Hippocampale neuronale culturen om nieuwe pathogene antilichamen te detecteren en te bestuderen die betrokken zijn bij auto-immune encefalitis

Dit protocol is belangrijk omdat het ons in staat stelde om te identificeren of een patiëntmonster pathogene antilichamen bevatte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ligt in het vermogen om reactiviteit te differentiëren tussen oppervlakte- en intracellulaire antigenen, die niet gemakkelijk kunnen worden onderscheiden door andere methoden. De culturele hippocampusneuronen worden gebruikt om nieuwe antilichamen te identificeren.

De identificatie van deze nieuwe antilichamen maakt het uiteindelijk mogelijk om een specifieke in monotherapieën te initiëren om de patiëntresultaten te verbeteren. Deze techniek is belangrijk omdat het kan worden uitgebreid tot het hele veld van de ziekten die verband houden met pathogene antilichamen gericht op neuronale oppervlakte-eiwitten. Houd de embryokop vast met een fijne gebogen tang en doorboort de banen met een paar fijne rechte tangen in een hoek van 45 graden.

Laat vervolgens de fijne gebogen tang los. Met behulp van een chirurgische schaar, ontleed de huid en schedel vanaf het achterhoofdsbeen tot het frontale bot. Verwijder vervolgens de hersenen met een paar fijne gebogen tangen en verzamel deze in de zes centimeter schotel met winterslaap plus B27.

Zodra de hersenen van alle embryo's zijn hersteld, gebruikt u de fijne rechte tang om de telencephalonen sagittal te scheiden. Bereid vervolgens een schaal van 10 centimeter door druppels overwintering plus B27 op een centimeter afstand in een cirkel te plaatsen en plaats één telencephalon per druppel om door de ontleedbare scoop te visualiseren bij een vergroting van 1,25 X. Terwijl u onder de microscoop werkt, verwijdert u voorzichtig de thalamus en pelt u de hersenvliezen om de hippocampus beter te visualiseren.

Ontleed vervolgens de hippocampus met de precisieveerschaar. En leg het in de schaal van 3,5 centimeter met winterslaap plus B27 en istrate twee. Herhaal de procedure om alle hippocampi te verzamelen.

Voeg voor de enzymatische dissociatie van de hippocampus één milliliter van 2,5% trypsine toe in de buis van 50 milliliter die de hippocampi bevat. Nadat u het volume in de buis op vijf milliliter met HBSS hebt gebracht, incubeert u de buis gedurende 15 minuten in het waterbad bij 37 graden Celsius. Om het trypsine verder te verdunnen, voegt u 10 milliliter voorverwarmd HBSS toe en plaatst u de buis terug in het waterbad, ingesteld op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Gebruik vervolgens een micropipet van 1000 microliter om de hippocampi die als slijmmassa verschijnt over te brengen naar een buis van 50 milliliter. En incubeer het weefsel met zes milliliter voorverwarmd HBSS gedurende vijf minuten, zoals aangetoond. Om het weefsel mechanisch te dissociëren, brengt u de hippocampusmassa over naar een buis van twee milliliter met conische bodem.

Na het toevoegen van een milliliter voorverwarmde DMEM-media, homogeniseert u de pellet met een micropipet van 1000 microliter door voorzichtig op en neer te zuigen. Zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan en herhaal de op- en neergaande aspiratie 10 tot 20 keer met een vooraf getrokken glazen pipet met de punt in contact met de conische onderkant van de buis totdat het mengsel doorschijnend is. Tel de cellen voordat je ze gelijkmatig verdeelt over een schaal van 3,5 centimeter met gekruiste schuddende bewegingen.

Als u klaar bent, plaatst u het gerecht in de incubator met 5% koolstofdioxide. Voeg voor fluorescerende immunostaining van 14 dagen in vitro cellen het monster met anti-NMDAR-antilichamen toe aan de dekkingsslips en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Behandel het monster na een uur met 4% formaldehyde en PBS als fixatieoplossing bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.

