Name: Meting van eiwitomloopsnelheden in senescente en niet-delende gekweekte cellen met metabole etikettering en massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Leer eiwitomloopsnelheden meten in senescente en niet-delende cellen met behulp van pulsed SILAC en massaspectrometrie. Deze methode biedt inzicht in proteostase en verouderingsmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) en het Intramural Research Program (IRP), National Institute on Aging (NIA). N.B. werd ondersteund door Longevity Impetus Grants en het Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.

De auteurs hebben geen onthullingen.

pSILAC is een krachtige techniek die de wereldwijde kwantificering van eiwitomloopsnelheden over meerdere cellulaire omstandigheden mogelijk maakt. Dit artikel beschrijft het gebruik van pSILAC om globale eiwithalfwaardetijden tussen senescente en rustige cellen te vergelijken, inclusief instructies voor de bereiding van senescente en rustige cellen, SILAC-etikettering en -oogst, en uiteindelijk analyse met behulp van DDA-massaspectrometrie. Daarnaast wordt een tweestapstest beschreven voor validatie van het senescentiefenotype met behulp van SA-βGal en RT-qPCR-analyse van een panel van mRNA's die coderen voor senescentie-geassocieerde eiwitten. Naast validatie van senescentie met de twee beschreven benaderingen, kan een derde validatie van senescentie worden uitgevoerd na massaspectrometrie-analyse door te zoeken naar veranderingen in bekende senescentiemarkers tussen senescente en rustige cellen op proteomisch niveau. Senescentie-geassocieerde eiwitten die naar verwachting verhoogd zijn, zijn onder andere p16, p21 en BCL2, elders beschreven 44,45. In het hierboven beschreven protocol werd ioniserende straling gebruikt voor de inductie van senescentie en serumuithongering voor rustige cellen. Voor de inductie van senescentie zijn er meerdere opties beschikbaar en er is een aanzienlijke heterogeniteit tussen hen 41,42,46. Momenteel is er geen senescente methode die als de "meest fysiologische" wordt beschouwd, dus de keuze van de senescente inductor is grotendeels gebaseerd op de context van het experiment. Experimenten met het doel om een algemeen fenomeen over senescentie te verklaren, worden echter aanbevolen om ten minste twee verschillende senescente inductoren te gebruiken. Het bespreken van het bereik van senescentieparadigma's valt buiten het bestek van dit artikel, maar enkele veelgebruikte methoden om senescentie te induceren, omvatten het veroorzaken van DNA-schade (IR, doxorubicine, replicatieve uitputting), het tot expressie brengen van oncogene eiwitten (HRAS, BRAF) en het verstoren van de mitochondriale functie2.
Naast de keuze van de senescente inductor is de keuze van controlecellen een even belangrijke overweging. Senescente cellen zijn per definitie onder onbepaalde groeistilstand, dus een vergelijking met andere groei-gestopte cellen wordt vaak gekozen. Voor pSILAC hebben cellen die de celcyclus hebben gestuit, over het algemeen de voorkeur omdat ze zich niet repliceren en dus gemakkelijker te gebruiken zijn voor berekeningen van de halfwaardetijd van eiwitten47. Omdat gekweekte cellen echter vaak enkele delende cellen behouden, is het belangrijk dat de methoden die worden gebruikt om celcyclusstilstand te induceren een zo homogeen mogelijke respons produceren om fouten van cellen die zich nog steeds vermenigvuldigen te minimaliseren. Om eiwitafbraaksnelheden voor fietsende cellen te berekenen met behulp van pSILAC zijn aanvullende berekeningen nodig om te compenseren voor de snelheid waarmee eiwit wordt verdund in dochtercellen27. De rustige groeistop zelf is echter niet zonder complicaties. Er zijn twee algemene methoden voor celcyclusstilstand: serumdeprivatie en contactremming48. Niet alle cellen kunnen rustig worden gemaakt door contactremming, hoewel van sommige fibroblasten is aangetoond dat ze rust vertonen na enkele dagen kweken49. Deze methode gebruikte serumdeprivatie omdat het vaker wordt gebruikt voor vergelijkingen van senescente cellen, hoewel het vereist dat de senescente cel op dezelfde manier serumarm is voor nauwkeurige vergelijkingen. Serum activeert het mTOR-complex en dus heeft serumdeprivatie verschillende stroomafwaartse effecten op de cel naast celcyclusstilstand50. Met name is aangetoond dat senescente cellen een verminderde SASP vertonen bij serumdeprivatie of mTOR-remming51,52.
