Name: Isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Leer hoe je fosfoproteïnen isoleert uit muizenembryogehele cellysaten van gezichtsprocessen en gekweekte palatale mesenchymcellen. Deze methode behoudt fosforylering voor analyse van craniofaciale ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

129S4 muizen waren een geschenk van Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine op de berg Sinaï. Dit werk werd ondersteund met fondsen van de National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 en K02 DE028572 tot K.A.F., F31 DE029976 tot M.A.R. en F31 DE029364 tot B.J.C.D.

Alle procedures met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Colorado Anschutz Medical Campus en uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en voorschriften. Vrouwelijke 129S4-muizen op een leeftijd van 1,5-6 maanden en gehuisvest bij een subthermoneutrale temperatuur van 21-23 ° C werden gebruikt voor embryo-oogsten. Een schematische workflow van het protocol is weergegeven in figuur 1. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, apparatuur, software, reagentia en dieren die in dit protocol worden gebruikt.
1. Het oogsten van E11.5 muizenembryo's
<ol><li>Euthanaseer zwangere vrouwelijke muis 11,5 dagen na detectie van vaginale plug tijdens getimede paring in een CO2-kamer met behulp van IACUC-goedgekeurd CO2-debiet dat nodig is voor ongeveer 50% verplaatsing (2,95 l / min in een 360 in3 kamer) en duur van blootstelling (zie tabel met materialen). Voer cervicale dislocatie uit als een secundaire methode van euthanasie. Ga onmiddellijk over tot dissectie.</li>
	<li>Leg het muislichaam op een ontleedbord met de ventrale kant naar boven gericht. Spuit de muizenbuik in met 70% ethanol.</li>
	<li>Open de buikholte door de huidanterieur naar de vaginale opening te knijpen en op te tillen met een rechte Semken-tang en de opgetilde huid en onderliggende lagen te snijden met een rechte chirurgische schaar in een hoek van 45 ° aan weerszijden om een "V" -vorm te genereren die zich uitstrekt tot elk lateraal oppervlak ongeveer halverwege tussen de voorpoten en achterpoten.</li>
	<li>Pak met behulp van de Semken-tang een van de baarmoederhoorns vast en knip onder de eileider en boven de baarmoederhals met de chirurgische schaar. Snijd het mesometrium weg om de baarmoederhoorn volledig te kunnen verwijderen.</li>
	<li>Breng de ontleedde baarmoederhoorn over op 10 ml histologische fosfaatbuffered saline (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monobasisch, 10,14 mM Na2HPO4 dibasisch, pH 7,4] in een petrischaaltje van 10 cm.</li>
	<li>Verwijder de tweede baarmoederhoorn aan de andere kant van de buikholte volgens dezelfde procedure als beschreven in stap 1.4-1.5.</li>
	<li>Plaats de petrischaal van 10 cm met beide baarmoederhoorns op ijs als u niet onmiddellijk overgaat tot de dissectie van individuele embryo's (d.w.z. als een tweede vrouwelijke muis wordt ontleed).</li>
	<li>Ontleed onder een ontleedende stereomicroscoop zorgvuldig elk embryo uit de baarmoederhoorns met Dumont #5 fijne tang. Trek langzaam het myometrium, decidua en chorion weg. Scheur en verwijder het relatief transparante amnion rond het embryo en breek de navelstreng door die het embryo met de placenta verbindt.</li>
	<li>Breng elk ontleed embryo over op 2,5 ml histologie PBS in een individuele put van een 12-well celkweekplaat op ijs met behulp van een gesneden plastic transferpipet of een embryolepel. OPMERKING: Als u werkt met een nest dat embryo's van meer dan één genotype kan bevatten, bewaar dan het amnion rond elk embryo voor genotypering door elk in zijn eigen vooraf gelabelde 0,5 ml microcentrifugebuis op ijs te plaatsen.</li>
</ol>2. Ontleden van maxillaire processen van E11.5 muisembryo's
<ol><li>Bereid drie petrischalen van 10 cm met 10 ml histologie PBS en bewaar ze op ijs om te worden gebruikt in rotatie tussen embryo's.</li>
	<li>Breng één embryo uit een individuele put van de 12-well celkweekplaat over naar een van de 10 cm petrischalen met histologie PBS op ijs met behulp van een gesneden plastic transferpipet of een embryolepel.</li>
	<li>Scheid onder de ontleedmicroscoop elk maxillair proces van het gezicht met behulp van de fijne tang. Snijd eerst de voorste zijde van een maxillair proces langs de natuurlijke inkeping die het laterale nasale proces en het maxillaire proces scheidt (figuur 2A).</li>
	<li>Snijd ten tweede de achterste kant van het maxillaire proces langs de natuurlijke inkeping die het maxillaire proces en het mandibulaire proces scheidt (figuur 2A).</li>
	<li>Ten derde, om het maxillaire proces volledig te scheiden, maakt u een verticale snede van de voorste naar de achterste zijden van het maxillaire proces aan de oogzijde van het maxillaire proces waar de natuurlijke inkepingen waarnaar boven het uiteinde wordt verwezen (figuur 2A-C).</li>
	<li>Herhaal deze drie sneden voor het maxillaire proces aan de andere kant van het gezicht.</li>
	<li>Breng met behulp van een 9" Pasteur pipet met een kleine latexbol van 2 ml het ontlede paar maxillaire processen en een klein druppeltje van ongeveer 30 μL histologie PBS over naar een gelabelde petrischaal van 35 mm op ijs (figuur 2D).</li>
	<li>Volg stappen 2,3-2,7 voor elk embryo en draai de drie petrischalen van 10 cm met histologie PBS op ijs tussen embryo's. Plaats afzonderlijke paren van ontleedde maxillaire processen in afzonderlijke petrischalen van 35 mm op ijs. OPMERKING: Scheiding van het maxillaire proces ectoderm en mesenchym (stappen 2.9-2.17) kan worden uitgevoerd na het ontleden van de maxillaire processen van alle embryo's in het nest. Als intacte maxillaire processen die zowel het ectoderm als het mesenchym bevatten gewenst zijn, gaat u verder met stap 2.18 hieronder.</li>
	<li>Bereid 250 μL vers 2% trypsine in weefselkweek PBS en 250 μL 10% foetaal runderserum (FBS) in weefselkweek PBS en bewaar op ijs.</li>
