Name: Muggen-geassocieerde virusisolatie van in het veld verzamelde muggen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Leer virusisolatie uit muggen met Aedes albopictus en BHK-21 celculturen voor onderzoek naar door muggen overgedragen ziekten. Deze methode minimaliseert ethische bezwaren en besmettingsrisico's.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).

1. Bemonstering en sortering van muggen
<ol><li>Vang de volwassen muggen door de lichtvallen MXA-02 of kooldioxidemuggenvallen in het veld.</li>
	<li>Dood de verzamelde muggen door te dopen in vloeibare stikstof10,11. Transporteer ze naar het laboratorium door het logistieke systeem van de koelketen12. OPMERKING: Droogijs werd voornamelijk gebruikt in het logistieke systeem van de koelketen.</li>
	<li>(Optioneel) Als de monsterlocaties zich in de buurt van het laboratorium bevonden, stuur de levende muggen in de netvallen rechtstreeks naar het laboratorium en euthanaseer ze door ze gedurende 30minuten 4 bij ≤-20 °C in te vriezen.</li>
	<li>Maak een morfologische identificatie van de verzamelde muggen via het gereedschapsboek13 voor classificatie en identificatie van muggen. OPMERKING: Indien nodig kan DNA-barcodering worden gebruikt om muggen te classificeren en te identificeren14,15.</li>
	<li>Wijs ze op basis van bemonsteringsdatums en -locaties toe aan verschillende pools en bewaar ze vervolgens in buizen van 2-5 ml.</li>
	<li>Teken een tabel om elke buis vast te leggen met muggensoort, aantal, bemonsteringscode, datum en locaties.</li>
	<li>Druk de etiketten af met bemonsteringscodes en bevestig ze aan de buizen.</li>
	<li>Bewaar de buisjes met de muggenmonsters op -80 °C tot verdere analyse.</li>
</ol>2. Muggen slijpen
<ol><li>Plaats 20-50 muggen in elke 2 ml steriele buis met 3 mm keramische kralen met 1,5 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium met 2% penicilline-streptomycine-amfotericine B-oplossing. LET OP: Bewaar de tubes op ijs of op een anice tray.</li>
	<li>Homogeniseer de muggen met een weefselhomogenisator bij lage temperatuur door gedurende drie cycli 30 s bij 70 Hz bij 4 °C te malen16.</li>
	<li>Centrifugeer de mengsels gedurende 30 minuten bij 4 °C bij 15.000 × g en breng de supernatanten over in nieuwe buizen.</li>
	<li>Centrifugeer de supernatanten opnieuw bij 15.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het muggenrestente verwijderen 12,17. OPMERKING: Indien nodig kunnen de supernatanten worden gefilterd met behulp van 0,22 μm filters.</li>
	<li>Aliquoteer de supernatanten (P0) in opslagbuizen met schroefdop van 2 ml (200 μL per buis) en bewaar ze bij -80 °C.</li>
</ol>3. Bereiding van cellen en celkweekonderhoudsmedium
OPMERKING: Muggencellijn C6/36 (Aedes albopictus RNAi-deficiënt) en gewervelde cellijn BHK-21 (babyhamsternier) werden gebruikt voor de virusversterking en -isolatie.
<ol><li>Ent 1 × 106 C6/36 cellen in een kolf van75 cm 2 met 10 ml RPMI-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (P/S) bij 28 °C in een 5% CO2 bevochtigde couveuse.</li>
	<li>Ent 1 × 106 BHK-21 cellen in een 75 cm 2 kolf met 10 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS en 1% P/S bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator. OPMERKING: De cellen werden twee of drie keer per week gepasseerd17,18.</li>
	<li>Zaai de in een erlenmeyervan 75 cm 2 (C6/36- of BHK-21-cellen) gekweekte cellen in de 24-putplaten (C6/36 per put: 1,4 × 105; BHK-21 per put: 0,8 × 105).</li>
	<li>Plaats de 24-putplaten een nacht op 28 °C of 37 °C.</li>
	<li>Observeer de cellen onder de microscoop en bevestig of de celconfluentie in elke put 80% -90% is.</li>
	<li>Bereid het onderhoudsmedium voor de celkweek (500 ml). OPMERKING: Voor C6/36 was het medium RPMI-medium aangevuld met 2% FBS en 2% penicilline-streptomycine-amfotericine B-oplossing. Voor BHK-21 was het medium DMEM-medium aangevuld met 2% FBS en 2% penicilline-streptomycine-amfotericine B-oplossing.</li>
</ol>4. Virusisolatie
OPMERKING: Alle stappen werden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) laboratorium. De veiligheidsniveau-eis van het bioveiligheidslaboratorium werd bepaald door de bioveiligheidsrisicobeoordeling op basis van de regelgeving van verschillende landen en regio's. Het proces moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast.