Een ander belangrijk punt om te overwegen in pSILAC is hoeveel tijdspunten te testen. Dit protocol verzamelde cellen op een enkel tijdstip (3 dagen lichte of zware etikettering), wat de resulterende analyse aanzienlijk vereenvoudigt. De keuze van het tijdstip moet gebaseerd zijn op het doel van het experiment. Voor wereldwijde analyse wordt verwacht dat 3 dagen een meerderheid van eiwitten zal vangen, hoewel halfwaardetijden voor kortlevende eiwitten die binnen 3 dagen volledig omzet (alle lichtsignalen gaan verloren) op dit moment niet kunnen worden gemeten. Omgekeerd zijn langlevende eiwitten met zeer weinig omzet in 3 dagen ook moeilijk te kwantificeren en lijken ze vaak extreem grote halfwaardetijden te hebben (in de orde van weken) die meestal slechts een gevolg zijn van zeer weinig zware signaalaccumulatie. Vanwege de niet-lineaire relatie in de verhouding tussen zware en lichte peptidesignalen en het percentage nieuw gesynthetiseerde eiwitten op kortere en langere tijdspunten, kan de kwantificering van halfwaardetijden worden verbeterd door extra labelingtijdpunten toe te voegen. Voor relatieve vergelijkingen tussen twee celtoestanden, zoals in dit protocol, kan een geschatte halfwaardetijd voldoende zijn, maar extra tijdspunten kunnen worden gebruikt om de kwantitatieve nauwkeurigheid te verbeteren.
Dit protocol beschrijft hoe een ongerichte DDA-gebaseerde analyse van eiwitomzet wordt uitgevoerd. De eiwitomzetberekeningen kunnen echter in het algemeen worden toegepast op elk acquisitieschema dat in staat is om de relatieve abundantie van zware en lichte peptideparen af te leiden. Ms2-gebaseerde methoden zoals data-independent acquisition (DIA/SWATH) kunnen bijvoorbeeld ook worden toegepast voor de berekening van omloopsnelheden met succes53. Bovendien kunnen andere instrumentatie- en softwarepijplijnen dan die beschreven in dit protocol worden gebruikt om DDA-analyse, eiwitidentificatie en eiwitkwantificering uit te voeren. Bij het gebruik van softwareplatforms voor eiwitkwantificering zoals Skyline om peptidepiekgebieden te extraheren, is het raadzaam om geëxtraheerde ionchromatogrammen handmatig in de documentwerkruimte te inspecteren, pieken te identificeren die ten onrechte waren geïntegreerd en niet-kwantitatieve pieken en het document dienovereenkomstig te beheren. Een uitgebreide verzameling tutorials is online beschikbaar voor Skyline (skyline.ms).
pSILAC vertegenwoordigt een van de meest ideale methoden voor wereldwijde kwantificering van eiwithalfwaardetijden in gekweekte cellen vanwege superieure multiplexing (proteoomdekking) en doorvoer. Hoewel pSILAC geen directe synthese- of afbraaksnelheden biedt, omdat de verandering in licht en zwaar signaal te wijten is aan een samenloop van factoren, is pSILAC zeer nuttig voor vergelijkingen tussen omstandigheden en verschillende celtypen. Low-throughput-methoden vallen vaak in twee soorten: 1) behandeling van cellen met cycloheximide om eiwitsynthese te blokkeren en te oogsten met tijdsintervallen na toevoeging om verval te controleren, of 2) behandeling van cellen met een remmer van eiwitverval en oogst met tijdsintervallen na toevoeging om de accumulatie van eiwitten te controleren, waardoor eiwitvervalsnelheden worden afgeleid. De beperking van beide methoden is dat dergelijke behandelingen onvermijdelijk aanzienlijke veranderingen in de cellulaire fysiologie zullen veroorzaken. PSILAC vereist daarentegen geen substantiële interventie en heeft theoretisch geen detecteerbare effecten op de cellulaire fysiologie, omdat isotopische aminozuren slechts één neutron verschillen van hun niet-isotopische tegenhangers. De hier beschreven methode voor pSILAC vertegenwoordigt dus een eenvoudig protocol voor wereldwijde meting van de meest fysiologische eiwithalfwaardetijden in niet-delende cellen.
Veranderingen in eiwitomzet hebben een nauwe relatie met veroudering, leeftijdsgebonden ziekten, neurodegeneratie en levensduur54,55. Dit protocol beschrijft een methode om deze relaties te ondervragen door stabiele isotoopetikettering van aminozuren in celkweek te gebruiken om eiwitomloopsnelheden in senescentiecellen te meten. Er bestaan echter tal van analoge methoden om studies uit te voeren in de context van veroudering en neurodegeneratie in vivo in hele organismen zoals muizen. Inderdaad, deze studies hebben het belang benadrukt van het meten van eiwitomloopsnelheden in de context van leeftijdsgebonden ziekten 56,57,58,59.
In deze studie vielen ribosomale eiwitten en eiwitten die zich in het endoplasmatisch reticulum bevinden op als twee categorieën eiwitten met respectievelijk verminderde en verhoogde halfwaardetijden in senescente cellen. Hoewel verdere analyse van steady-state niveaus nodig is voor definitieve conclusies, suggereren deze resultaten verder dat senescente cellen de translatie op unieke wijze kunnen reguleren door verminderde halfwaardetijden van ribosomale eiwitten. In de toekomst zal het toepassen van stabiele isotooplabelingsbenaderingen om de relatie tussen cellulaire senescentie en neurodegeneratie in vivo in muismodellen te bestuderen, een veelbelovende uitbreiding zijn van de isotooplabelingsbenadering die door dit protocol wordt beschreven.

