carlroth</td><td>6478.1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL</td><td>VWR International</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td><td>Stiefel</td><td>270130</td><td></td></tr><tr><td>Rechte Scherpe/Scherpe Dissectie schaar 11,4 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>15654444</td><td></td></tr><tr><td>Thimerosal Bioxtra, 97%&ndash;101%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8784-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axioimager M2 rechtopstaande microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

littekenontwikkeling visualiseren met behulp van scad assay - een ex-situ skin scarring assay

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

De wereldwijde reactie van zoogdieren op het afdichten van diepe weefselwonden is door littekenvorming en weefselcontractie, gemedieerd door gespecialiseerde fascia fibroblasten. Ondanks de klinische betekenis van littekenvorming en verminderde wondgenezing, is ons begrip van fascia fibroblastdynamica bij wondgenezing vluchtig vanwege het gebrek aan relevante assays die directe visualisatie van fibroblastchoreografie en -dynamiek in complexe omgevingen zoals in huidwonden mogelijk maken. Dit artikel presenteert een protocol om ex-situ huidlittekens te genereren met behulp van SCAD of "SCar-achtig weefsel in A Dish" dat de complexe omgeving van huidwonden nabootst. In deze test wordt de huid van 2 mm van volledige dikte weggesneden en ondersteboven gekweekt in media gedurende 5 dagen, gedurende welke littekens en huidcontracturen zich uniform ontwikkelen. Deze methodologie, in combinatie met fibroblast-lineage specifieke transgene muismodellen, maakt visualisatie van individuele fibroblastlijnen over het hele wondherstelproces mogelijk. Over het algemeen helpt dit protocol onderzoekers bij het begrijpen van fundamentele processen en mechanismen van wondherstel, waarbij de effecten van modulatoren op wondgenezingsresultaten direct worden onderzocht.

Het genereren van SCADs kan worden onderverdeeld in drie essentiële stappen: het oogsten van de huid van P0-P1-muizen, het genereren van biopsieponsen van volledige dikte en de daaropvolgende kweek van individuele scads tot 5 dagen in 96-well platen. Als uitlezing kan deze test verder worden toegepast om de ruimtelijke en temporele aspecten van littekens te analyseren. De ruimtelijke analyse maakt gebruik van 2D- en 3D-immuunlabeling van weefsels om ruimtelijke lokalisatie van cellulaire en matrixcomponenten in zich ontw...

Dit protocol beschrijft het genereren van een huid-fascia explant genaamd "SCar like tissue in A Dish" of SCAD. Dit model maakt een ongekende visualisatie van enkele fibroblasten mogelijk tijdens littekenvorming.

Littekenontwikkeling visualiseren met behulp van SCAD Assay - een ex-situ skin scarring assay