<ol><li>Verwijder het celkweekmedium uit de 24-putplaten en voeg 100 μL van het celkweekonderhoudsmedium en 100 μL van het supernatant van het muggenhomogenaat (P0) toe aan elk putje.</li>
	<li>Incubeer de platen bij 28 °C of 37 °C gedurende 60 minuten en schud ze voorzichtig om de 15 minuten om uitdroging van de cellen te voorkomen.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en spoel elk putje voorzichtig af met 600 μL celkweekonderhoudsmedium om het vuil volledig te verwijderen.</li>
	<li>Voeg 800 μL celkweekonderhoudsmedium toe aan elke put en bewaar de platen gedurende 7 dagen in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 28 °C of 37 °C.</li>
	<li>Controleer de celtoestand van elke put dagelijks onder de microscoop15.</li>
	<li>Verzamel de supernatanten van cellen (P1 supernatanten) op de 7edag en bewaar de supernatanten bij -80 °C.</li>
	<li>Herhaal stap 4.1-4.6 2x om P2- en P3-supernatanten te krijgen. OPMERKING: In stap 4.3 was het voorzichtig spoelen van elke put met 600 μL celkweekonderhoudsmedium optioneel voor de P2 en P3.</li>
	<li>Afhankelijk van welke put het cytopathogene effect (CPE) vertoont - cellen sterven, pyknosis en maken los van het oppervlak; fusie met aangrenzende cellen om syncytie te vormen; of het uiterlijk van nucleaire of cytoplasmatische inclusielichamen - voeg 300-400 μL van het supernatant van deze CPE toe aan elke put van de nieuwe 6-putplaten met cellen (de celconfluentie was 80% -90%) om de virussen sterk te versterken.</li>
	<li>Verzamel de supernatanten en aliquot ze in 2 ml schroefdop opslagbuizen (500 μL per buis). Bewaar ze bij -80 °C. OPMERKING: Na drie generaties van opeenvolgende passaging in cellen werden de monsters die geen CPE induceerden weggegooid. Indien nodig kunnen de generaties van opeenvolgende passaging in cellen worden verhoogd.</li>
</ol>5. Detectie van virale sequenties door RT-PCR
<ol><li>Extraheer totaal RNA uit 200 μL van het virale supernatant met behulp van een virale RNA-minikit16. OPMERKING: Hier werd een geautomatiseerd nucleïnezuurextractiesysteem gebruikt om totaal RNA te extraheren volgens de instructies van de instrumentfabrikant.</li>
	<li>Converteer het RNA naar cDNA volgens de instructies van de RT-PCR-kit met behulp van een PCR-instrument.<ol><li>Voeg 15 μL RNA gemengd met 1 μL willekeurige primers toe aan de PCR-buis. Plaats de buis gedurende 5 minuten op 70 °C en plaats hem vervolgens gedurende 5 minuten op ijs.</li>
		<li>Voeg 5 μL 5x buffer en 25 μL mengsel (10 mM dNTP, 40 U/μL RNaseremmer en 200 U/μL M-MLV) toe aan de buis en plaats de buis op 42 °C gedurende 60 minuten en 95 °C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Bewaar de tube bij -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik een PCR-kit en universele primers (tabel 1) om virussen met PCR te detecteren.<ol><li>Stel voor arbovirussen het PCR-reactiesysteem (totaal 30 μL) in met de volgende componenten: 3 μL 10x Taq-buffer, 3 μL dNTP (1mM), 1 μL voorwaartse primer (10 μm), 1 μL omgekeerde primer (10 μm), 0,3 μL Taq (10 U/μL), 19,7 μL ddH 2 O en2μL cDNA.</li>
		<li>Stel voor de detectie van flavivirussen het reactieproces in als: stadium 1: 35 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 52 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s; fase 2: 72 °C gedurende 10 min.</li>
		<li>Stel voor de detectie van alfavirussen het reactieproces in als: fase 1: 35 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 50 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s; fase 2: 72 °C gedurende 10 min.</li>
		<li>Stel voor de detectie van bunyavirussen het reactieproces in als: fase 1: 35 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 50 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s; fase 2: 72 °C gedurende 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecteer de PCR-amplificatieproducten met 1% agarosegel-elektroforese en stuur ze op voor sequencinganalyse. OPMERKING: Als de omstandigheden het toelaten, kunnen de supernatanten een sequencinganalyse van de volgende generatie ondergaan om nieuwe virussen te identificeren en de volledige virale genoomseqeunces te verkrijgen.</li>
</ol>

