Een geïntegreerde aanpak voor microproteïne-identificatie en sequentieanalyse
12 juli 2022
Het protocol dat hier wordt beschreven, biedt gedetailleerde instructies voor het analyseren van genomische gebieden die van belang zijn voor microproteïnecoderingspotentieel met behulp van PhyloCSF op de gebruiksvriendelijke UCSC Genome Browser. Daarnaast worden verschillende hulpmiddelen en middelen aanbevolen om de sequentiekenmerken van geïdentificeerde microproteïnen verder te onderzoeken om inzicht te krijgen in hun vermeende functies.
Het hier beschreven protocol biedt gedetailleerde instructies voor het analyseren van genomische gebieden die van belang zijn voor eiwitcoderingspotentieel met behulp van phyloCSF op de gebruiksvriendelijke UCSC-genoombrowser. PhloCSF kan effectief geconserveerde korte open leesframes identificeren met micro-eiwitcoderingspotentieel in genomische regio's die momenteel worden geannoteerd als niet-coderend. De hier beschreven methoden zijn gemakkelijk te gebruiken en kunnen worden geïmplementeerd door onderzoekers van alle achtergronden zonder voorafgaande training of expertise in bioiformatica of vergelijkende genomica.
Open om te beginnen een internetbrowservenster en navigeer naar de University of California Santa Cruz of UCSC-genoombrowser. Selecteer onder de kop onze tools de optie tracknaven. Typ op het tabblad openbare hubs fylokoCSF in het vak zoektermen.
Klik vervolgens op de knop Openbare hubs zoeken. Maak verbinding met phyloCSF door op de verbindingsknop te klikken voor de hubnaam phyloCSF. Nadat u op verbinden hebt geklikt, wacht u om door te verwijzen naar de UCSC-genoombrowsergatewaypagina.
Als u een andere soort wilt opvragen, selecteert u de gewenste soort onder de kop Bladeren of selecteert u de soort door op het juiste pictogram te klikken, of typt u de soort in het tekstvak dat zegt, voer de algemene naam van de soort of assembly-ID in.Met behulp van het vervolgkeuzemenu kiest u de assembly om te zoeken onder gedefinieerde positiekop en voert u vervolgens het positiegensymbool of zoektermen in het positie- of zoektermvak in en klikt u op ga om te navigeren naar een gen van belang op de genoombrowser. Als de zoekopdracht heeft geresulteerd in meerdere overeenkomsten die wachten om te worden omgeleid naar een pagina die de selectie van een interessante positie vereist, klik dan op het juiste gen van interesse. Nadat u naar de UCSC-genoombrowser bent gegaan, selecteert u de blast-achtige uitlijningstool of blat u onder de kop onze tools om een specifieke DNA- of eiwitsequentie op te vragen.
U kunt ook de cursor op het tabblad Gereedschappen plaatsen en de blat-optie selecteren of de gegeven link volgen. Selecteer met behulp van het vervolgkeuzemenu de soort, het genoom en de samenstellende groep van interesse. Definieer vervolgens het querytype, plak de volgorde van interesse in het tekstvak blat search genome en klik op verzenden.
Klik vervolgens op de browserlink onder de actiekop om naar de genomische regio van interesse te navigeren. Scan visueel het genomische interessegebied op positief scorende fylokoCSF-regio's. Gebruik de zoomfunctie om interessante gebieden te vergroten om de sequentiekenmerken te onderzoeken en te zoeken naar de start- en stopcodons.
Als u handmatig wilt inzoomen, houdt u de Shift-toets ingedrukt en houdt u de muisknop ingedrukt terwijl u langs het interessegebied sleept. U kunt ook de knoppen in- en uitzoomen boven aan de pagina gebruiken om te navigeren. Zoom in totdat de nucleotide of basissequentie zichtbaar is.
Scan visueel de nucleaire getijdensequentie aan het begin en einde van de positief scorende fylokoCSF-regio's om bestraffende start- en stopcodons te identificeren. Beweeg de muiscursor over de weergavekop bovenaan de pagina en klik op de optie in andere genomen converteren en definieer vervolgens het genoom van belang met behulp van het vervolgkeuzemenu onder de nieuwe genoomkop. Selecteer de gewenste genomische assemblage onder de nieuwe assemblagekop en klik op de verzendknop.