Was vervolgens de monsterstoot met PBS gedurende vijf minuten elk, gevolgd door toevoeging van secundaire antilichaamgeit anti-human Alexa Fluor 488 bij één tot 1000 verdunning gedurende één tot 1000 gedurende één uur bij kamertemperatuur. Monteer vervolgens de afdekslips met het monster met een vloeibaar montagemedium en zuig de resterende vloeistof op. Visualiseer de neuronen met fluorescentie beeldvorming.

Gebruik voor calcium beeldvorming 14 tot 18 dagen in vitro cellen die zijn gekweekt op cover slips. Behandel de cellen voorafgaand aan de beeldvorming met de virale vectorcodering voor pAAV2 CAG GCaMP 5G op 2,5 keer 10 tot de 10e genoomkopieën per milliliter gedurende vijf tot zeven dagen. Een dag voor beeldvorming incubeer de cellen met het patiëntmonster gedurende 24 uur.

Bereid op de beeldvormingsdag de opstelling voor en stel de microscoopcelkamer in op 37 graden Celsius. Vul de baan met gedestilleerd water, doordrenk het met 5% koolstofdioxide om de fysiologische omstandigheden van de cel te behouden. Nadat u de cellen hebt bedekt met een extracellulaire fysiologische oplossing, brengt u ze over naar de microscoopcelkamer.

Voeg 10 micromolaire NBQX toe om de AMPA- en KA-receptoren te blokkeren en visualiseer de NMDA-receptorrespons. Verkrijg de film van vier minuten met de frames die elke 100 milliseconden worden opgenomen. Kort na het starten van de acquisitie, voeg stimulatie-oplossing toe aan het gerecht.

Na stimulatie, extraheer het fluorescerende signaal in de loop van de tijd uit de cultuur geïncubeerd met de controle en de cerebrale spinale vloeistof van de patiënt of CSF-monsters met behulp van verwerkingssoftware zoals Image J.It werd waargenomen dat de cellen op één dag in vitro gelijkmatig verdeeld waren en zich aan de plaat hebben gehecht met een lamellen die zich rond het cellichaam ontwikkelen en kleine neurieten die zich beginnen uit te breiden. Na enkele dagen in cultuur strekten de neurieten zich over een korte afstand uit en vertoonden de cellen een significante polarisatie. Het neuronale netwerk bleef groeien en werd complex.

Na 18 dagen waren neuronen volwassen, onderling verbonden en bouwden ze het neuronale netwerk. De representatieve fluorescerende beelden tonen volwassen neuronen na 18 dagen met behulp van selectieve markers. Incubatie van de culturen met de patiëntmonsters produceerde een intens fluorescentiesignaal omdat het de auto-antilichamen bevat die de NMDA-receptor op het oppervlak van de neuronen herkenden.

Daarentegen produceerden de controlemonsters geen fluorescerend signaal wanneer ze aan de neuronale culturen werden toegediend. De toepassing van NMDA verhoogde de fluorescentie-intensiteit zoals aangegeven door een verandering in de intracellulaire groene fluorescentie. Wanneer de stimulator werd toegepast, vertoonden de neuronen die werden behandeld met het controle-csf-monster een hoger verschil in fluorescentie-intensiteit dan de cellen die werden behandeld met het CSF-monster van de patiënt.

De eigenschapsidentificatie en dissectie van de hippocampus bepalen de zuiverheid van de culturen. Cel is aggregatie is een belangrijke factor, vooral bij het gebruik van de culturen voor beeldvormingsdoeleinden. Bovendien kunnen gekweekte hippocampusneuronen worden gebruikt om nieuwe antilichamen en hun doelantigenen te identificeren in combinatie met immunoprecipitatie- en massaspectrometrietechnieken.

Deze techniek heeft de karakterisering van een nieuwe categorie antilichaamgemedieerde ziekten mogelijk gemaakt. Daarom is het essentieel in de studie van het nieuwe gebied van nano-immunologie.