	<li>Plaats een tweede, klein druppeltje van ongeveer 30 μL 2% trypsine in de 35 mm petrischaal gescheiden van het eerste, kleine druppeltje histologie PBS met de maxillaire processen. Breng het paar maxillaire processen over op het kleine druppeltje van 2% trypsine met behulp van het Pasteur-pipet (figuur 2D).</li>
	<li>Incubeer het gerecht op ijs gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Haal de 35 mm petrischaal van het ijs en leg deze onder de ontleedmicroscoop.</li>
	<li>Trek met behulp van de fijne tang langzaam en voorzichtig de laag ectoderm van elk maxillair proces af (figuur 2E). OPMERKING: Als het ectoderm niet scheidt van het mesenchym in een intacte plaat, incubeer dan in 2% trypsine bij kamertemperatuur (RT) gedurende maximaal 5 extra minuten voordat u doorgaat met scheiden. Als het weefsel begint te desintegreren in de 2% trypsine, verplaats dan de maxillaire processen naar de 10% FBS zoals hieronder beschreven om het trypsine te neutraliseren en de scheiding van het ectoderm en mesenchym te voltooien.</li>
	<li>Zodra het maxillaire proces ectoderm en mesenchym zijn gescheiden (figuur 2F), breng de gewenste weefsels van het paar maxillaire processen over naar een derde, kleine druppel van ongeveer 30 μL van 10% FBS - gescheiden van de twee vorige kleine druppeltjes - met behulp van de Pasteur pipet (figuur 2D).</li>
	<li>Plaats de 35 mm petrischaal op ijs om de trypsinisatie te stoppen.</li>
	<li>Incubeer de maxillaire procesweefsels op ijs in 10% FBS gedurende 1-2 minuten en breng vervolgens de weefsels van beide maxillaire processen over naar een vierde, kleine druppel van ongeveer 30 μL voorgekookte histologie PBS op ijs - gescheiden van de drie vorige kleine druppeltjes - met behulp van de Pasteur-pipet (figuur 2D).</li>
	<li>Incubeer de maxillaire procesweefsels in histologie PBS gedurende 1 minuut terwijl u de histologie PBS voorzichtig rond de maxillaire procesweefsels wervelt met de punt van de Pasteur-pipet om ervoor te zorgen dat alle FBS van het weefsel wordt gespoeld.</li>
	<li>Breng het paar maxillaire procesweefsels over naar een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs met behulp van de Pasteur-pipet, waardoor de overdracht van histologie PBS wordt geminimaliseerd. Verwijder overtollige histologie PBS in de microcentrifugebuis van 1,5 ml met de Pasteur pipet.</li>
	<li>Volg de bovenstaande stappen om de maxillaire processen van elk embryo in het nest te ontleden.</li>
	<li>Verwerk de monsters onmiddellijk om hele celeiwitlysaten (hieronder) te isoleren of langdurig bij -80 °C te bewaren. Voordat u deze langdurig opslaat, vriest u de microcentrifugebuis van 1,5 ml in een bad van 100% EtOH gedurende 5 minuten in op droogijs.</li>
</ol>3. Isoleren van hele cel eiwitlysaten van muis maxillaire processen
<ol><li>Als maxillaire processen eerder bij -80 °C werden ingevroren, ontdooi ze dan op ijs.</li>
	<li>Voeg 0,1 ml ijskoude NP-40 lysisbuffer (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; bewaard bij 4 °C) toe met protease- en fosfataseremmers (1x complete mini-proteaseremmercocktail [opgelost in water; bewaard bij -20 °C], 1 mM PMSF [opgelost in isopropanol; bewaard bij 4 °C], 10 mM NaF [bewaard bij -20 °C; vermijd bevriezing/dooi], 1 mM Na3VO4 [bewaard bij -20 °C], 25 mM β-glycerofosfaat [opgeslagen bij 4 °C]) toegevoegd onmiddellijk voor gebruik op ijs. OPMERKING: Celfractionering kan als alternatief worden uitgevoerd om cytoplasmatische, nucleaire, membraan- of mitochondriale eiwitfracties te isoleren.</li>
	<li>Pipetteer 10 keer op en neer met een pipetman van 200 μL.</li>
	<li>Vortex gedurende 10 s, en pipetteer dan 10 keer op en neer met een 200 μL pipetman. Vermijd het genereren van bubbels.</li>
	<li>Incubeer bij 4 °C gedurende 2 uur terwijl u het uiteinde over het uiteinde draait met behulp van een peddel van 1,5 ml /2 ml met een buis revolver.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters bij 13.500 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Verzamel het supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs met een pipetman van 200 ml.</li>
	<li>Kwantificeer de eiwitconcentratie met de eiwittestkit, met behulp van 10 μL eiwitlysaat + 10 μL NP-40 lysisbuffer voor experimentele monsters en 3-5 verdunningen van runderserumalbumine (fractie V) (BSA) in NP-40 lysisbuffer in een bereik van 0,25-2,0 mg / ml als eiwitstandaarden.</li>
	<li>Ga verder met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) (stap 5) of vries de resterende lysaten snel in op droogijs en bewaar op -80 °C langdurig.</li>
</ol>4. Isoleren van hele cel eiwitlysaten uit primaire en/of vereeuwigde muis embryonale palatale mesenchym (MEPM) cellen
OPMERKING: Isolatie en kweek van primaire MEPM-cellen van E13.5-muizenembryo's en onsterfelijke MEPM-cellen zijn eerder beschreven 32,33,34. Stimulatie van cellen met groeifactor (stappen 4.1-4.7) kan worden uitgevoerd voorafgaand aan cellysis. Als niet-gestimuleerde cellen gewenst zijn, ga dan verder met stap 4.8 hieronder.
<ol><li>Zuig het groeimedium [Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 50 U/ml penicilline, 50 μg/ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, 10% FBS] uit de MEPM-cellen bij ~70% confluentie in een celkweekschaal van 6 cm met behulp van een 5,75" Pasteur pipet bevestigd aan een vacuümsysteem.</li>
	<li>Was de cellen met 1 ml weefselkweek PBS.</li>
	<li>Voeg 3 ml serumafhongermedium [DMEM met 50 E/ml penicilline, 50 μg/ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, 0,1% FBS] toe, voorgewarmd in een waterbad van 37 °C.</li>
	<li>Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 23 uur.</li>
	<li>Vervang het serumverhongeringsmedium door 3 ml vers, voorverwarmd serumverhongeringsmedium.</li>
	<li>Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur.</li>