Senescentie werd voor het eerst geïdentificeerd als een toestand van onbepaalde groeistop die werd vertoond door gekweekte primaire cellen na het bereiken van replicerende uitputting1. Sindsdien is aangetoond dat senescentie kan optreden als reactie op tal van cellulaire beledigingen, waaronder genotoxische, mitochondriale en oncogene stress, onder andere2. Hoewel senescentie verschillende fysiologisch belangrijke rollen heeft, zoals tumoronderdrukking en wondgenezing, wordt de accumulatie van senescente cellen tijdens veroudering geassocieerd met een groot aantal schadelijke effecten op de gezondheid3, waaronder verschillende neurodegeneratieve aandoeningen 4,5,6. Cellulaire senescentie komt voor in meerdere hersenceltypen, waaronder neuronen 7,8,9,10, astrocyten11, microglia12 en oligodendrocytenvoorlopers13, en draagt bij aan neurodegeneratie en cognitieve disfunctie. Van amyloïde bèta-oligomeren, een van de kenmerken van de ziekte van Alzheimer14, is aangetoond dat ze neuronale senescentieversnellen 13,15,16. Een verhoogde prevalentie van senescente cellen is ook in verband gebracht met de ziekte van Parkinson17, vooral als gevolg van omgevingsstressoren11,18. Belangrijk is dat de selectieve eliminatie van senescente cellen in preklinische modellen de levensduur verlengt en een groot aantal leeftijdsgerelateerde ziekten vermindert 3,5,12 en cognitieve tekorten verbetert 8,11,12,13. Senescente cellen zijn dus naar voren gekomen als veelbelovende therapeutische doelen voor de behandeling van vele leeftijdsgerelateerde aandoeningen.
Veel van het schadelijke effect van senescente cellen wordt veroorzaakt door het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP), een complex mengsel van bioactieve moleculen uitgescheiden door senescente cellen die lokale ontsteking, angiogenese, vernietiging van de extracellulaire matrix en voortplanting van senescentie in het omliggende weefsel kunnen veroorzaken 19,20,21 . De SASP vertegenwoordigt ook een interessant biologisch fenomeen van senescentie omdat het een aanzienlijke transcriptionele en translationele inspanning vereist tijdens een toestand van celcyclusstilstand. In feite is aangetoond dat senescente cellen een afname vertonen in ribosoombiogenese 22,23,24 die de eiwitsynthese zou moeten verminderen. In plaats daarvan vertalen senescente cellen robuust sommige eiwitten, met name SASP-factoren, en beïnvloeden ze het metabolisme van het omliggende weefsel25. Er is dus veel interesse om te begrijpen hoe senescente cellen die een permanente celcyclusstilstand ondergaan, de eiwithomeostase blijven behouden en tegelijkertijd SASP-factoren en andere geselecteerde eiwitten robuust tot expressie brengen.
Deze methode beschrijft hoe massaspectrometrie en gepulseerde stabiele isotoopetikettering door aminozuren in celkweek (pSILAC) kunnen worden gebruikt om wereldwijd de halfwaardetijden van eiwitten in senescente cellen op proteoombrede schaal te meten. In traditionele SILAC worden gekweekte cellen volledig metabolisch gelabeld met zware en lichte niet-radioactieve isotopen van aminozuren voor downstream-analyse van eiwitrijkdom. Deze methode is eerder toegepast om abundantieveranderingen uitgebreid en kwantitatief te beoordelen in de SASP van gekweekte fibroblasten26. In pSILAC worden cellen op dezelfde manier metabolisch gelabeld met een puls van zware isotoop die pre-labeling met lichte isotoop volgt en vervolgens met een of meer tijdsintervallen wordt geoogst. De opnamesnelheden van zware isotoop ten opzichte van reeds bestaande lichte isotoop worden vervolgens gebruikt om relatieve eiwitomloopsnelheden te berekenen. Over het algemeen worden isotopen van arginine en lysine gebruikt omdat trypsine bij die residuen splijt; dus alle peptiden uit de standaardvertering zullen mogelijk het zware label bevatten. Paren van peptiden die alleen verschillen door de aan- of afwezigheid van zware lysine of arginine zijn chemisch identiek en kunnen worden gedifferentieerd en gekwantificeerd door een massaspectrometer. Na massaspectrometrie-analyse kunnen peptiden worden geïdentificeerd als nieuw gesynthetiseerd of reeds bestaand op basis van de aan- of afwezigheid van het isotopische label in de resulterende peptide-identificaties. Eiwitomloopsnelheden kunnen vervolgens worden bepaald door de verhouding van zware (13 C-15N) over lichte (12 C-14N) peptiden voor een bepaald eiwit aan te passen aan kinetische modellen voor exponentiële groei of verval27,28. pSILAC is gebruikt in verschillende vergelijkingen van eiwitomloopsnelheden 29,30,31,32 en is momenteel de meest uitgebreide en high-throughput methode voor het meten van eiwithalfwaardetijden.
Dit protocol beschrijft de bereiding van senescente cellen parallel aan vergelijkbare groei-gestremde rustige cellen in cultuur, gevolgd door metabole etikettering met pSILAC. Cellen worden vervolgens geoogst, gehomogeniseerd tot lysaten en verwerkt voor massaspectrometrie-acquisitie en -analyse. De gegevens verkregen uit massaspectrometrie worden vervolgens gebruikt om eiwithalfwaardetijden te bepalen met behulp van een vereenvoudigde kwantitatieve methode met behulp van een enkel tijdspunt en halfwaardetijdberekeningen die in een spreadsheet worden uitgevoerd. Met behulp van deze benadering kunnen schattingen van eiwithalfwaardetijden worden gemeten op een uitgebreide en kwantitatieve manier die authentieker is voor onverstoorbare cellulaire omstandigheden dan protocollen die blokkers van eiwitsynthese of omzet gebruiken.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td><td>Grainger</td><td>AH015</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonate</td><td>Millipore-Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>BCA Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreotol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose, HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>12430112</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovien serum, gecertificeerd, warmte-inactivatie</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Sigma</td><td>27001</td><td></td></tr><tr><td>Gammacel 40 Exactor</td><td>Best Theratronics</td><td></td><td>Cesium Irradiator voor cellen</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide (IAA)</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td>Lichtgevoelig</td></tr><tr><td>IMR-90 primaire long fibroblasten</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td></td></tr><tr><td>iRT Kit (geïndexeerde retentietijd)</td><td>Biognosys</td><td>Ki-3002-2</td><td>Geïndiceerde retentietijd peptidstandaard</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>ThermoFisher</td><td>423835000</td><td></td></tr><tr><td>Mascot</td><td>Matrix Science</td><td>Mascot Daemon 2.8</td><td>Proteomische databasezoeksoftware</td></tr><tr><td>Maxima Reverse Transcriptase (200 U/µL)</td><td>ThermoFisher</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>MEM niet-essentiële aminozurenoplossing (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Nano LC-systeem</td><td>ThermoFisher</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB solid phase extractie cartridges</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap massaspectrometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q Exactive HF Orbitrap</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0</td><td>ThermoFisher</td><td>327110025</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsine) -DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A33972</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Real-Time PCR-systeem</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Random Hexamer Primer</td><td>ThermoFisher</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Senescence &bèta;-Galactosidase Kleuringskit</td><td>Cell Signaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Skyline</td><td>University of Washington</td><td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td><td>Gratis en open source kwantitatief proteomische software. Beschikbaar op www.skyline.ms</td></tr><tr><td>Sonicator waterbad</td><td>Branson</td><td>CPX-952-516R</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>Wordt in tekst aangeduid als fenol; gevaarlijk</td></tr><tr><td>TRYPle Express</td><td>ThermoFisher</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (sequentiegrade)</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>ThermoFisher</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS grade)</td><td>Grainger</td><td>AH365</td><td></td></tr></tbody></table>