Zodra de browser een lijst met regio's in de nieuwe assembly met gelijkenis retourneert. Klik op de link naar de chromosoompositie om naar het homologe interessegebied te navigeren. Volg de eerder beschreven navigatiestrategieën om de volgorde te analyseren.
Om naar de genbeschrijvingspagina te navigeren, klikt u op het gen van belang in de gencodetrack in de UCSC-genoombrowser. Klik onder de volgorde en links naar tools en databases op de link in de tabel die andere soorten sneller leest. Klik op de vakjes die zijn gekoppeld aan de soort van belang om ze te selecteren.
Klik vervolgens op verzenden. Kopieer en plak de reeksen die onder aan de pagina in een sneller formaat worden weergegeven in een tekstverwerkingsdocument. Open vervolgens een tweede browservenster en navigeer naar de clustal omega multiple sequence alignment tool op de website van het European Bioinformatics Institute.
Plak de reeksbestanden op het klembord in het vak in stap één waarin reeksen in een ondersteunde indeling worden gelezen. Scroll naar de onderkant van de pagina en klik op verzenden. Observeer hieronder de uitgelijnde resultaten voor symbolen die de mate van conservering van elk aminozuur aangeven.
Om de aminozuureigenschappen en kleur te bekijken, klikt u op de link showkleuren direct boven de sequenties om de aminozuren te kleuren op basis van hun eigenschappen. Kopieer en plak vervolgens de volgorde-uitlijning in een tekstverwerkings- of diavoorstellingsprogramma om een figuur- of illustratiebestand te genereren. Om andere resultaten van de clustal omega-resultatenpagina te bekijken, klikt u op de tabbladen gidsboom of fylo genetische boom.
Klik ten slotte op het tabblad van de resultatenviewer voor opties om de sequentie-informatie te bekijken met behulp van jalview of om toegang te krijgen tot directe links naar mview en eenvoudige fylogenie. Een representatieve fylokocsf-analyse van het mitoreguline-gen geeft een gebied aan met een hoge sequentieconservatie dat overeenkomt met een gevalideerd micro-eiwit. De volledige mitoregulin-coderingssequentie bevindt zich in exon één en scoort zeer hoog op de fylokoCSF minus één spoor.
Een geconserveerd startcodon kan worden waargenomen aan het begin van het positief scorende gebied in de fylokoCSF minus één spoor. Het positief scorende gebied in het eerste exon van mitoregulin begint direct over een startcodon en eindigt bij het stopcodon. De meervoudige sequentie-uitlijning van het micro-eiwit mitoregulin voor acht verschillende soorten wordt hier weergegeven.
De analyse van de lange niet-coderende RNA-hete lucht toonde een negatieve score in het hele gen over alle zes sporen, wat wijst op een gebrek aan sequentiebehoud en ondersteunt dat hete lucht correct wordt geannoteerd als een niet-coderend RNA. PhyloCSF-analyse van het muis één, acht, één, nul, nul, vijf, acht, I 24 rike-gen toonde aan dat een geconserveerd open leesframe drie exonen omvat en de positieve phyloCSF-score springt van de plus twee track in exon één naar de plus drie track in exon twee, en dan terug naar de plus twee track in exon drie. PhyloCSF-analyse van de meet one gene locus werd ook effectief gebruikt om meerdere verschillende coderende open leesframes binnen een enkel RNA-molecuul te identificeren.
Het is belangrijk op te merken dat hoewel een positieve fylokocsf-score zeer suggestief is voor de micro-eiwitcoderende capaciteit, deze bewijslijn niet op zichzelf kan staan en experimenteel moet worden gevalideerd. Zodra een periode van micro-eiwit is geïdentificeerd, kan de aminozuursequentie worden geanalyseerd op geconserveerde domeinen of sequentiekenmerken om inzicht te geven in de functie ervan. PhyloCSF is effectief gebruikt om nieuwe micro-eiwitten te identificeren in genomische regio's waarvan eerder werd gedacht dat ze niet-coderend waren en zal een nuttig hulpmiddel blijven in toekomstige micro-eiwitidentificatiestudies.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie schetst een protocol voor het analyseren van genomische regio's om het potentieel van microproteïne-codering te beoordelen met behulp van PhyloCSF op de UCSC Genome Browser. De methodologie is ontworpen om gebruiksvriendelijk te zijn voor onderzoekers met verschillende achtergronden, waardoor de toegankelijkheid zonder voorafgaande bio-informaticatraining wordt benadrukt.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Onderzoeksgebied
- Genoomanalyse
- Identificatie van microproteïnen
- Bio-informatica tools
Achtergrond
- Microproteïnen zijn kleine proteïnen die belangrijke biologische functies kunnen hebben.