<ol><li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-associated+viruses+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li>
<li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342(2020).</li>
<li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+%282007-2017%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079(2019).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li>
<li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265(2021).</li>
<li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873(2019).</li>
<li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses%3A+evolution%2C+infection%2C+and+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li>
<li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li>
<li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li>
<li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30(2018).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+%28BAV%29+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555(2018).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640(2020).</li>
<li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhou%2C+M+%22Handbook+for+Classification+and+Identification+of+Main+Vectors%22">Handbook for Classification and Identification of Main Vectors</a>. , Suzhou University Press. (2019).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li>
<li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bold%3A+The+Barcode+of+Life+Data+System+%28www.barcodinglife.org%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Notes%22%5BJournal%5D)">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298(2022).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963(1963).</li>
<li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan%2C+PR+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645(2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Het doel van deze methode was om een praktische manier te bieden voor het isoleren van muggen-geassocieerde virussen met behulp van verschillende cellijnen. Het is van cruciaal belang om het antibioticum-antimycoticum (penicilline-streptomycine-amfotericine) toe te voegen aan de supernatanten van de muggenhomogenaten om besmetting door bacteriën of schimmels te voorkomen. Muggen en virale supernatanten die in het veld worden verkregen, moeten bij -80 °C worden gekoeld om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen.
<p cla...

Muggen zijn een groep belangrijke pathogene geleedpotige vectoren. Er zijn ongeveer 3.500 soorten muggen in de familie Culicidae 1,2. De ontwikkeling van high-throughput sequencing-technologieën heeft geleid tot de ontdekking van vele nieuwe, virusachtige sequenties in muggen uit verschillende delen van de wereld3. Over het algemeen kunnen deze muggengerelateerde virussen worden ingedeeld in twee hoofdgroepen: MBV's en MSV's.
MBV's zijn een groep van diverse virussen die veroorzakers zijn van veel menselijke of dierlijke ziekten, zoals gelekoortsvirus (YFV), denguevirus (DENV), Japans encefalitisvirus (JEV), Westnijlvirus (WNV) en Rift Valley-koortsvirus (RVFV)4. Ze hebben de volksgezondheid ernstig bedreigd door ernstige morbiditeit en mortaliteit te veroorzaken bij zowel mensen als dieren over de hele wereld. MBV's ondersteunen van nature een levenscyclus tussen verschillende gastheren door overdracht van een geïnfecteerde mug naar een naïeve gastheer, evenals van een met virus geïnfecteerde gastheer en naar een voedende mug5. Daarom kunnen deze virussen zowel muggencellijnen als gewervelde cellijnen in het labinfecteren 1.
MSV's, waaronder Yichang-virus (YCN), Culex flavivirus (CxFV) en Chaoyang-virus (CHAOV), zijn een subgroep van insectenspecifieke virussen 1,6,7. In de afgelopen jaren is er een toename geweest in de ontdekking van nieuwe MSV's, en sommige van deze MSV's blijken een impact te hebben op de transmissie van MBV's. CxFV, dat een aanhoudende infectie in Culex pipiens kan zijn, kan bijvoorbeeld WNV-replicatie in een vroeg stadiumonderdrukken 8. Een ander insectspecifiek flavivirus, cell-fusing agent virus (CFAV), blijkt de verspreiding van DENV- en Zika-virus (ZIKV) in Aedes aegypti-muggen te remmen 9. Dit protocol is dus een nuttige benadering voor het isoleren van muggen-geassocieerde virussen en kan helpen bij verder onderzoek naar de verspreiding van pathogenen gerelateerd aan muggen en de bestrijding van door muggen overgedragen ziekten.