meting van eiwitomloopsnelheden in senescente en niet-delende gekweekte cellen met metabole etikettering en massaspectrometrie

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Steeds meer bewijs heeft aangetoond dat de accumulatie van senescente cellen in het centrale zenuwstelsel bijdraagt aan neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer en Parkinson. Cellulaire senescentie is een toestand van permanente celcyclusstilstand die meestal optreedt als reactie op blootstelling aan subletale stress. Net als andere niet-delende cellen blijven senescente cellen echter metabolisch actief en voeren ze vele functies uit die unieke transcriptionele en translationele eisen en wijdverspreide veranderingen in de intracellulaire en uitgescheiden proteomen vereisen. Begrijpen hoe eiwitsynthese en vervalsnelheden veranderen tijdens senescentie kan de onderliggende mechanismen van cellulaire senescentie verlichten en potentiële therapeutische wegen vinden voor ziekten die worden verergerd door senescente cellen. Dit artikel beschrijft een methode voor proteoomschaalevaluatie van eiwithalfwaardetijden in niet-delende cellen met behulp van gepulseerde stabiele isotoopetikettering door aminozuren in celkweek (pSILAC) in combinatie met massaspectrometrie. pSILAC omvat metabole etikettering van cellen met stabiele zware isotoopbevattende versies van aminozuren. In combinatie met moderne massaspectrometriebenaderingen maakt pSILAC het mogelijk om de eiwitomzet van honderden of duizenden eiwitten in complexe mengsels te meten. Na metabole etikettering kan de omzetdynamiek van eiwitten worden bepaald op basis van de relatieve verrijking van zware isotopen in peptiden gedetecteerd door massaspectrometrie. In dit protocol wordt een workflow beschreven voor het genereren van senescente fibroblastculturen en op dezelfde manier gearresteerde rustige fibroblasten, evenals een vereenvoudigd, single-time point pSILAC-etiketteringstijdsverloop dat de dekking van verwachte eiwitomloopsnelheden maximaliseert. Verder wordt een pijplijn gepresenteerd voor de analyse van pSILAC-massaspectrometriegegevens en gebruiksvriendelijke berekening van eiwitafbraaksnelheden met behulp van spreadsheets. De toepassing van dit protocol kan worden uitgebreid van senescente cellen naar niet-delende gekweekte cellen zoals neuronen.