	<li>Stimuleer de cellen met de groeifactor van keuze in een empirisch bepaalde concentratie gedurende de gewenste tijdsduur.</li>
	<li>Zuig het medium uit de MEPM-cellen aan bij 80%-100% confluentie met behulp van een 5,75" Pasteur pipet bevestigd aan een vacuümsysteem.</li>
	<li>Was de cellen tweemaal met ijskoude weefselkweek PBS (1 ml voor een celkweekschaal van 6 cm); kantel de plaat tijdens de laatste wasbeurt opzij om ervoor te zorgen dat alle weefselkweek PBS wordt aangezogen.</li>
	<li>Lyseer de cellen door ijskoude NP-40 lysisbuffer met protease- en fosfataseremmers die vlak voor gebruik (0,1 ml voor een celkweekschaal van 6 cm) op ijs worden toegevoegd.</li>
	<li>Incubeer de plaat gedurende 5 minuten op ijs met rotatie ongeveer elke minuut om volledige dekking van de plaat te garanderen.</li>
	<li>Schraap de cellen van de plaat met behulp van een voorgekoelde cellifter en breng de celsuspensie over naar een voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs.</li>
	<li>Incubeer de celsuspensie bij 4 °C gedurende 30 minuten terwijl u uiteinde over uiteinde draait met behulp van een peddel van 1,5 ml / 2 ml met een buis revolver.</li>
	<li>Ga verder met de stappen 3.6-3.9 die hierboven zijn beschreven.</li>
</ol>5. Western blotting van hele cel eiwit lysaten uit muis gezichtsprocessen en/of MEPM cellen voor fosfoproteïnen
<ol><li>Bereid hele cel eiwit lysaat monsters voor SDS-PAGE.<ol>
<li>Bepaal de hoeveelheid eiwit die moet worden geladen, afhankelijk van de eiwitrijkdom in het weefsel / de cel; 12,5 μg is meestal voldoende voor robuust tot expressie gebrachte eiwitten in hele cel eiwitlysaten.</li>
		<li>Voeg een gelijk volume van 2x Laemmli buffer [20% glycerol, 4% SDS, 0,004% broomfenol blauw, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] toe met 10% β-mercaptoethanol toegevoegd direct voor gebruik. LET OP: β-mercaptoethanol is huid- of oogcorroserend, giftig, gevaarlijk bij inslikken en heeft aquatische toxiciteit. Draag handschoenen, een laboratoriumjas, gezichtsscherm en een veiligheidsbril in een chemische zuurkast. Weggooien volgens de richtlijnen voor milieuhygiëne en -veiligheid.</li>
		<li>Meng door vortexing.</li>
		<li>Verwarm de monsters gedurende 5 minuten op 100 °C in een minidroog bad.</li>
		<li>Meng door vortexing en plaats de monsters op ijs.</li>
		<li>Centrifugeer bij 9.400 × g gedurende 5 min bij 4 °C.</li>
		<li>Plaats de monsters kort op ijs voordat ze in SDS-PAGE-gel worden geladen of bewaar ze langdurig bij -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer SDS-PAGE uit met behulp van een elektroforesecel met een 4%-15% prefab eiwitgel en elektroforesebuffer35.</li>
	<li>Elektrotransfer van de eiwitten naar een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan met behulp van transferbuffer met 0%-20% methanol (0%-10% voor eiwitten groter dan 100 kDa; 20% voor eiwitten kleiner dan 100 kDa) toegevoegd onmiddellijk voor gebruik35.</li>
	<li>Blokkeer het membraan en sonde voor fosfoproteïne van belang.<ol>
<li>Was het membraan na overdracht gedurende 5 minuten in 1x tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] in een western blot box.</li>
		<li>Incubeer het membraan in 5 ml blokkeerbuffer [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% w/v BSA; goed gemengd en gefilterd door een 25 mm spuitfilter met 0,2 μm poriën met behulp van een 10 ml spuit met luerpunt] gedurende 1 uur in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker. OPMERKING: Gebruik melk niet als een blokkerend middel bij het karakteriseren van fosfoproteïnen, omdat het de fosfoproteïnecaseïne bevat, wat een hoog, niet-specifiek achtergrondsignaal kan veroorzaken.</li>
		<li>Was het membraan driemaal gedurende 5 minuten elk in TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.</li>
		<li>Incubeer het membraan in 5 ml primair antilichaam verdund in blokkerende buffer bij 4 °C 's nachts in een conische buis van 50 ml met behulp van een peddel van 50 ml met een buis revolver. OPMERKING: Raadpleeg de antilichaam datasheet voor de juiste concentratie voor western blotting.</li>
		<li>Was het membraan driemaal bij RT gedurende 5 minuten elk in TBS-T in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.</li>
		<li>Incubeer het membraan in 5 ml geschikte mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam verdund in blokkerende buffer gedurende 1 uur in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.</li>
		<li>Was het membraan driemaal gedurende 5 minuten elk in TBS-T in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.</li>
		<li>Incubeer het membraan in enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting substrate [mengen van gelijke volumes uit flessen 1 en 2; 0,5 ml van elk voor grote (8,6 cm x 6,7 cm) membranen] gedurende 1 minuut, zodat het hele membraan voortdurend wordt blootgesteld aan het ECL western blotting substraat.</li>
		<li>Giet het membraan van overtollig ECL western blotting substraat af en ontwikkel onmiddellijk met behulp van een chemiluminescentie imager.</li>
	</ol></li>
	<li>Strip het membraan en reprobe voor totaal eiwit van belang.<ol>
<li>Plaats het PVDF-membraan in een transparant zakje met polyethyleen voering met 5 ml strippingbuffer [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] met 8 μL/ml β-mercaptoethanol dat onmiddellijk voor gebruik wordt toegevoegd.</li>
		<li>Incubeer bij 50 °C gedurende 30 minuten met schommelen in een hybridisatieoven met 11 omwentelingen per minuut.</li>
		<li>Was het membraan driemaal bij RT gedurende 5 minuten elk in TBS-T in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.</li>
		<li>Ga verder met de stappen 5.4.2-5.4.9 die hierboven zijn beschreven.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantificeer western blot band dichtheden met behulp van ImageJ-software, normaliseren van de niveaus van het gefosforyleerde eiwit van belang tot de niveaus van het totale eiwit van belang36.</li>
</ol>