- Het identificeren van microproteïne-coderende regio's kan ons begrip van niet-coderende genomische gebieden verbeteren.
- De UCSC Genome Browser is een veelgebruikt hulpmiddel voor genoomonderzoek.
Gebruikte methoden
- Protocol dat PhyloCSF gebruikt om genomische sequenties te analyseren
- UCSC Genome Browser als primaire platform
- Tools voor sequentie-alignatie en conservatieanalyse
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van geconserveerde open leesframes in verschillende soorten.
- Hoge sequentieconservatie aangetoond in de microproteïne mitoregulin.
- Negatieve scorering in lang niet-coderend RNA hot air duidt op correcte annotatie.
Conclusies
- De studie biedt een praktische benadering om microproteïnen te identificeren, die bio-informatica en moleculaire biologie met elkaar verbindt.
- Deze bevindingen breiden de beschikbare bronnen voor genetisch onderzoek uit en verbeteren het begrip van het potentieel voor proteïne-codering.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Microprotein identification using evolutionary conservation analysis addresses a critical gap in genome annotation, enabling discovery teams to uncover previously overlooked functional elements. Integrating PhyloCSF with multi-species alignment enhances predictive confidence in distinguishing coding from noncoding regions, directly impacting target validation and early discovery triage. This approach supports risk-adjusted portfolio decisions by clarifying the coding potential of ambiguous genomic loci.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of noncanonical genomic regions for novel microprotein-coding potential.
- Supports functional target validation by leveraging evolutionary conservation as a mechanistic de-risking tool.
- Facilitates prioritization of candidate loci for downstream experimental validation and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated sequence candidates for assay development by confirming coding potential and conservation.
- Standardizes input for downstream screening workflows through quantitative PhyloCSF scoring and multi-species alignment.
- Enables reproducible identification of conserved microproteins, supporting scalable screening initiatives.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microprotein discovery with disease-relevant systems by confirming conservation across model organisms.
- Supports translational continuity by linking genomic annotation to functional protein-coding evidence.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by clarifying coding status of candidate transcripts.
Pipeline & Workflow Integration
This integrated workflow positions evolutionary conservation analysis at the interface of early discovery and lead identification, bridging genomic annotation with functional validation.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing for coding potential in ambiguous genomic regions.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for candidate prioritization in assay pipelines.
- Analytics: Generates multi-species sequence alignments and PhyloCSF scores to support comparative analysis.
- Translational Research: Ensures candidate microproteins are conserved in relevant preclinical species, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable framework for ongoing microprotein discovery across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in early discovery.
- Operational Value: Standardizes conservation analysis and sequence alignment for reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by clarifying coding potential early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of novel targets and supports advancement decisions with quantitative evidence.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with UCSC Genome Browser and public bioinformatics tools.
- Needs access to computational infrastructure for sequence alignment and conservation analysis.
- Demands cross-team standardization of scoring thresholds and annotation criteria.
- Adaptation may be needed for different species or genome assemblies.
- Experimental validation remains essential to confirm predicted coding potential.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:40
Loading the Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) Track Hub to the University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser
1:25
Navigating to Genes of Interest Using Gene Identifiers
2:20
Navigating to Genomic Regions of Interest Using Sequence Information
3:10
Identifying Conserved Short Open Reading Frames (sORFs) Using PhyloCSF Track Data
4:06
Viewing Homologous Regions in Other Genomes
4:51
Generating Multi-Species Sequence Alignments for Microproteins of Interest
6:47
Results: Identification of Genomic Regions of Interest for Microprotein-Coding Potential
8:47
Conclusion