Dit protocol beschrijft een methode om eiwithalfwaardetijden tussen senescente en niet-delende, rustige controlecellen globaal te vergelijken met behulp van pSILAC en minimale tijdspunten. Dit protocol beschrijft het genereren van senescente en rustige cellen in cultuur, metabole etikettering van cellen met stabiele isotopen van arginine en lysine gedurende 3 dagen, het kwantificeren van de relatieve abundanties van zware en lichte peptide-isotopen door massaspectrometrie en een eenvoudige en toegankelijke berekening van eiwithalfwaardetijden met behulp van spreadsheetformules (figuur 1). Deze methode is zeer flexibel en kan worden aangepast aan tal van celtypen en omstandigheden.
Als onderdeel van het genereren van senescente cellen voor dit protocol, worden twee methoden van senescentievalidatie gebruikt: SA-βGal-positieve cellen gevisualiseerd door microscopie en verhoogde niveaus van senescente markers gekwantificeerd met behulp van RT-qPCR-analyse. De meting van senescente markers moet een duidelijk onderscheid opleveren tussen rustige en senescente cellen om vergelijkingen van de twee celpopulaties als geldig te kunnen beschouwen. Voor SA-βGal-activiteit moeten senescente cellen blauw lijken, terwijl rustige controlecellen geen of zeer weinig kleur hebben (figuur 2A). Deze test kan worden gekwantificeerd door de positieve, blauwgekleurde cellen te tellen als een percentage van het totale aantal cellen en vervolgens de procentuele positiviteitsratio tussen rustige controle en senescente cellen te vergelijken. Het is belangrijk dat dit protocol tegelijkertijd wordt uitgevoerd voor de vergelijking van beide celtoestanden; SA-βGal-activiteit is afhankelijk van de pH van de kleuringsoplossing, dus de resultaten kunnen aanzienlijk variëren tussen assays en moeten als een kwalitatieve maat worden beschouwd.
De RT-qPCR-analyse van senescente markers toont hoge niveaus van de mRNA's die coderen voor SASP-factoren (IL6, CXCL8, IL1B) en de celcyclusremmers (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21) in de meeste senescente modellen. Hoewel enige variatie wordt verwacht op basis van celtype, kweekconditie en senescente inductor41,42, vertonen de meeste senescente cellen meer dan vijf keer hogere niveaus van IL6, CXCL8 en CDKN1A / p21 mRNA's in vergelijking met rustige controlecellen; omgekeerd moeten de niveaus van LMNB1 en PCNA mRNA's, coderend voor proliferatiemarkers, laag of afwezig zijn in senescente cellen in vergelijking met rustige cellen (figuur 2B). Alles bij elkaar genomen zijn een significant percentage SA-βGal positiviteit en de verwachte expressie van een panel van senescentie-geassocieerde mRNA-markers voldoende om de inductie van senescentie in een experiment te bevestigen.
De verwerking van eiwitmonsters voor massaspectrometrie-analyse bestaat uit in-solution vertering (2 dagen) en vaste-fase extractie (4-6 uur). Om ongerichte proteomische analyse uit te voeren, worden de resulterende peptiden ingediend voor LC-MS / MS-analyse met behulp van gegevensafhankelijke acquisitie (DDA). Op Orbitrap-instrumenten kan een DDA-methode worden gespecificeerd in de methode-editor voor massaspectrometrie-instrumenten. De in dit onderzoek gebruikte instellingen van de massaspectrometer zijn weergegeven in figuur 3A. Vloeistofchromatografie-instellingen kunnen ook worden opgegeven in de methode-editor. Voor deze studie werd een lineaire gradiënt van 90 minuten met toenemende organische fase (acetonitril) gebruikt (figuur 3B). Na een succesvolle acquisitie moet de totale ionenstroom (TIC) een intens signaal bevatten tijdens het lineaire gradiëntgedeelte van de methode (figuur 3C). Dit protocol beschrijft een voorbeeldprotocol op een Orbitrap-instrument, maar de berekening van eiwithalfwaardetijden kan worden uitgevoerd op basis van gegevens die zijn verkregen van elke massaspectrometer die is verzameld in DDA-modus, die beschikbaar is op verschillende soorten instrumenten (bijv. Orbitraps en time-of-flight-instrumenten) en leveranciers. De acquisitie-instellingen zijn uniek voor het type en de configuratie van het gebruikte instrument en het wordt aanbevolen om de instellingen te gebruiken die worden voorgesteld door de massaspectrometriefaciliteit. Deze methode is ook compatibel met niet-DDA-methoden (SRM, PRM, DIA), zolang kwantitatieve chromatografische piekgebieden voor zware en lichte pieken kunnen worden geëxtraheerd uit de onbewerkte gegevensbestanden en in de spreadsheetformules kunnen worden ingevoerd.
Ruwe massaspectrometriebestanden worden doorzocht met een van de vele beschikbare proteomische databasezoekhulpmiddelen om peptiden en eiwitten te identificeren. Deze studie maakte bijvoorbeeld gebruik van de Mascot43-zoekmachine. Om chromatografische piekgebieden te verkrijgen voor kwantificering van zware en lichte peptiden, worden databasezoekresultaten geïmporteerd in een proteomische software die chromatografische piekgebieden zoals Skyline39,40 kan bevatten. Onderzoek van de geëxtraheerde ionchromatogrammen van peptiden (figuur 4) zal het relatieve aandeel van zware en lichte peptidesignalen onthullen. Een lager aandeel van het zware peptidesignaal ten opzichte van het lichte peptidesignaal in senescente cellen duidt op een langzamere eiwitomloopsnelheid (figuur 4A), en een hoger zwaar peptidesignaal ten opzichte van licht duidt op een snellere eiwitomloopsnelheid (figuur 4B). De ongelabelde monsters moeten weinig of geen zwaar peptidesignaal vertonen. Elk schijnbaar zwaar peptidesignaal in de niet-gelabelde monsters wordt beschouwd als achtergrondruis en zal tijdens de uiteindelijke berekeningen worden afgetrokken. Kwantificering van chromatografische piekgebieden voor lichte en zware peptiden voor alle behandelings- en etiketteringsomstandigheden moet worden geëxporteerd voor latere berekening van eiwitomloopsnelheden en statistische analyse.
Door gebruik te maken van single time point analyse, is de kwantificering van eiwithalfwaardetijden eenvoudig uit te voeren en kan gemakkelijk worden gedaan in spreadsheets. In tabel 3 werden de halfwaardetijden berekend voor 695 eiwitten die uit de massaspectrometrieanalyse werden geïdentificeerd. Uitgaande van eiwitrijke en lichte isotoop abundanties voor elk eiwit in de monsters (invoer voor de 1) Raw Data sheet), wordt vervolgens automatisch een procent zware isotoop (de Ratio, R genoemd) berekend op het blad met de titel 2) Ratio H | H + L. Bij deze stap wordt de R van zwaar gelabelde monsters genormaliseerd door de R af te trekken van niet-gelabelde monsters om een uiteindelijke R te produceren voor de rustige en senescente drielicaten. Omdat niet-gelabelde monsters geen exogene toegevoegde zware isotoop mogen hebben, worden ze gebruikt om het achtergrondsignaal te elimineren. Vanaf R wordt dek-deg (omloopsnelheid) berekend met behulp van de volgende formule:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq01.jpg" style="margin: auto;">