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

Eerder gebruikte in vitro of ex vivo modellen missen dermale celcomponenten en complexiteit van huidweefsel. Deze ex situ SCAD-test overwint een bepaalde beperking en maakt het mogelijk om de ontwikkeling van littekens buiten het gewonde dier te bestuderen. De SCAD-test maakt visualisatie van fibroblastmigratie en littekenvorming in micro-omgevingen van de huid mogelijk.Het stelt screeningsbibliotheken van activatoren of remmers in staat om de mechanistische basis van littekenvorming te begrijpen. High-throughput screening assays van platte bibliotheken met behulp van het SCAD-model bij het begrijpen van fundamentele processen en het molecuultraject dat betrokken is bij wondherstel. De SCAD-test is eenvoudig uit te voeren met behulp van de huidexplantaten.Voor een consistent litteken wordt aanbevolen om postnatale dag nul of dag één huid te selecteren. Na het opofferen van postnatale dag nul of dag één pasgeboren pup, gebruik een steriel chirurgisch scalpel om zorgvuldig 1,5 bij 1,5 centimeter volledige dikte dorsale rughuid tot aan de skeletspierlaag te verwijderen. Pel de huid met behulp van steriele gebogen tang, zodat de oppervlakkige fascia intact is met de onderliggende panniculus carnosus spier.Was het weggesneden weefsel met 50 tot 100 milliliter koud DMEM F-12 medium om besmettelijk bloed te verwijderen. Was vervolgens het weefsel met Hanks gebalanceerde zoutoplossing om de levensvatbaarheid van weefsel en cellen te behouden. Leg de huid ondersteboven met oppervlakkige fascia bovenop in een petrischaaltje van 10 centimeter met DMEM F-12 medium.Snijd vervolgens, met behulp van een wegwerpbiopsieslomp van twee millimeter, ronde huidstukken van volledige dikte weg om korstweefsels te genereren, zodat de oppervlakkige fascia intact is met de onderliggende panniculus carnosus-spier tot aan de opperhuid. Voeg 200 microliter vers DMEM F-12 compleet medium zonder fenolrood toe aan elke put van een 96-well plaat. Breng met behulp van een steriele tang individueel schurftweefsel ondersteboven over naar de putten van een 96-wells plaat.Breng de plaat over naar een celkweekincubator die onder standaardomstandigheden wordt onderhouden. Verwijder op dag twee en vier van de kweek het medium en laat 10 microliter achter in de put en voeg vers voorverwarmd DMEM F-12 compleet medium toe, samen met de behandelingsverbindingen om de levensvatbaarheid van cellen en weefsels te behouden. Voor live beeldvorming van SCADs bereidt u 30 milliliter van 2 tot 3% laagsmeltende agarose-oplossing in PBS in een glazen fles door te verwarmen in een magnetron.Breng na het koken onmiddellijk de fles over en koel de vloeibare agarose-oplossing af in een waterbad van 40 graden Celsius. Breng vervolgens het SCAD-weefsel met fascia of litteken naar boven gericht over op het midden van een schotel van 35 millimeter. Sluit de SCAD vervolgens bij kamertemperatuur in door langzaam 40 graden Celsius vloeibare agarose op het weefsel te gieten met behulp van een pipetpunt van 1000 microliter.Agarose polymeriseert binnen twee minuten. Voeg na polymerisatie twee milliliter voorverwarmd DMEM F-12 compleet medium toe. Vervolgens met behulp van een confocale of een multifotonenmicroscoop uitgerust met geschikte incubatiesystemen die in het manuscript worden uitgelegd, verwerf time-lapse-beelden van dag nul tot dag één.Voor het oogsten van weefsel, was de weefsels op relevante tijdstippen door de media te vervangen door steriel PBS. Breng met behulp van een steriele tang elke SCAD over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 500 microliter 2% paraformaldehyde om de weefsels 's nachts bij vier graden Celsius te fixeren. Was de volgende dag de weefsels drie keer met PBS voordat u overgaat tot twee- of driedimensionale immunofluorescentiekleuring zoals beschreven in het tekstmanuscript.De representatieve whole-mount bright-field beelden van SCADs op dag nul en vijf worden hier getoond. De trichrome kleuring van verticale weefselsecties van de Masson onthult handtekeningen van weefsellittekens, weefselcontractie en accumulatie van extracellulaire matrix in de littekenkern op dagen nul en vijf. De immunofluorescentiekleuring van SCADs op dag nul en vijf wordt getoond.Vanaf het vroege en late stadium van litteken wordt de ingesleten positieve fibroblast weergegeven in groen en de ingesleten negatieve fibroblast in rood. Voor driedimensionale beeldvorming werden weefsels ingebed in agarose-oplossing en bedekt met PBSGT. De representatieve beelden tonen de exclusieve lokalisatie van N-cadherine-eiwit op de littekenplaats van een SCAD van dag vijf.De driedimensionale timelapse beeldvormingsopstelling uitgerust met een incubatiekamer vertoonde vroege gebeurtenissen van progressie van de fibroblastzwermen gedurende de eerste 12 uur of vroege stadia van littekenontwikkeling. De grafische weergave van eencellige gevolgde cellulaire trajecten van individuele fibroblasten over littekenontwikkeling wordt hier gepresenteerd. Het is cruciaal om het SCAD-weefsel ondersteboven in de putplaat te plaatsen, zodat de fascia naar boven is gericht.Als dit niet gebeurt, zou dit leiden tot onvermijdelijke variaties in migratiepatronen. Deze procedure maakt het mogelijk om dermale lagen te onderzoeken voor behandelingen of cultuur met behulp van chemische modulatoren, neutraliserende antilichamen of virale methoden. Dit helpt bij de beoordeling van pathologische fibrotische reacties in verschillende medische omgevingen.We toonden de expressie van connexine-43 en N-cadherine als sleutelmoleculen die betrokken zijn bij fasciamobilisatie bij verwonding. De SCAD-methodologie maakt het mogelijk om nieuwe therapeutische strategieën te identificeren om littekens en fibrose te beperken.

visualizing-scar-development-using-scad-assay-an-ex-situ-skin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Vascularisatie is de sleutel tot een succesvolle aanpak in de tissue engineering. Daarom zijn betrouwbare technologieën die voor de ontwikkeling van vasculaire netwerken in weefsel-constructen evalueren. Hier presenteren we een eenvoudige en kosteneffectieve manier te visualiseren en kwantificeren vascularisatie in vivo.

