Name: Ex Vivo Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer een snelle methode voor ex vivo gendeletie in muizen urotheelcellen met adenovirus-Cre om blaaskanker organoïden te genereren. Deze aanpak versnelt onderzoek naar kankerbiologie aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoekswerk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 en R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), de Roswell Park Alliance Foundation en de Friends of Urology Foundation. Wij danken Marisa Blask en Mila Pakhomova voor het proeflezen van het manuscript.

Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in het Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 en 180502). OPMERKING: Voer stap 1-3 op dezelfde dag uit.
1. Dissectie van de muizenblaas
<ol><li>Voorbereiding voor dissectie<ol>
<li>Bereid alle steriele instrumenten voor, waaronder scharen, tangen, steriele DPBS in 35 mm kweekschalen, 70% ethanol, steriel gaas en schone papieren handdoeken. Reinig alle oppervlakken van het dissectiegebied. Genereer mannelijke triple floxed muizen Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f (4 muizen, 10 weken oud), zoals eerder beschreven in dr. Goodrich's lab 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanasie en incisie<ol>
<li>Euthanaseer de muizen door CO 2-verstikking met een stroomsnelheid van 2,0 l / min, gevolgd door cervicale dislocatie. Reinig het dissectiegebied met 70% ethanol en dek af met een schone papieren handdoek.</li>
		<li>Plaats de muis op gaas in het dissectiegebied. Spuit 70% ethanol op de buik van de muis en gebruik een steriele dissectieschaar om een onderste buikincisie te maken die de blaas blootlegt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De blaas ontleden<ol>
<li>Gebruik een tang om de blaas vast te pakken en trek voorzichtig omhoog zodat bilaterale ureterovesicale juncties worden geïdentificeerd. Gebruik een schaar om de blaasfundus te verwijderen volgens de grenslijn tussen de twee urineleideropeningen.</li>
		<li>Breng de blaas over in een steriele schaal met 2 ml DPBS. Verwijder vet- en bindweefsel en doe de blaas in een nieuwe schaal met steriele 2 ml DPBS. Haal op dit moment het adenovirus uit -80 °C opslag en bewaar het op ijs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Dissociatie van urotheelcellen
<ol><li>Voorbereiding voor celdissociatie<ol>
<li>Bereid alle steriele instrumenten voor, inclusief tang, chirurgische scalpels (een mes van maat 10 met handvat), steriele DPBS in kweekschalen van 35 mm, compleet kweekmedium zonder houtskoolgestripte FBS gedefinieerd als CCM(-), collagenase/hyaluronidasemengsel, recombinant enzym voor trypsinevervanger, 10% houtskoolgestripte FBS in DPBS met 10 μM vers Y-27632, een steriele celzeef van 100 μm en een centrifugebuis van 15 ml. OPMERKING: Het volledige kweekmedium (CCM) bestaat uit borstepitheelcelgroeimedium aangevuld met de verstrekte groeifactoren en 5% houtskool-gestripte FBS, 1% L-glutaminevervanger, 100 μg / ml primocine en 10 μM vers Y-27632.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gehakt en vertering van de blaas<ol>
<li>Breng de blaas over en was deze opnieuw met 2 ml steriele DPBS in een schaal van 35 mm in een bioveiligheidskast.</li>
		<li>Verzamel blaasdoekjes van vier muizen in een schaal met 1 ml CCM(-) en hak elke blaas in vier gelijke stukken met een chirurgisch mes. Gebruik een tang om de blaas uit te vouwen om het urotheeloppervlak bloot te stellen aan het medium.</li>
		<li>Breng de blaasstukken en het medium over in een centrifugebuis van 15 ml. Was de schaal met 2 ml CCM(-) 2x en verzamel deze in een centrifugebuis tot een totaal volume van 5 ml.</li>
		<li>Voeg het collagenase/hyaluronidasemengsel toe tot een eindconcentratie van 300 E/ml collagenase en 100 E/ml hyaluronidase en plaats de buis horizontaal in een 37 °C orbitale broedschudder gedurende 30 minuten bij 200 tpm.</li>
		<li>Voeg na weefselvertering een gelijk volume (5 ml) van 10% houtskool-gestripte FBS in DPBS toe aan de buis en centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 200 x g .</li>
		<li>Verwijder het supernatant en gooi het weg. Voeg 2 ml trypsinevervanger toe aan de celkorrel en meng goed. Plaats de buis in een celincubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 4 min.</li>
		<li>Pipetteer na incubatie 10x op en neer met een standaard P1000-tip. Voeg 5 ml 10% houtskoolgestripte FBS toe in DPBS.</li>
		<li>Zeef de gedisassocieerde cellen door een steriele celzeef van 100 μm. Verzamel de celsuspensie en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellen tellen en resuspending<ol>
<li>Verwijder het supernatant en gooi het weg. Resuspend de celkorrel met 1 ml CCM.</li>
		<li>Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer en plaats slechts 0,5 x 106 cellen in een put van een 24-putplaat met 0,5 ml verse CCM. Haal op dit moment de matrixextracten van Engelbreth-Holm-Swarm muizensarcoomcellen (zie Tabel met materialen) uit -20 °C opslag en ontdooi op ijs. Verwarm een 6-well plaat voor in een celincubator van 37 °C. OPMERKING: De resterende cellen kunnen worden gecentrifugeerd en ingevroren als celpellets voor niet-virustransductiecontrole.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Adenovirale transductie en plating organoïden
LET OP: Wees voorzichtig bij het verwerken van adenovirus. Laboratoriumpersoneel moet bioveiligheidsniveau 2-praktijken volgen en adenovirus desinfecteren met 10% bleekmiddel.