De halfwaardetijd (H, in dagen) wordt bepaald voor elk eiwit in de rustcontrole en senescente triplicaten (blad met de titel 3) Halfwaardetijd (dagen)) met behulp van de volgende formule:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq02.jpg" style="margin: auto;">
Deze halfwaardetijden worden vervolgens gemiddeld onder de rustige en senescente drievoudige om een rustige en senescente gemiddelde halfwaardetijd voor elk eiwit te genereren, evenals een p-waarde. Berekende halfwaardetijden worden vervolgens gefilterd op waarden die negatief zijn, wat optreedt wanneer het zware signaal van licht gelabelde cellen (de achtergrond) groter is dan het zware signaal van zwaar gelabelde cellen. Deze filtering resulteerde in 707 eiwitten uit 841 geïdentificeerd met geldige halfwaardetijden voor de hier gepresenteerde resultaten.
De halfwaardetijd wordt vervolgens gerapporteerd als een log2-verhouding van senescente over rustige controlecellen (log2FC) en uitgezet in een vulkaanplot (figuur 5). Bijvoorbeeld, door te kijken naar het 5) Analyseblad, kan worden gezien dat het stollings II trombinereceptor (F2R) eiwit een halfwaardetijd heeft in rustige cellen van 0,51 dagen (kolom B) en een halfwaardetijd in senescente cellen van 1,07 dagen (kolom C) die een log2FC van ~ 1,06 (kolom D) opleverde met een p-waarde van 0,001.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig01.jpg"> Figuur 1: Diagram van de pSILAC-workflow voor senescente en rustige controlecellen. Menselijke IMR-90 fibroblasten werden gebruikt om rustige (laag-serum) of senescente (IR) celculturen te bereiden voor vergelijking van eiwithalfwaardetijden. Cellen werden vervolgens gelabeld met SILAC Light of SILAC Heavy media met isotopische arginine en lysine gedurende 3 dagen. Lysaten werden geëxtraheerd uit cellen, verteerd, ontzout en geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie. Zware en lichte peptide-isotooppieken komen overeen met respectievelijk nieuw gesynthetiseerde en reeds bestaande peptiden. Halfwaardetijden werden berekend met behulp van een vergelijking voor exponentieel verval. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig02.jpg"> Figuur 2: Validatie van senescente fenotypes met behulp van SA-βGal- en RT-qPCR-analyses. (A) Senescente en rustige cellen worden op het moment van de oogst opnieuw verguld in een 6-well plaat en gekleurd voor SA-βGal met behulp van de SA-βGal-kleuringskit. Blauwe kleur in het cellichaam is positief voor senescentie. Foto's worden gemaakt in brightfield met kleur bij 10x vergroting, maatmarkering in rood. (B) RT-qPCR-analyse waarbij senescente cellen (rood) en fietsende cellen (grijs) uit een niet-gerelateerd experiment worden vergeleken. Verhogingen van de niveaus van CDKN1A/p21, CXCL8 en IL6 mRNA's zijn indicatief voor senescentie, evenals de afname van LMNB1 mRNA-niveaus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig03.jpg"> Figuur 3: Representatieve methoden voor data-dependent acquisition (DDA) scans en vloeistofchromatografie gradiënt van pSILAC culturen op de Q-Exactive HF orbitrap massaspectrometer. (A) Aanbevolen instrumentinstellingen in de instrumentsoftware voor data-afhankelijke analyse van hele cel lysaten uit een pSILAC experiment. (B) Voorbeeld van instellingen voor vloeistofchromatografiestroomgradiëntmethode. Peptiden worden geëlueerd over een lineaire gradiënt van 90 minuten, variërend van 5% tot 35% buffer B (0,2% mierenzuur en 99,8% acetonitril), gevolgd door een wasbeurt van 10 minuten met 80% buffer B en 25 minuten evenwicht met 5% buffer B. (C) Een representatief totaal ionogram (TIC) van een massaspectrometrie-acquisitie van IMR-90 fibroblastpeptiden verkregen met de gespecificeerde instellingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig04.jpg"> Figuur 4: Representatieve geëxtraheerde ionchromatogrammen van peptiden met veranderde omzet tijdens senescentie. (A) Chromatografische piekgebieden van het peptide FQMTQEVVCDECPNVK++ uit het eiwit DnaJ homologe subfamilie B lid 11 (DNAJB11) in senescente en niet-senescente cellen. Na 3 dagen SILAC nemen senescente cellen minder zware isotoop op in dit peptide in vergelijking met rustige (niet-senescente) cellen, zoals aangegeven door een vermindering van het piekgebied van zwaar isotoopbevattend peptide (blauw) ten opzichte van het lichte peptide (rood), wat aangeeft dat dit peptide de omzet in senescente cellen heeft verminderd. (B) Chromatografische piekgebieden van het peptide VQAQVIQETIVPK++ van het eiwit Splicing Factor 3a Subunit 1 (SF3A1) in senescente en niet-senescente cellen. Na 3 dagen SILAC bevatten senescente cellen een hoger aandeel zware isotoop in dit peptide in vergelijking met rustige (niet-senescente) cellen, zoals aangegeven door een vermindering van het piekgebied van zwaar isotoopbevattend peptide (blauw) ten opzichte van het lichte peptide (rood), wat aangeeft dat dit peptide een verhoogde omzet in senescente cellen heeft. De ongelabelde (dag 0) omstandigheden tonen geen opname van zware isotoop voor beide peptiden, zoals verwacht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig05.jpg"> Figuur 5: Vergelijking van eiwithalfwaardetijden in senescente en rustige cellen bepaald op basis van pSILAC-etikettering. (A) Vulkaanplot met de log2-verhouding van senescent / controle (rustig) voor elk van de 695 geïdentificeerde eiwitten; in dit experiment bevatten lichte en zware etiketteringsmedia geen glucose en geen fenolrood. (B) Tabellen met de top 10 eiwitten met de meest verhoogde of verlaagde halfwaardetijden in rustige cellen versus senescente cellen (respectievelijk links en rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Media en buffers die in dit protocol worden gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%201-63835R1.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: RT-qPCR primers die in dit protocol worden gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%202-63835R1.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 3: SILAC-analysewerkboek voor berekening van eiwithalfwaardetijden, vouwveranderingen en t-tests. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%203%20v3.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Dit protocol beschrijft de workflow voor metabole etikettering van senescente en niet-delende cellen met gepulste SILAC, ongerichte massaspectrometrie-analyse en een gestroomlijnde berekening van eiwithalfwaardetijden.