Een Full Skin Defect model te evalueren Vascularisatie Biomaterialen<em&gt; In Vivo</em

Tijdens de ontwikkeling van zoogdieren genezen huidwonden in een vroeg stadium van de zwangerschap zonder litteken. Hier beschrijven we een betrouwbaar en reproduceerbaar model van littekenloos wondgenezing bij foetussen in de cutane dorsale regio van E16,5 (zonder litteken) en E18,5 (met litteken) muis-embryo's.

Een muis Foetale Skin Model van Scarless Wound Repair

Het vermogen om te migreren is een belangrijke functie van veel verschillende celtypen, inclusief mesenchymale stromale cellen (MSC's). Het kwantificeren van veranderingen in migratievermogen na schade is echter een uitdaging. Dit protocol beschrijft een eenvoudig aanpasbare migratietest die rigoureuze statistiek gebruikt om veranderingen in het migratievermogen van MSC's na schade te kwantificeren.

Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract

Deze studie richt zich op een in vitro model voor wond genezing (kras assay) als een mechanisme om te bepalen hoe milieu aanwezige contaminanten zoals arsenicum invloed cellulaire migratie. De resultaten tonen aan dat deze in vitro -assay snelle en vroege aanwijzingen van wijzigingen in cellulaire migratie vóór in vivo experimenten biedt.

In Vitro Kras Assay om aan te tonen van de gevolgen van arsenicum huid cel migratie

Hier presenteren we een protocol voor een in vitro Scratch assay met primaire fibroblasten en voor een in vivo huid wond genezings test bij muizen. Beide assays zijn eenvoudige methoden om te beoordelen in vitro en in vivo wondgenezing.

Scratch Migration assay en dorsale skinfold Chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing

Dit protocol beschrijft het gebruik van macromoleculaire verdringing om een in vitro menselijk hypertrofisch littekenweefselmodel te creëren dat lijkt op in vivo omstandigheden. Wanneer gecultiveerd in een drukke macromoleculaire omgeving, menselijke huid fibroblasten vertonen fenotypes, biochemie, fysiologie, en functionele kenmerken die lijken op littekenweefsel.

In Vitro Model van de mens cutaneous hypertrofische littekens met behulp van macromoleculaire crowding

Een coherente Raman scattering imaging methodologie om farmaceutische verbindingen in de huid te visualiseren en te kwantificeren wordt beschreven. Dit artikel beschrijft huidweefselpreparaat (mens en muis) en topische formuleringstoepassing, beeldacquisitie om spatiotemporale concentratieprofielen te kwantificeren en voorlopige farmacokinetische analyse om de toediening van topische geneesmiddelen te beoordelen.

Visualiseren en kwantificeren van farmaceutische verbindingen in de huid met behulp van Coherent Raman Scattering Imaging

Deze studie presenteert de tweedimensionale (2D) kraswondmigratietest en de driedimensionale (3D) sferoïde kiemtest, samen met hun respectievelijke stroomafwaartse analysemethoden, waaronder RNA-extractie en immunocytochemie, als geschikte tests om angiogenese in vitro te bestuderen.

Onderzoek naar angiogenese op functioneel en moleculair niveau door gebruik te maken van de Scratch Wound Migration Assay en de Spheroid Sprouting Assay

Dit protocol legt uit hoe een hypertrofisch littekenmodel van muizen kan worden opgezet dat de mechanotransductiesignalering verhoogt om mensachtige littekens te simuleren. Deze methode omvat het verhogen van de mechanische spanning over een genezende incisie in een muis en het gebruik van een gespecialiseerd apparaat om reproduceerbaar, overmatig littekenweefsel te creëren voor gedetailleerde histologische en bio-informaticaanalyses.

Een muismodel van mechanotransductie-aangedreven, mensachtige hypertrofische littekens

Hier presenteren we een semi-geautomatiseerd protocol voor het identificeren en kwantificeren van immuun- en niet-immuuncellen in huidsecties met behulp van SCAnED, een gratis op ImageJ gebaseerde macro voor huidsegmentatie.

SCAnED - een open-source huidsegmentatiemacro voor semi-geautomatiseerde detectie van cellen en kernen in epidermale en dermale huidcompartimenten

Leer de SCAD-assay voor littekenontwikkeling met huid-fascia-explanten. Deze methode maakt live imaging van fibroblastmigratie mogelijk en biedt inzicht in wondgenezingsmechanismen voor therapeutische toepassingen.

Littekenontwikkeling visualiseren met behulp van SCAD Assay - een ex-situ skin scarring assay

Meer video's verkennen