Littekenontwikkeling visualiseren met behulp van SCAD Assay - een ex-situ skin scarring assay

Eerder gebruikte in vitro of ex vivo modellen missen dermale celcomponenten en complexiteit van huidweefsel. Deze ex situ SCAD-test overwint een bepaalde beperking en maakt het mogelijk om de ontwikkeling van littekens buiten het gewonde dier te bestuderen. De SCAD-test maakt visualisatie van fibroblastmigratie en littekenvorming in micro-omgevingen van de huid mogelijk.

Het stelt screeningsbibliotheken van activatoren of remmers in staat om de mechanistische basis van littekenvorming te begrijpen. High-throughput screening assays van platte bibliotheken met behulp van het SCAD-model bij het begrijpen van fundamentele processen en het molecuultraject dat betrokken is bij wondherstel. De SCAD-test is eenvoudig uit te voeren met behulp van de huidexplantaten.

Voor een consistent litteken wordt aanbevolen om postnatale dag nul of dag één huid te selecteren. Na het opofferen van postnatale dag nul of dag één pasgeboren pup, gebruik een steriel chirurgisch scalpel om zorgvuldig 1,5 bij 1,5 centimeter volledige dikte dorsale rughuid tot aan de skeletspierlaag te verwijderen. Pel de huid met behulp van steriele gebogen tang, zodat de oppervlakkige fascia intact is met de onderliggende panniculus carnosus spier.

Was het weggesneden weefsel met 50 tot 100 milliliter koud DMEM F-12 medium om besmettelijk bloed te verwijderen. Was vervolgens het weefsel met Hanks gebalanceerde zoutoplossing om de levensvatbaarheid van weefsel en cellen te behouden. Leg de huid ondersteboven met oppervlakkige fascia bovenop in een petrischaaltje van 10 centimeter met DMEM F-12 medium.

Snijd vervolgens, met behulp van een wegwerpbiopsieslomp van twee millimeter, ronde huidstukken van volledige dikte weg om korstweefsels te genereren, zodat de oppervlakkige fascia intact is met de onderliggende panniculus carnosus-spier tot aan de opperhuid. Voeg 200 microliter vers DMEM F-12 compleet medium zonder fenolrood toe aan elke put van een 96-well plaat. Breng met behulp van een steriele tang individueel schurftweefsel ondersteboven over naar de putten van een 96-wells plaat.

Breng de plaat over naar een celkweekincubator die onder standaardomstandigheden wordt onderhouden. Verwijder op dag twee en vier van de kweek het medium en laat 10 microliter achter in de put en voeg vers voorverwarmd DMEM F-12 compleet medium toe, samen met de behandelingsverbindingen om de levensvatbaarheid van cellen en weefsels te behouden. Voor live beeldvorming van SCADs bereidt u 30 milliliter van 2 tot 3% laagsmeltende agarose-oplossing in PBS in een glazen fles door te verwarmen in een magnetron.

Breng na het koken onmiddellijk de fles over en koel de vloeibare agarose-oplossing af in een waterbad van 40 graden Celsius. Breng vervolgens het SCAD-weefsel met fascia of litteken naar boven gericht over op het midden van een schotel van 35 millimeter. Sluit de SCAD vervolgens bij kamertemperatuur in door langzaam 40 graden Celsius vloeibare agarose op het weefsel te gieten met behulp van een pipetpunt van 1000 microliter.

Agarose polymeriseert binnen twee minuten. Voeg na polymerisatie twee milliliter voorverwarmd DMEM F-12 compleet medium toe. Vervolgens met behulp van een confocale of een multifotonenmicroscoop uitgerust met geschikte incubatiesystemen die in het manuscript worden uitgelegd, verwerf time-lapse-beelden van dag nul tot dag één.

Voor het oogsten van weefsel, was de weefsels op relevante tijdstippen door de media te vervangen door steriel PBS. Breng met behulp van een steriele tang elke SCAD over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 500 microliter 2% paraformaldehyde om de weefsels 's nachts bij vier graden Celsius te fixeren. Was de volgende dag de weefsels drie keer met PBS voordat u overgaat tot twee- of driedimensionale immunofluorescentiekleuring zoals beschreven in het tekstmanuscript.

De representatieve whole-mount bright-field beelden van SCADs op dag nul en vijf worden hier getoond. De trichrome kleuring van verticale weefselsecties van de Masson onthult handtekeningen van weefsellittekens, weefselcontractie en accumulatie van extracellulaire matrix in de littekenkern op dagen nul en vijf. De immunofluorescentiekleuring van SCADs op dag nul en vijf wordt getoond.

Vanaf het vroege en late stadium van litteken wordt de ingesleten positieve fibroblast weergegeven in groen en de ingesleten negatieve fibroblast in rood. Voor driedimensionale beeldvorming werden weefsels ingebed in agarose-oplossing en bedekt met PBSGT. De representatieve beelden tonen de exclusieve lokalisatie van N-cadherine-eiwit op de littekenplaats van een SCAD van dag vijf.

De driedimensionale timelapse beeldvormingsopstelling uitgerust met een incubatiekamer vertoonde vroege gebeurtenissen van progressie van de fibroblastzwermen gedurende de eerste 12 uur of vroege stadia van littekenontwikkeling. De grafische weergave van eencellige gevolgde cellulaire trajecten van individuele fibroblasten over littekenontwikkeling wordt hier gepresenteerd. Het is cruciaal om het SCAD-weefsel ondersteboven in de putplaat te plaatsen, zodat de fascia naar boven is gericht.

Als dit niet gebeurt, zou dit leiden tot onvermijdelijke variaties in migratiepatronen. Deze procedure maakt het mogelijk om dermale lagen te onderzoeken voor behandelingen of cultuur met behulp van chemische modulatoren, neutraliserende antilichamen of virale methoden. Dit helpt bij de beoordeling van pathologische fibrotische reacties in verschillende medische omgevingen.

We toonden de expressie van connexine-43 en N-cadherine als sleutelmoleculen die betrokken zijn bij fasciamobilisatie bij verwonding. De SCAD-methodologie maakt het mogelijk om nieuwe therapeutische strategieën te identificeren om littekens en fibrose te beperken.