Meting van eiwitomloopsnelheden in senescente en niet-delende gekweekte cellen met metabole etikettering en massaspectrometrie

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Hoe cellen eiwithomeostase behouden, is niet goed begrepen in de context van cellulaire stress en senescentie. In dit protocol bieden we een eenvoudige en nauwkeurige manier om de eiwitomzet te berekenen, wat een belangrijk onderdeel is van eiwithomeostase in levende cellen. Pulse SILAC geeft een experimentator de mogelijkheid om de eiwitomzet voor individuele eiwitten en het gehele proteoom te meten op een high-throughput manier die ook authentieker is voor biologische systemen dan andere methoden.De principes van deze methode kunnen worden toegepast op elk systeem dat metabolisch kan worden gelabeld, inclusief hele organismen. Deze methode kan ook leiden tot inzichten in cellulaire senescentie, veroudering en neurodegeneratieve ziekten. Massaspectrometrie-analyse is zeer gevoelig voor bepaalde chemische verontreinigingen, zoals detergentia.Gebruik reagentia van LC-MS-kwaliteit gedurende deze procedure om gegevensverzameling van hoge kwaliteit te garanderen. Om te beginnen met de metabole etikettering van de cellen, vervangt u de media voor drie platen van elk van senescente en rustige cellen door 30 milliliter SILAC Light-media. Vervang afzonderlijk het medium voor drie senescente en drie rustige platen door 30 milliliter SILAC Heavy.Laat de cellen drie dagen groeien zonder het medium te veranderen. Om de cellen los te maken van de kweekplaten, voegt u vijf milliliter voorverwarmd trypsine-reagens toe aan elke plaat en incubeert u de platen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Later resuspend de losgemaakte cellen in vijf milliliter van dezelfde media die worden gebruikt voor cultuur tot een totaal volume van 10 milliliter.Breng vervolgens de cellen over naar ijs en centrifugeer de cellen op 300 keer G bij vier graden Celsius. Na het tweemaal wassen van de pellet, draai de cellen opnieuw af en verwijder het supernatant voordat u de pellet resuspendeert in 150 microliter vers bereid achtkies ureum en 50 millimolar ammoniumbicarbonaat lysisbuffer. Meng de inhoud van de buis door op en neer te pipetteren.Aliquot 50 microgram van het eiwitmonster in een nieuwe buis en brengt monsters tot gelijke volumes met lysisbuffer. Voeg vervolgens dithiothreitol toe aan een eindconcentratie van 20 millimolar aan de buis en incubeer het monster bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met schudden. Laat het monster gedurende 10 minuten afkoelen bij kamertemperatuur voordat u jodoacetamide toevoegt aan een eindconcentratie van 40 millimolar en gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur broedt.Verdun vervolgens het monster tot minder dan éénkies ureum met een 50 millimolair ammoniumbicarbonaatbuffer. Voeg één microgram trypsine voor 50 microgram starteiwit of bij 1:50 trypsine/eiwitverhouding toe aan het monster. Incubeer het monster 's nachts bij 37 graden Celsius met schudden om eiwitten tot peptiden te verteren.Voeg de volgende dag mierenzuur toe aan 1 volumeprocent van het monster om de eiwitvertering te doven. Plaats voor het opruimen van het monster een vaste-fase extractiepatroon op een vacuümspruitstuk, met één extractiepatroon voor elk monster, volgens de richtlijnen van de fabrikant. Verwijder na de extractie de peptidemonsters uit het vacuümspruitstuk en droog ze volledig in een vacuümconcentrator.Het drogen duurt ongeveer drie uur. Voor de massaspectrometrie, of MS-analyse, resuspend het peptidemonster in een concentratie van 400 nanogram per microliter in een mierenzuurbuffer van 0,2%. Om de peptiden te resoneren, mengt u het monster gedurende vijf minuten.Soniceer vervolgens gedurende vijf minuten in een waterbad sonicator. Centrifugeer vervolgens het monster om de onoplosbare materialen te pelleteren en breng de peptide-supernatanten over in MS-injectieflacons. Dien de monsters in voor de proteomische analyse met behulp van vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie of LC-MS-MS.Gebruik de instellingen die worden aanbevolen voor ongerichte analyse door de massaspectrometriefaciliteit. Laad de monsters op een analytische kolom met een stroomsnelheid van 400 nanoliter per minuut om de peptiden te elueren over een lineaire gradiënt van 90 minuten met behulp van een mengsel van organische en anorganische oplosmiddelen, waarbij het organische oplosmiddel varieert van 5 tot 35%Verkrijg massaspectrometriegegevens in de gegevensafhankelijke modus, met een continue cyclus van MS1-enquêtescans gevolgd door 20 gegevensafhankelijke MS2-scans met HCD-fragmentatie. Kwantificeer de peptide piekgebieden voor zware en lichte peptiden in Proteome Quantitation software tool.Exporteer vervolgens de zware en lichte peptidepiekgebieden. Voor de berekening van de halfwaardetijd van eiwitten opent u het SILAC-analysewerkboek naar het eerste blad met de naam Raw Data en plakt u de UniProt-ID's, gennamen, zware en lichte piekgebieden in de aangegeven kolommen. Open vervolgens het vierde blad met de naam Analyse en verwijder de rijen waarin de kolommen G en H aangeven dat het monster buiten bereik is en houd rijen die binnen het bereik worden gelezen.De senescente fenotypen werden gevalideerd met behulp van de senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase-activiteit en RT-qPCR-analyse. Voor de bèta-galactosidase-activiteit leken de senescente cellen blauw, terwijl de rustige controlecellen geen of minimale kleur hadden. In de RT-qPCR-analyse vertoonden de senescente cellen hogere interleukine-6, CXCL8 en CDKN1A-P21 mRNA's in vergelijking met de rustige cellen.Omgekeerd was het niveau van lamin B1-codering voor proliferatiemarker laag of afwezig in de senescente cellen. De geëxtraheerde ionchromatogrammen van peptiden onthulden het relatieve aandeel van zware en lichte peptidesignalen. Een lager aandeel zware peptidesignalen ten opzichte van lichte senescente cellen duidde op een langzamere eiwitomloopsnelheid en een hoger zwaar peptidesignaal ten opzichte van licht duidde op een snellere eiwitomloopsnelheid.De ongelabelde monsters vertoonden weinig of geen zwaar peptidesignaal. De halfwaardetijden voor 695 eiwitten geïdentificeerd uit de massaspectrometrie-analyse werden berekend. De halfwaardetijd wordt gerapporteerd als een log-two verhouding van senescente over rustige cellen en uitgezet in een vulkaanplot.Na de berekening van eiwitomloopsnelheden in senescente cellen kan downstream-analyse kandidaat-biologische routes onthullen die worden gereguleerd door proteostasemechanismen. Pulse SILAC maakte de weg vrij voor onderzoekers om eiwitdynamica te bestuderen met ongekende granulariteit en doorvoer, waardoor we veranderingen in eiwithomeostase in veel individuele eiwitten konden bestuderen.