<ol><li>Voeg 2 μL adenovirus (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL) toe aan de 24-well plaat. Meng goed met de gedisassocieerde urotheelcellen.</li>
	<li>Om de transductie-efficiëntie te verbeteren, voert u spinoculatie uit door de 24-wells plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g te centrifugeren. Plaats de 24-well plaat in een celincubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur.</li>
	<li>Breng cellen en medium uit de put over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g . Verwijder en gooi het supernatant weg, voeg 50 μL CCM toe en meng goed met de cellen aan de onderkant.</li>
	<li>Voeg 140 μL matrixextract toe en meng voorzichtig goed om luchtbellen te voorkomen. Voeg de oplossing snel toe aan de voorverwarmde 6-putplaat bij 50 μL/koepel om koepels voor organoïden te creëren.</li>
	<li>Breng de plaat voorzichtig over in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en laat de koepels gedurende 5 minuten stollen. Draai de 6-putplaat ondersteboven en ga nog eens 25 minuten door met stollen.</li>
	<li>Voeg na incubatie 2,5 ml CCM toe aan elke put en plaats de plaat in een incubator voor organoïdekweek.</li>
</ol>4. Organoïde kweken en passeren
<ol><li>Vervang het medium elke 3-4 dagen. Voer organoïde kweken, passeren en bevriezen uit zoals gerapporteerd in Lee et al.9. Voer inbedding van organoïden uit met behulp van monsterverwerkingsgel zoals beschreven in Fujii et al.10.</li>
	<li>Verwijder het medium en voeg 1 ml dispase toe aan elke put. Breek de koepel voorzichtig en meng goed met een P1000 pipetpunt.</li>
	<li>Plaats de plaat gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C met 5% CO2 . Verzamel vervolgens alle cellen in een centrifugebuis van 15 ml en was de put met 4 ml 10% houtskool-gestripte FBS in DPBS. Als de organoïde cellen als grote clusters worden weergegeven, voert u stap 2.2.6 uit. en stap 2.2.7. om gedisassocieerde cellen te krijgen.</li>
	<li>Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 200 x g . Verwijder het supernatant en was de cellen met 1 ml CCM.</li>
	<li>Resuspend de cellen in 70% matrixextract en volg stap 3.4.-3.6. om te kweken. Als alternatief kunt u de cellen cryopreserveren door resuspendatie in 90% houtskool-gestripte FBS en 10% DMSO aangevuld met 10 μM verse Y-27632.</li>
</ol>5. Organoïde cellen implantatie in C57BL / 6J muis subcutaan
<ol><li>Voorbereiding voor implantatie<ol>
<li>Bereid 25G 1.5 in naalden, een spuit van 1 ml, 1 mg /ml dispase, matrixextract, 10% houtskool-gestripte FBS in DPBS met 10 μM verse Y-27632 en een centrifugebuis van 15 ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verzameling organoïde cellen<ol>
<li>Na het bereiken van een stabiele cultuur gedurende ten minste 5 passages, verzamelt u de geëxpandeerde organoïde cellen voor in vivo injectie. Volg stappen 4.2.-4.4. en resuspend cellen in 1 ml CCM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellen tellen en subcutane injectie<ol>
<li>Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Na centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten, resuspend 2 x 106 cellen in 100 μL 50% matrixextract in DPBS. Plaats de suspensie op ijs en neem deze mee in een bioveiligheidskast in een dierenverplegingsruimte.</li>
		<li>Anesthetiseer twee mannelijke C57BL/6J muizen (10 weken oud) met 4% isofluraan en 1 L/min O2 flow gedurende ongeveer 4 min in een kamer. Zodra de muizen hun rechtzettingsreflex hebben verloren en hun ademhalingspatroon dieper en langzamer is geworden, brengen de muizen over naar een niet-rebreathing circuit met 2% isofluraan en 1 L / min O2-stroom . Breng dierenartszalf aan om de ogen van de dieren te beschermen tegen traumatisch letsel.</li>
		<li>Scheer een gebied rond de injectieplaats op de rechterflank van de muis en gebruik 70% ethanol om te reinigen, en gebruik vervolgens een naald van 25 G om de 100 μL celsuspensie onder anesthesie rechtstreeks in de rechterflank te injecteren.</li>