<ol><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palatogenesis%3A+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139 (2), 231-243 (2012).</li>
<li>Chai, Y., Ito, Y., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+and+its+functional+significance+in+regulating+the+fate+of+cranial+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oral+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells.</a> Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).</li>
<li>Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signalling+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22TheInternational+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">BMP signalling in craniofacial development.</a> TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinase+signaling%3A+regulating+neural+crest+development+one+phosphate+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time.</a> Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).</li>
<li>Xavier, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+receptor+function+during+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hedgehog receptor function during craniofacial development.</a> Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).</li>
<li>Grimsrud, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-6+is+an+autocrine+stimulator+of+chondrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).</li>
<li>MacArthur, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-8+isoforms+activate+receptor+splice+forms+that+are+expressed+in+mesenchymal+regions+of+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development.</a> Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).</li>
<li>Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf-8+determines+rostral-caudal+polarity+in+the+first+branchial+arch%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch.</a> Development. 126 (1), 51-61 (1999).</li>
<li>Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+gene+inactivation+demonstrates+that+FGF8+is+required+for+cell+survival+and+patterning+of+the+first+branchial+arch%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch.</a> Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).</li>
<li>Tabler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuz+mutant+mice+reveal+shared+mechanisms+between+ciliopathies+and+FGF-related+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes.</a> Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).</li>
<li>Pakvasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+Its+essential+roles+in+bone+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development.</a> Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).</li>
<li>Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-A+and+PDGFR-alpha+regulate+tooth+formation+via+autocrine+mechanism+during+mandibular+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro.</a> Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).</li>
<li>Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PDGF+receptor+mutation+in+the+mouse+%28Patch%29+perturbs+the+development+of+a+non-neuronal+subset+of+neural+crest-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells.</a> Development. 115 (1), 133-142 (1992).</li>
<li>Orr-Urtreger, A., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor-A+and+its+receptor+are+expressed+in+separate%2C+but+adjacent+cell+layers+of+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo.</a> Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).</li>
<li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Pdgfc+gene%3A+dynamic+expression+in+embryonic+tissues+during+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis.</a> Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li>
<li>He, F., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+PDGFRalpha+signaling+in+medial+nasal+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development.</a> PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).</li>
<li>Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 103 (2), 211-225 (2000).</li>
<li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX2-modifying+enzymes%3A+therapeutic+targets+for+bone+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases.</a> Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).</li>
<li>Firulli, B. A., Firulli, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+penetrant+cardiac+neural+crest+defects+in+Hand1+Phosphomutant+mice%3A+Dimer+choice+that+is+not+so+critical%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical.</a> Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).</li>
<li>Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1+regulates+phosphorylation+and+osteogenic+activity+of+Dlx3%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).</li>
<li>Jeong, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+phosphorylates+and+regulates+the+function+of+Dlx5%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).</li>
<li>Seo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin-dependent+kinase+II+regulates+Dlx5+during+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).</li>
<li>Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+in+craniofacial+development%3A+From+receptor+signaling+to+transcriptional+and+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).</li>
<li>Schock, E. N., LaBonne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+sox%3A+Diverse+roles+for+sox+transcription+factors+during+neural+crest+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development.</a> Frontiers in Physiology. 11, 606889(2020).</li>
<li>Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Srsf3+mediates+alternative+RNA+splicing+downstream+of+PDGFRalpha+signaling+in+the+facial+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme.</a> Development. 148 (14), (2021).</li>
<li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alternative+splicing+by+reversible+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).</li>
<li>Szabo, A., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neural crest migration.</a> Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).</li>
<li>Kindberg, A. A., Bush, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+boundary+formation+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and boundary formation in craniofacial development.</a> Genesis. 57 (1), 23271(2019).</li>
<li>Faundes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raine+syndrome%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Raine syndrome: an overview.</a> European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).</li>
<li>Bush, J. O., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-B1+forward+signaling+regulates+craniofacial+morphogenesis+by+controlling+cell+proliferation+across+Eph-ephrin+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries.</a> Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+immortalized+mouse+embryonic+palatal+mesenchyme+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line.</a> PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).</li>
<li>Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+time-lapse+imaging+of+primary+mouse+embryonic+palatal+mesenchyme+cells+to+analyze+collective+movement+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151(2021).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/">https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/</a> (2010).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K-mediated+PDGFRalpha+signaling+regulates+survival+and+proliferation+in+skeletal+development+through+p53-dependent+intracellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways.</a> Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+alteration+of+protein+phosphorylation+during+postmortem%3A+implication+in+the+study+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation.</a> Scientific Reports. 5, 15709(2015).</li>
<li>Sharma, S. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+of+phosphatase+inhibitors+during+Western+blotting+enhances+signal+detection+with+phospho-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies.</a> Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).</li>
<li>Bass, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+technical+considerations+for+Western+blotting+applications+to+physiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Medicine+%26+Science+in+Sports%22%5BJournal%5D)">An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research.</a> Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).</li>
<li>Hooper, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+facial+development%3A+contributions+of+ectoderm+and+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme.</a> Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).</li>
<li>Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+contains+a+platelet-derived+transforming+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serum contains a platelet-derived transforming growth factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).</li>
<li>Swaisgood, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+update+of+casein+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Review and update of casein chemistry.</a> Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).</li>
<li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fastest+Western+in+town%3A+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149(2014).</li>
<li>Salinovich, O., Montelaro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+staining+and+peptide+mapping+of+proteins+transferred+to+nitrocellulose+after+separation+by+sodium+dodecylsulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier beschreven protocol stelt onderzoekers in staat om kritische fosforyleringsafhankelijke signaleringsgebeurtenissen tijdens craniofaciale ontwikkeling op een robuuste en reproduceerbare manier te onderzoeken. Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol die zorgen voor een goede verzameling van gegevens en analyse van resultaten. Of het nu gaat om het isoleren van fosfoproteïnen van gezichtsprocessen van muizen en / of gekweekte palatale mesenchymcellen, het is noodzakelijk om snel en efficiënt te beweg...