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m membraanfilter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>Polymeerfilms met specifieke poriegroottes. Om celldebris en bacteriën te verwijderen.</td></tr><tr><td>24-well platen</td><td>CORNING</td><td>3524</td><td>Containers voor cellen</td></tr><tr><td>75 cm2 flessen</td><td>CORNING</td><td>430641</td><td>Containers voor cellen</td></tr><tr><td>een steriele 2 mL buis met 3 mm keramische kralen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum-Antimycoticum</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Antibioticum in het medium om besmetting door bacteriën en schimmels te voorkomen</td></tr><tr><td>Geautomatiseerd nucleïnezuur extractiesysteem</td><td>NanoMagBio</td><td>S-48</td><td></td></tr><tr><td>BHK-21 cellen</td><td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C6/36 cellen</td><td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeermachine</td><td>Himac</td><td>CF16RN</td><td>Instrument voor centrifugatie van muggenmonsters</td></tr><tr><td>CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s minimaal essentieel medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>medium voor vertebrate cellijnen</td></tr><tr><td>Ebinur Lake virus</td><td></td><td></td><td>Cu20-XJ isolatie</td></tr><tr><td>Feta bovien serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td> Zorgt voor voeding voor cellen</td></tr><tr><td>Hogesnelheids, lage temperatuur weefsel homogenisator</td><td>servicebio</td><td>KZ-III-F</td><td>Instrument voor het malen</td></tr><tr><td>Incubator (28 &deg;C)</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td>Instrument voor celcultuur</td></tr><tr><td>Incubator (37 &deg;C)</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td>Instrument voor celcultuur</td></tr><tr><td>PCR buis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15410-122</td><td>Antibioticum in het medium om besmetting door bacteriën te voorkomen</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine-Amfoterici B-oplossing</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Koelkast (-80 &deg;C)</td><td>sanyo</td><td>MDF-U54V</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute&nbsp; medium (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>medium voor muggencellijnen</td></tr><tr><td>Schroefdop opslagbuizen (2 mL)</td><td>biofil</td><td>&nbsp;FCT010005</td><td></td></tr><tr><td>Steriele stampers</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y004</td><td>Verbruiksartikelen&nbsp; voor het malen</td></tr><tr><td>TGrinder OSE-Y30 elektrische weefselmolen</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y30</td><td>Instrument voor het malen</td></tr><tr><td>De dissectiemicroscoop</td><td>ZEISS</td><td>stemi508</td><td></td></tr><tr><td>De lichtvallen MXA-02</td><td>Maxttrac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>De muggen absorberende machine</td><td>Ningbo Bangning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>De pipettentips</td><td>Axygen</td><td>TF</td><td></td></tr><tr><td>Het QIAamp virale RNA mini-kit</td><td>QIAGEN</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Dumont</td><td>0203-5-PO</td><td></td></tr></tbody></table>

muggen-geassocieerde virusisolatie van in het veld verzamelde muggen

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

Met de brede toepassing van sequencingtechnologieën zijn veel nieuwe virusachtige sequenties ontdekt in geleedpotigen, waaronder muggen. De twee belangrijkste categorieën van deze nieuwe muggen-geassocieerde virussen zijn "mug-borne virussen (MBV's)" en "mug-specifieke virussen (MSV's)". Deze nieuwe virussen kunnen pathogeen zijn voor zowel gewervelde dieren als muggen, of ze kunnen gewoon symbiotisch zijn met muggen. Entiteitsvirussen zijn essentieel om de biologische kenmerken van deze virussen te bevestigen. Zo is hier een gedetailleerd protocol beschreven voor virusisolatie en versterking van in het veld verzamelde muggen. Eerst werden de muggenmonsters bereid als supernatanten van muggenhomogenaten. Na tweemaal centrifugeren werden de supernatanten vervolgens ingeënt in muggencellijn C6/36 of gewervelde cellijn BHK-21 voor virusversterking. Na 7 dagen werden de supernatanten verzameld als de P1-supernatanten en bewaard bij -80 °C. Vervolgens werden P1-supernatanten nog twee keer gepasseerd in C6/36- of BHK-21-cellen terwijl de celstatus dagelijks werd gecontroleerd. Toen cytopathogeen effect (CPE) op de cellen werd ontdekt, werden deze supernatanten verzameld en gebruikt om virussen te identificeren. Dit protocol dient als basis voor toekomstig onderzoek naar muggen-geassocieerde virussen, waaronder MBV's en MSV's.

Na inenting met de supernatanten van de muggenhomogenaten (P0) vertoonden de C6/36-cellen een brede intercellulaire ruimte en geëxfolieerde cellen werden waargenomen na 120 uur (figuur 1A) in vergelijking met de niet-geënte cellen (controle) op hetzelfde moment (figuur 1B). Na het incuberen van de BHK-21-cellen met de P3-supernatanten werd zichtbare CPE waargenomen in de BHK-21-cellen na 48 uur (figuur 1C) in tegenstelling tot de co...