measurement-protein-turnover-rates-senescent-non-dividing-cultured

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video illustrates a flow cytometry-based assay for quantifying therapy-induced senescent cancer cells with dual senescence markers. The detection and quantification of senescent cells involve using a β-galactosidase substrate. The substrate is cleaved by active lysosomal β-galactosidase within the senescent cells, producing a fluorescent product that, in conjunction with autofluorescent lipofuscin granules, marks the senescent cancer cells.

Flow Cytometry-Based Quantification of Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan ​​van tumoren blijft controversieel. Sinds chemotherapeutische drugs kankercellen ertoe kunnen bewegen senesce, studeren veroudering is essentieel voor het voorstellen van nieuwe therapieën. De standaard en breed gebruikt β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. We stellen hier een snelle en gevoelige flowcytometrie gebaseerde bepaling senescentie kwantificeren.

Een gevoelige methode om Senescent kankercellen kwantificeren

Hier beschrijven we een robuuste werkwijze voor de fractionering van plantaardige plasmamembranen in reinigingsmiddelenbestendige en detergent oplosbare membranen gebaseerd op een mengsel van gelabelde en in vivo volledig 15N gemerkt Arabidopsis thaliana celculturen. De procedure wordt toegepast voor vergelijkende proteomics studies om signalering processen te begrijpen.

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Dit protocol beschrijft hoe absolute kwantificeringsanalyses van doeleiwitten binnen complexe biologische monsters kunnen worden uitgevoerd met behulp van geselecteerde reactiebewaking. Het werd gebruikt om eiwitten van de muis macrofaag chemotaxis signaleringsroute nauwkeurig te kwantificeren. Selectie van doelpeptiden, ontwikkeling van analyses en kwalitatieve en kwantitatieve analyses worden in detail beschreven.

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Dit rapport beschrijft protocollen voor het meten van degradatiesnelheden van verkeerd gevouwen eiwitten door middel van western blot of fluorescentie-gebaseerde assays. De methoden kunnen worden toegepast op de analyse van andere verkeerd gevouwen eiwitten en voor high-throughput screening.

Assays voor de afbraak van Misfolded Eiwitten in Cellen

Metabole competentie van in vitro systemen is een belangrijke voorwaarde voor de biotransformatie en dispositie van drugs en toxische stoffen. In dit protocol beschrijven we de toepassing van referentie- metabole probes fase I metabolisme in celkweken beoordelen.

Massaspectrometrie en luminogene gebaseerde benaderingen voor karakteriseren Fase I Metabolic competentie van<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Cultures

Cellular veroudering, de onomkeerbare toestand van de celcyclus, kan worden geïnduceerd door verschillende cellulaire stress. Hier beschrijven we protocollen bij cellulaire veroudering en methoden ertoe te brengen markers van veroudering te beoordelen.

Technieken voor het induceren en te kwantificeren Cellulaire senescentie

Dit protocol beschrijft een methode om te bepalen eiwit halfwaardetijd in één levende Adherente cellen, met behulp van pulse labeling en fluorescentie time-lapse beeldvorming van module-tag fusion eiwitten.

Eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door Time-Lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek

We beschrijven ons protocol voor het meten van biologische ritmes in eiwit katabolisme via autophagy en het proteasoom in muis lever.

Het meten van de diurnale ritmes in autophagic en Proteasomale flux

Hier gepresenteerd is een protocol om de afbraak van het eiwit huntingtine gefuseerd aan de fotoconvertible fluorophore Dendra2 te controleren.

In Vivo Kwantificering van eiwitomzet in Aging C. Elegans met behulp van Photoconvertible Dendra2

Dit artikel presenteert een levende-cel LysoTracker-protocol om lysosomale hervorming tijdens senescentie in IMR-90 menselijke fibroblasten te meten.

Lysosomale profilering met LysoTracker voor kwantitatieve beoordeling van cellulaire senescentie bij menselijke fibroblasten

Leer eiwitomloopsnelheden meten in senescente en niet-delende cellen met behulp van pulsed SILAC en massaspectrometrie. Deze methode biedt inzicht in proteostase en verouderingsmechanismen.

Meting van eiwitomloopsnelheden in senescente en niet-delende gekweekte cellen met metabole etikettering en massaspectrometrie

Meer video's verkennen