Craniofaciale ontwikkeling bij zoogdieren is een complex morfologisch proces waarbij meerdere celpopulaties coördineren om het frontonasale skelet te genereren. Bij de muis begint dit proces op embryonale dag (E) 9,5 met de vorming van de frontonasale prominentie en paren van maxillaire en mandibulaire processen, die elk post-migrerende craniale neurale crestcellen bevatten. De laterale en mediale nasale processen ontstaan uit de frontonasale prominentie met het verschijnen van de neusputten en smelten uiteindelijk samen tot de neusgaten. Verder smelten de mediale neusprocessen en maxillaire processen samen om de bovenlip te genereren. Tegelijkertijd wordt palatogenese geïnitieerd met de vorming van verschillende uitwassen - de secundaire palatale planken - van de orale kant van de maxillaire processen bij E11.5. Na verloop van tijd groeien de palatale planken aan weerszijden van de tong naar beneden, verheffen zich tot een tegengestelde positie boven de tong en smelten uiteindelijk samen aan de middellijn om een continu gehemelte te vormen dat de neus- en mondholten scheidt door E16.51.
Deze morfologische veranderingen gedurende de craniofaciale ontwikkeling worden geïnitieerd en ondersteund door verschillende signaalinteracties, waaronder vaak eiwitfosforylatie door kinasen. Celmembraanreceptoren, zoals subfamilies van transformerende groeifactor (TGF)-β receptoren, waaronder botmorfogenetische eiwitreceptoren (BMPRs) en verschillende receptor tyrosinekinase (RTK) families, worden bijvoorbeeld autofosforyleerd op ligandbinding en activering in craniale neurale crestcellen 2,3,4 . Bovendien wordt de G-eiwit-gekoppelde transmembraanreceptor Smoothened gefosforyleerd in craniale neurale crestcellen en craniofacial ectoderm stroomafwaarts van Sonic hedgehog (SHH) ligandbinding aan de Patched1-receptor, wat resulteert in gladgestreken accumulatie op het ciliaire membraan en SHH-routeactivering5. Dergelijke ligand-receptor interacties kunnen optreden via autocriene, paracriene en / of juxtacrine signalering in craniofaciale contexten. Van BMP6 is bijvoorbeeld bekend dat het op een autocriene manier signaleert tijdens chondrocytendifferentiatie6, terwijl fibroblastgroeifactor (FGF) 8 wordt uitgedrukt in het faryngeale boogectoderm en bindt aan leden van de FGF-familie van RTK's uitgedrukt in het faryngeale boogmes mesenchym op een paracriene manier om patroonvorming en uitgroei van de faryngeale bogen te initiëren7, 8,9,10. Bovendien wordt Notch-signalering geactiveerd in zowel chondrocyten als osteoblasten tijdens craniofaciale skeletontwikkeling door juxtacrine-signalering wanneer transmembraandelta en / of gekartelde liganden binden aan transmembraan Notch-receptoren op naburige cellen, die vervolgens worden gesplitst en gefosforyleerd11. Er zijn echter andere ligand- en receptorparen die belangrijk zijn voor craniofaciale ontwikkeling die de flexibiliteit hebben om te functioneren in zowel autocriene als paracriene signalering. Tijdens morfogenese van muizentanden is bijvoorbeeld aangetoond dat van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF)-AA-ligand op een autocriene manier signaleert om de RTK PDGFRα in het glazuurorgaanepitheelte activeren 12. Daarentegen worden bij muriene gezichtsprocessen tijdens de zwangerschap transcripten die coderen voor de liganden PDGF-AA en PDGF-CC uitgedrukt in het craniofaciale ectoderm, terwijl de PDGFRα-receptor wordt uitgedrukt in het onderliggende craniale neurale crest-afgeleide mesenchym, wat resulteert in paracriene signalering 13,14,15,16,17 . Ongeacht het signaleringsmechanisme resulteren deze receptorfosforylatiegebeurtenissen vaak in de rekrutering van adaptoreiwitten en / of signaalmoleculen, die vaak zelf gefosforyleerd worden om intracellulaire kinasecascades te initiëren, zoals de mitogeen-geactiveerde eiwitkinase (MAPK) -route18,19.
De terminale intracellulaire effectoren van deze cascades kunnen vervolgens een reeks substraten fosforyleren, zoals transcriptiefactoren, RNA-binding, cytoskeletale en extracellulaire matrixeiwitten. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 en Sox926 behoren tot de transcriptiefactoren die gefosforyleerd zijn in de context van craniofaciale ontwikkeling. Deze posttranslationele modificatie (PTM) kan direct van invloed zijn op de gevoeligheid voor alternatieve PTM's, dimerisatie, stabiliteit, splitsing en/of DNA-bindende affiniteit, naast andere activiteiten 20,21,25,26. Bovendien wordt het RNA-bindende eiwit Srsf3 gefosforyleerd in de context van craniofaciale ontwikkeling, wat leidt tot zijn nucleaire translocatie27. Over het algemeen is aangetoond dat fosforylering van RNA-bindende eiwitten hun subcellulaire lokalisatie, eiwit-eiwitinteracties, RNA-binding en / of sequentiespecificiteitbeïnvloedt 28. Bovendien kan fosforylering van actomyosine leiden tot cytoskeletale herschikkingen gedurende de craniofaciale ontwikkeling29,30, en fosforylering van extracellulaire matrixeiwitten, zoals kleine integrinebindende ligand N-gebonden glycoproteïnen, draagt bij aan biomineralisatie tijdens de ontwikkeling van het skelet31. Door het bovenstaande en tal van andere voorbeelden is het duidelijk dat er brede implicaties zijn voor eiwitfosforylering tijdens craniofaciale ontwikkeling. Door een extra niveau van regulatie toe te voegen, wordt eiwitfosforylering verder gemoduleerd door fosfatasen, die kinasen tegengaan door fosfaatgroepen te verwijderen.
Deze fosforyleringsgebeurtenissen op zowel het receptor- als effectormolecuulniveau zijn van cruciaal belang voor de voortplanting van signaalroutes en resulteren uiteindelijk in veranderingen in genexpressie in de kern, waardoor specifieke celactiviteiten worden aangedreven, zoals migratie, proliferatie, overleving en differentiatie, die resulteren in de juiste vorming van het zoogdiergezicht. Gezien de contextspecificiteit van eiwitinteracties met kinasen en fosfatasen, de resulterende veranderingen in PTM's en hun effecten op celactiviteit, is het van cruciaal belang dat deze parameters worden bestudeerd in een fysiologisch relevante omgeving om volledig inzicht te krijgen in de bijdrage van fosforyleringsgebeurtenissen aan craniofaciale ontwikkeling. Hier worden voorbeelden gegeven van twee contexten waarin fosforylering van eiwitten en dus activering van signaalroutes tijdens de craniofaciale ontwikkeling van zoogdieren moet worden bestudeerd: gezichtsprocessen van muizen, in het bijzonder E11,5 maxillaire processen, en gekweekte embryonale palatale mesenchymcellen van muizen afgeleid van E13.5 secundaire palatale planken - zowel primaire32 als vereeuwigde33 . Bij E11.5 zijn de maxillaire processen in het proces van versmelting met de laterale en mediale nasale processen1, waardoor een kritisch tijdspunt wordt weergegeven tijdens de craniofaciale ontwikkeling van de muis. Verder werden hier maxillaire processen en cellen afgeleid van de palatale planken gekozen omdat de laatste structuren derivaten zijn van de eerste, waardoor onderzoekers de mogelijkheid krijgen om eiwitfosforylatie in vivo en in vitro in gerelateerde contexten te ondervragen. Dit protocol is echter ook van toepassing op alternatieve gezichtsprocessen en ontwikkelingstijdpunten.
Een cruciaal probleem bij het bestuderen van gefosforyleerde eiwitten is dat ze gemakkelijk worden gedefosforyleerd tijdens eiwitisolatie door overvloedige omgevingsfosfatasen. Om deze barrière te overwinnen, worden aanpassingen en aanpassingen aan standaard laboratoriummethoden besproken die isolatie van gefosforyleerde eiwitten mogelijk maken. Daarnaast worden best practices gegeven voor een goede analyse en kwantificering van gefosforyleerde eiwitten. Deze technieken, met name in combinatie met farmacologische remmers en/of muriene genetische modellen, kunnen worden gebruikt om meer inzicht te krijgen in de dynamiek en rollen van verschillende signaalroutes die actief zijn tijdens de craniofaciale ontwikkeling.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Block voor mini droge bad</td><td>Research Products International Corp</td><td>400783</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+ beeldvormingssysteem met Image Lab software</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td>chemiluminescentie imager</td></tr><tr><td>CO2 incubator, luchtmantel</td><td>VWR</td><td>10810-902</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiebord, 11 x 13 inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>09 002 12</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforese cel, 4-gel, voor mini voorgegoten gels met mini trans-blot module</td><td>Bio-Rad</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisatie oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5415 D met F45-24-11 rotor (Eppendorf)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z604062</td><td></td></tr><tr><td>Mini droge bad</td><td>Research Products International Corp</td><td>400780</td><td></td></tr><tr><td>Orbitale shaker</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>VWR</td><td>89231-662</td><td></td></tr><tr><td>Voeding voor SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Rechthoekige ijslade, maxi 9 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-093</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 508 stereomicroscoop met standaard K LAB, LED-ringlicht</td><td>Zeiss</td><td>4350649020000000</td><td>dissectiemicroscoop</td></tr><tr><td>Timer</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td></td></tr><tr><td>Buis revolver</td><td>Fisher Scientific</td><td>11 676 341</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02 215 414</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>VWR</td><td>89501-472</td><td></td></tr><tr><td>Western blot box</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9358182</td><td></td></tr><tr><td>Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur schalen, 6 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur platen, 12 well</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>Cel lifters</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD USP50</td><td></td></tr><tr><td>Conische buizen, polypropyleen, 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fijne pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Embryo lepel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen, 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>89000-010</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen, 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet, 5,75"</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet, 9"</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen, 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen, 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>Zakjes, transparant, polyethyleen voering</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-25B</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membraan</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Semken pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Kleine latex klep, 2 mL</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Spuit met luer-tip, 10 mL</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>Western blot cassette opening hendel</td><td>Bio-Rad</td><td>4560000</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann 3MM chr chromatografie papier</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-15% Voorgegoten eiwit gels, 10-wel, 30 &micro;L</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glycerofosfaat dinatriumzouthydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5422-25G</td><td>stock concentratie 1 M</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine, fractie V, hitteschok getest</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenolblauw</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC403140050</td><td></td></tr><tr><td>Complete mini protease remmer cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11836153001</td><td>stock concentratie 25x</td></tr><tr><td>DC protein assay kit II</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>E7, muis monoklonaal bèta tubuline primaire antilichaam, concentraat 0,1 mL</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>E7</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>ECL western blotting substraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI32106</td><td>lage picogram reeks</td></tr><tr><td>ECL western blotting substraat</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-302B</td><td>lage femtogram reeks</td></tr><tr><td>Elektroforese buffer, 5 L</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>stock concentratie 10x</td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof, 1 gallon</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2705HC</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur, Di Na zout dihydr. (kristallijn poeder/elektrofor.)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum, gekarakteriseerd, US oorsprong, 500 mL</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol (gecertificeerd ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>HRP-geconjugeerd secundair antilichaam, geit anti-muis IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>115-035-146</td><td>1:20.000</td></tr><tr><td>HRP-geconjugeerd secundair antilichaam, geit anti-konijn IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-003</td><td>1:20.000</td></tr><tr><td>Zoutzuur oplossing, 6N (gecertificeerd)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA56-500

isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Craniofaciale ontwikkeling bij zoogdieren is een complex morfologisch proces waarbij meerdere celpopulaties coördineren om het frontonasale skelet te genereren. Deze morfologische veranderingen worden geïnitieerd en in stand gehouden door verschillende signaalinteracties, waaronder vaak eiwitfosforylering door kinasen. Hier worden twee voorbeelden gegeven van fysiologisch relevante contexten waarin fosforylering van eiwitten tijdens de craniofaciale ontwikkeling van zoogdieren kan worden bestudeerd: gezichtsprocessen van muizen, in het bijzonder E11.5 maxillaire processen, en gekweekte embryonale palatale mesenchymcellen van muizen afgeleid van E13.5 secundaire palatale planken. Om de gemeenschappelijke barrière van defosforylering tijdens eiwitisolatie te overwinnen, worden aanpassingen en wijzigingen aan standaard laboratoriummethoden besproken die isolatie van fosfoproteïnen mogelijk maken. Daarnaast worden best practices verstrekt voor een goede analyse en kwantificering van fosfoproteïnen na western blotting van hele cel eiwitlysaten. Deze technieken, met name in combinatie met farmacologische remmers en/of murine genetische modellen, kunnen worden gebruikt om meer inzicht te krijgen in de dynamiek en rollen van verschillende fosfoproteïnen die actief zijn tijdens craniofaciale ontwikkeling.