Talrijke nieuwe virusachtige sequenties zijn gevonden in muggen als gevolg van het uitgebreide gebruik van sequencing-technologieën. We bieden een effectieve procedure voor het isoleren en versterken van virussen met behulp van gewervelde en muggencellijnen, die als basis kunnen dienen voor toekomstige studies naar muggengerelateerde virussen, waaronder door muggen overgedragen en muggenspecifieke virussen.

Muggen-geassocieerde virusisolatie van in het veld verzamelde muggen

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Dit protocol is een nuttige aanpak voor het isoleren van muggen-geassocieerde virussen en kan helpen bij verder onderzoek naar de verspreiding van pathogenen gerelateerd aan muggen en de bestrijding van door muggen overgedragen ziekten. Het gebruik van dunne lijnen om virussen te isoleren in bioveiligheidsniveau 2 laboratorium is veiliger en efficiënter. In tegenstelling tot andere virusisolatieprocedures, zoals het fietsen van rode inenting met variërende vloeistof, vereist deze techniek geen dierproeven of ethische beoordeling.De besmetting van monsters en de cellen die tijdens de incubatie worden getekend, kan leiden tot het mislukken van het experiment. Daarom is het noodzakelijk om 2% Penicilline-Streptomycine-Amfotericine in het medium toe te voegen om besmetting te voorkomen. Begin met de toevoeging van drie millimeter keramische kralen, 1,5 milliliter RPMI-medium aangevuld met 2% Penicilline-Streptomycine-Amfotericine B-oplossing in een steriele buis van twee milliliter die op ijs wordt geplaatst en breng er vervolgens 50 muggen in over.Homogeniseer vervolgens de muggen met een weefselhomogenisator op lage temperatuur door gedurende 30 seconden te malen bij 70 hertz en 4 graden Celsius gedurende 3 cycli. Centrifugeer het homogenaat bij 15.000 G gedurende 30 minuten bij 4 graden Celsius en breng de supernatanten over naar de nieuwe buizen. Om het muggenresten volledig te verwijderen, centrifugeert u het supernatant opnieuw bij 15.000 G gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius.Aliquot de 200 microliter supernatant P0 in een opslagbuis met schroefdop van twee milliliter en bewaar deze bij min 80 graden Celsius. Gebruik voor de virusversterking Aedes albopictus RNAi-deficiënte muggencellijn C6/36 en een gewervelde cellijn, babyhamsternier of BHK-21 uit een vierkante kolf van 75 centimeter en zaai ze afzonderlijk in 24 putplaten. Leg de gezaaide 24 putplaat een nacht op 28 of 37 graden Celsius.Observeer de volgende dag de cellen onder de microscoop om 80 tot 90% samenvloeiing in elke put te bevestigen. Bereid 500 milliliter van het celkweekonderhoudsmedium aangevuld met antibiotica. Verwijder het celkweekmedium uit de 24 putplaten en voeg 100 microliter van het celkweekonderhoudsmedium toe aan elke put.Ent vervolgens de cellen met 100 microliter van het supernatant van het muggenhomogenaat of P0. Incubeer de platen op 28 of 37 graden Celsius gedurende 60 minuten en schud de platen voorzichtig na elke 15 minuten om het drogen van de cellen te voorkomen. Als u klaar bent, verwijdert u het supernatant en spoelt u elke put af met 600 microliter celkweekonderhoudsmedium om het vuil volledig te verwijderen. Voeg vervolgens 800 microliter celkweekonderhoudsmedium toe aan elke put voordat u de platen gedurende 7 dagen in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator bij 28 of 37 graden Celsius plaatst.Controleer dagelijks de toestand van de cellen van elke put onder de microscoop. Verzamel op de zevende dag het supernatant van cellen die bekend staat als P1 en bewaar het bij min 80 graden Celsius. Herhaal de procedure om P2- en P3-virale supernatanten te verzamelen.Door het cytopathogene effect, of CPE, sterven cellen uit sommige van de putten en maken ze los van het oppervlak. Om de virussen sterk te versterken, verzamel 300 tot 400 microliter van het supernatant uit putten met het CPE-effect en breng het over naar een nieuwe zesputplaat met 80 tot 90% celconfluentie van kweekcellen. Verzamel en breng ten slotte 500 microliter van het supernatant over van de putten van de zesputplaat naar opslagbuizen met schroefdop van twee milliliter voordat u ze opslaat bij min 80 graden Celsius.De inenting van C6/36-cellen met de muggenhomogenaten P0 vertoonde een brede intercellulaire ruimte in geëxfolieerde cellen 120 uur na de infectieperiode in vergelijking met de niet-geënte of controlecellen. Incubatie van BHK21-cellen met de P3-virale supernatanten toonde een zichtbare CPE 48 uur na infectie, met de dood van de cel en loslating van het oppervlak in tegenstelling tot de controlecellen. In de handel verkrijgbare universele primers of Flavivirussen, Alphavirussen en Bunyavirussen werden gebruikt om de PCR-producten voor het virale supernatant te genereren.Een PCR-product voor het Bunyavirus, Ebinur Lake-virus, werd ingesteld als een positieve controle. De PCR-versterkingsverboden in banen van Bunyavirussen en de positieve controle benadrukten de mogelijkheid van de aanwezigheid van Bunyavirus in de supernatanten. Om het slagingspercentage van virusisolatie te verbeteren, moet u een lage temperatuur aanhouden tijdens monstertransport, isolatie en malen.Voeg antibiotica toe bij het homogeniseren van de muggen en de cultuur zelf. En behandel de cultuur snel tijdens de incubatie en het verwijderen van het kweekmedium. Naast deze procedure kan de maaloplossing worden geïnjecteerd in een fietsende rat of kippenembryo.De bevestigingsprocedure zal echter ethische bezwaren oproepen en de kosten van het experiment verhogen.