Bij pogingen om de fosforylering van eiwitten geïsoleerd uit gezichtsprocessen van muizen en/of gekweekte palatale mesenchymcellen te karakteriseren, zullen de representatieve resultaten idealiter een duidelijke, reproduceerbare band onthullen na western blotting met een antifosfoproteïne-antilichaam dat op of nabij de hoogte van de overeenkomstige totale eiwitband loopt (figuur 3 ). Als er echter uitgebreide fosforylering van het eiwit optreedt, kan er een lichte opwaartse verschuiving van ...

Het protocol presenteert een methode voor het isoleren van hele cel eiwitlysaten van ontleedde muis embryo gezichtsprocessen of gekweekte muis embryonale palatale mesenchym cellen en het uitvoeren van daaropvolgende western blotting om gefosforyleerde eiwitniveaus te beoordelen.

Isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Dit protocol kan worden gebruikt om meer inzicht te krijgen in de dynamiek en rollen van fosfoproteïnen die actief zijn tijdens de craniofaciale ontwikkeling van zoogdieren. Dit protocol overwint de gemeenschappelijke barrière van defosforylering tijdens eiwitisolatie uit twee fysiologisch relevante contexten, gezichtsbehandelingen van muizen en gekweekte embryonale palatale mesenchymcellen van muizen. Het is absoluut noodzakelijk om snel te handelen terwijl alle reagentia en materialen op ijs worden gehouden en om fosfataseremmers in alle lysisbuffers te gebruiken om de integriteit van gefosforyleerde eiwitten te behouden.Om te beginnen legt u het muizenlichaam op een ontleedplaat met de ventrale kant naar boven gericht en spuit u de buik van de muis met 70% ethanol. Open vervolgens de buikholte door de huid voorste naar de vaginale opening te knijpen en op te tillen met een rechte Semken-tang. Knip vervolgens de gelifte huid in onderliggende lagen met een rechte meschirurgische schaar in een hoek van 45 graden aan weerszijden om een V-vorm te genereren die zich uitstrekt tot elk lateraal oppervlak ongeveer halverwege tussen de vier ledematen en achterpoten.Pak met behulp van de Semken-tang een van de baarmoederhoorns vast en knip onder de eileider en boven de baarmoederhals met een chirurgische schaar. Om volledige verwijdering van de baarmoederhoorn mogelijk te maken, snijdt u het mesometrium weg en brengt u vervolgens de ontlede baarmoederhoorn over naar 10 milliliter histologie PBS in een petrischaal van 10 centimeter. Verwijder op dezelfde manier de tweede baarmoederhoorn aan de andere kant van de buikholte.Leg daarna de petrischaal van 10 centimeter met beide baarmoederhoorns op ijs. Onder een ontleedbare stereomicroscoop ontleedt u elk embryo zorgvuldig uit de baarmoederhoorns met Dumont 5 fijne tangen. Trek vervolgens langzaam het myometrium, decidua en chorion weg.Scheur en verwijder vervolgens het relatief transparante amnion rond het embryo en breek de navelstreng door die het embryo met de placenta verbindt. Breng vervolgens elk ontleed embryo over naar 2,5 milliliter histologie PBS in een individuele put van een 12-well celkweekplaat op ijs met behulp van een gesneden plastic transferpipet. Bereid drie petrischalen van 10 centimeter met 10 milliliter histologie PBS en bewaar ze op ijs om te worden gebruikt in rotatie tussen embryo's.Breng vervolgens een embryo over van een individuele put van de 12-well celkweekplaat naar een van de 10 centimeter petrischalen met histologie PBS op ijs met behulp van een gesneden plastic transferpipet. Onder de ontleedmicroscoop scheidt u elk maxillair proces van het gezicht met behulp van de fijne tang door eerst een snede te maken aan de voorste kant van een maxillair proces langs de natuurlijke inkeping die het laterale neusproces scheidt in het maxillaire proces. Snijd vervolgens de achterste kant van het maxillaire proces langs de natuurlijke inkeping die het maxillaire proces en het mandibulaire proces scheidt.Scheid vervolgens het maxillaire proces volledig door een verticale snede te maken van de voorste naar de achterste zijden van het maxillaire proces aan de oogzijde van het maxillaire proces waar de natuurlijke inkepingen waarnaar boven wordt verwezen, eindigen. Gebruik een negen inch Pasteur pipet met een twee milliliter kleine latex bol, breng het ontleedde paar maxillaire processen over in een kleine druppel van ongeveer 30 microliter histologie PBS naar een gelabelde 35 millimeter petrischaal op ijs. Breng vervolgens het paar maxillaire procesweefsels over naar een gelabelde 1,5 milliliter microcentrifugebuis op ijs met behulp van de Pasteur-pipet, waardoor de overdracht van histologie PBS wordt geminimaliseerd.Verwijder verder overtollige histologie PBS in de microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met de Pasteur-pipet. Voeg 0,1 milliliter ijskoude NP40-lysisbuffer toe met protease- en fosfataseremmers die onmiddellijk voor gebruik op ijs zijn toegevoegd. Pipetteer vervolgens 10 keer op en neer met een PIPETMAN van 200 microliter.Vervolgens vortex gedurende 10 seconden en pipet vervolgens 10 keer op en neer met een PIPETMAN van 200 microliter, terwijl het genereren van bellen wordt vermeden. Incubeer twee uur bij vier graden Celsius terwijl je end-over-end draait met behulp van een peddel van 1,5 milliliter of twee milliliter met een buis revolver. Centrifugeer vervolgens de monsters op 13,500 x g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant tot een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis op ijs met een 200 milliliter PIPETMAN.Aspirateer eerst het medium uit de embryonale palatale mesenchymcellen van de muis met behulp van een 5,75 inch Pasteur-pipet die aan een vacuümsysteem is bevestigd. Was de cellen vervolgens twee keer met ijskoude weefselkweek PBS en kantel de plaat opzij tijdens de laatste wasbeurt om ervoor te zorgen dat alle weefselkweek PBS wordt geaspireerd. Voeg vervolgens ijskoude NP40-lysisbuffer toe met protease- en fosfataseremmers die onmiddellijk voor gebruik op ijs zijn toegevoegd om de cellen te lyseren.Incubeer de plaat gedurende vijf minuten op ijs met rotatie ongeveer elke minuut om volledige dekking van de plaat te garanderen. Schraap vervolgens de cellen van de plaat met behulp van een voorgekoelde cellifter en breng de celsuspensie over naar een voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter op ijs. Incubeer daarna de celsuspensie op vier graden Celsius gedurende 30 minuten terwijl u end-over-end draait met behulp van een peddel van 1,5 milliliter of twee milliliter met een buis revolver.Centrifugeer vervolgens de monsters op 13,500 x g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant tot een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis op ijs met een 200 milliliter PIPETMAN. Western blot-analyse van hele cellysaten van vereeuwigde embryonale mesenchymcellen van muizen na stimulatie met PDFG-B-ligand van 2 tot 15 minuten onthulde verschillende reproduceerbare banden voor fosfoproteïnen die op of in de buurt van de hoogte van de overeenkomstige totale eiwitband lopen. Een toename van fosfoproteïnebandintensiteiten werd waargenomen bij behandeling met een groeifactor in vergelijking met die van onbehandelde cellen, terwijl de totale eiwitbandintensiteiten relatief gelijk waren tussen monsters.Dit protocol kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe verstoringen en fosforylering direct intercellulaire signalering, genexpressie en cellulaire activiteit in craniofaciale contexten beïnvloeden.

isolation-whole-cell-protein-lysates-from-mouse-facial-processes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

The video demonstrates the analysis of the palmitoylation state of cell membrane proteins isolated from mouse brain tissue. The process involves exposing the non-palmitoylated cysteines and blocking them, then using a polymer that binds to the palmitoylated cysteines, aiding in assessing the palmitoylation state of the isolated proteins.

Assessing the Palmitoylation State of Cell Membrane Proteins from Mouse Brain Tissue

Een protocol voor het scheiden van embryo gezichts ectoderm en mesenchym beschreven. We gebruiken Dispase II om eerst te behandelen hele embryo's, hele gezicht protuberansen ontleden, en dan scheiden de gezichts-ectoderm en mesenchym.

Scheiding van muis embryonale Facial ectoderm en mesenchym

Proteomische analyse van elk celtype is sterk afhankelijk van zowel de zuiverheid als de pre-fractionering van het uitgangsmateriaal om het monster te de-complexificeren vóór vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (MS). Door gebruik te maken van back-flushingtechnieken kunnen pure spermatozoa worden verkregen van knaagdieren. Na vertering kunnen fosfopeptiden worden verrijkt met behulp van TiO2.

Fosfopeptide Analyse van knaagdieren Epididymal Spermatozoa

De analyse van eiwitexpressie in jonge embryonale muiskleppen is belemmerd door het beperkte beschikbare weefsel. Dit manuscript biedt een protocol voor het bereiden van eiwitten uit zich ontwikkelende embryonale muisklepgebieden voor western blot-analyse.

Eiwit Isolatie van het ontwikkelen van embryonale Mouse Heart Valve Gewest

In deze methode presenteren wij biochemische procedures voor snelle en efficiënte isolatie van intermediaire filament (IF) eiwitten uit meerdere muisweefsels. Geïsoleerde IF's kunnen worden gebruikt om veranderingen te onderzoeken in post-translatie modificaties door massaspectrometrie en andere biochemische analyses.

Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties

Dit protocol beschrijft hoe de huid keratinocyten van Muismodellen te isoleren, te vlekken met metaal-gelabelde antilichamen, en om bevlekte cellen te analyseren door massa cytometrie om het patroon van de expressie van eiwitten van belang in de verschillende celcyclus fasen profiel.

Isolatie en kleuring van de muis huid keratinocyten voor celcyclus specifieke analyse van cellulaire eiwit expressie door massa Cytometrie

We presenteren een protocol voor isolatie en kweek van primaire muisembryogene palatale mesenchymale cellen voor time-lapse beeldvorming van tweedimensionale (2D) groei- en wondhersteltests. We bieden ook de methodologie voor de analyse van de time-lapse beeldvormingsgegevens om de vorming van celstromen en directionele beweeglijkheid te bepalen.

Isolatie en time-lapse beeldvorming van primaire muisembryo's van palatale mesenchymcellen om collectieve bewegingskenmerken te analyseren

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en cultuur van orale keratinocyten afgeleid van het volwassen muizengehemelte. Een evaluatiemethode met behulp van immunostaining wordt ook gemeld.

Isolatie en kweek van primaire orale keratinocyten uit het volwassen muizengehemelte

Dit protocol presenteert twee technieken om de subcellulaire compartimenten van muizenstaaffotoreceptoren te isoleren voor eiwitanalyse. De eerste methode maakt gebruik van levend retinae en cellulosefilterpapier om de buitenste segmenten van de staaf te scheiden, terwijl de tweede gebruik maakt van gelyofiliseerd netvlies en plakband om de binnenste en buitenste segmentlagen van de staaf weg te pellen.

Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse

Het huidige protocol beschrijft monstervoorbereiding en gegevensanalyse om eiwitfosforylering te kwantificeren met behulp van een verbeterde single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

Een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering

Hier presenteren we een protocol voor de verrijking van endogene fosfoproteïnefosfatasen en hun interagerende eiwitten uit cellen en weefsels en hun identificatie en kwantificering door op massaspectrometrie gebaseerde proteomica.

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Leer hoe je fosfoproteïnen isoleert uit muizenembryogehele cellysaten van gezichtsprocessen en gekweekte palatale mesenchymcellen. Deze methode behoudt fosforylering voor analyse van craniofaciale ontwikkeling.

Isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse (Video) | JoVE Journal

Isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse

Meer video's verkennen