mosquito-associated-virus-isolation-from-field-collected-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel refractaire voor het dengue virus moet worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van virale infecties in de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van dengue infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor het groeien van het virus in de cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.

Protocol voor Dengue Infecties in Muggen (A. aegypti) en Infectie Fenotype Bepaling

Methoden voor het gebruik van Alphavirus transducing systemen om TL-verslaggevers uit te drukken in vitro en in volwassen muggen worden beschreven. Deze techniek kan worden aangepast aan een eiwit van belang uit te drukken in plaats van of naast een verslaggever.

Alphavirus Transducing System: Tools voor het visualiseren van besmetting in Mosquito Vector

Genetische kruisen van knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het voeren van twee genetisch verschillende parasieten aan muggen. Recombinant nakomelingen zijn gekloond van muizen bloed na waardoor muggen om geïnfecteerde muizen bijten. Deze video laat zien hoe de productie van genetisch kruisen...

Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Een vereenvoudigde toch nauwkeurige methode voor het verzamelen en vlekken mug hemocytes wordt beschreven. Onze methode combineert de eenvoud van perfusie met de nauwkeurigheid van hoge injectie technieken om schoon voorbereidingen van hemocytes in Aedes muggen te isoleren. Deze methode maakt studies vereist kennis van de soorten hemocytes en hun overvloed.

Een protocol voor het verzamelen en Kleuring Hemocytes uit de Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti</em

We beschrijven een methode voor het verwerken en het scherm het veld verzameld muggen voor een diversiteit aan virussen door Vero celcultuur assay. Door gebruik te maken van deze techniek, hebben we ontdekt 9 verschillende virussen van vier taxonomische families in muggen verzameld in Connecticut.

Detectie van infectieus virus van Field-Muggen verzameld door Vero Cell Culture Assay

Source: Liu, X., et al. A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the dissection of the mosquito midgut to isolate gut bacteria. The midgut is extracted from the digestive tract, homogenized to release the bacteria, and plated on nutrient agar to culture bacterial colonies.

Isolation of Bacteria from the Mosquito Midgut

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Voor een efficiënte controle van mug virusverspreiding gedragen, is de kennis van het potentieel van de vector van respectieve muggen van bijzonder belang. Beschrijven we gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van vector bevoegdheid van Aedes albopictus en drie verschillende Culex taxa voordeoverdracht van Zika-virus.

Gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van Vector bevoegdheid van muggen

Het gepresenteerde protocol kan de vectorcompetentie van Aedes aegypti-muggenpopulaties voor een bepaald virus, zoals Zika, in een containmentomgeving bepalen.

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

Deze methodologie, die orale voeding en intrathoracale injectie-infectie omvatte, kon de invloed van midgut- en / of speekselklierbarrières op arbovirusinfectie effectief beoordelen.

Experimentele virale infectie bij volwassen muggen door orale voeding en micro-injectie

Leer virusisolatie uit muggen met Aedes albopictus en BHK-21 celculturen voor onderzoek naar door muggen overgedragen ziekten. Deze methode minimaliseert ethische bezwaren en besmettingsrisico's.

Muggen-geassocieerde virusisolatie van in het veld verzamelde muggen

Meer video's verkennen