		<li>Verwijder na injectie de inhalatie-anesthesie en plaats de muizen in een kooi onder een warmtelamp totdat ze volledig zijn hersteld en gemobiliseerd. Breng de muizen terug voor huisvesting en controleer de tumorvorming.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Tumorverzameling en in vivo voortplanting
<ol><li>Volg de voorbereiding Stap 2.1.1. Euthanasie muizen door CO 2-verstikking met behulp van een stroomsnelheid van 2,0 l / min gevolgd door cervicale dislocatie nadat een tumor met een diameter van ~ 2,0 cm (bijna 2-3 weken) is gevormd. Breng de muizen over naar een schoon dissectiegebied, spuit 70% ethanol op het tumorgebied van de muisflank en gebruik steriele dissectieschaar en tang om een incisie te maken om de tumor te scheiden.</li>
	<li>Was de tumor in een schaal van 60 mm met 5 ml DPBS en gebruik een schaar om het bindweefsel te verwijderen. Snijd een stuk van de verse tumor en zink het met 4% paraformaldehyde in DPBS gedurende 48 uur en stuur voor paraffine-inbedding en sectie voor histologische analyse.</li>
	<li>Verwerk de andere helft van de verse tumor voor celdisassociatie. Hak de verse tumor kort in 1 mm3 stukjes voor dissociatie in een schaal van 60 mm met 5 ml CCM(-). Injecteer vervolgens, na het volgen van stap 2.2.4.-2.2.8., de gedisassocieerde cellen in nieuwe C57BL/6J-muizen voor in vivo passaging na stap 5.3. of bewaren als in vitro organoïde cultuur volgens stappen 3.4.-3.6., of direct invriezen in vloeibare stikstof met behulp van 90% houtskool-gestripte FBS en 10% DMSO met 10 μM vers Y-27632.</li>
	<li>Herstel indien nodig de bevroren cellen door ze snel te ontdooien in een waterbad van 37 °C en te wassen met CCM(-). Resuspend ze hierna in 100 μL 50% matrixextract in DPBS voor directe injectie in muizen voor in vivo tumorvorming. Gebruik ten minste 2 x 106 ontdooide cellen voor één in vivo injectie.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2021%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2FOncology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li>
<li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li>
<li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li>
<li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids%3A+A+tool+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li>
<li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+bladder+cancer+in+mice%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li>
<li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li>
<li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity%2C+metastasis%2C+and+antiandrogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li>
<li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li>
<li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li>
<li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f%28high%29+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407(2019).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li>
<li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer%3A+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li>
<li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li>
<li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li>
<li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160(2010).</li>
<li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118(2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

GEMM's zijn de gouden standaard voor kankermodellering geïnitieerd vanuit normale cellen, waardoor de gevolgen van potentiële oncogene verstoringen (oncogenactivering en / of verlies van tumoronderdrukkers) rigoureus kunnen worden getest. Hier wordt een snel en efficiënt protocol aangeboden om blaaskankerorganoïden te genereren via ex vivo genbewerking van normale muis-urotheelcellen die gevlokte allelen dragen in genen van belang. H&E- en IHC-kleuring tonen aan dat TKO-organoïden histologie vertonen die consist...

Blaaskanker is de vierde meest voorkomende kanker bij mannen en treft jaarlijks meer dan 80.000 mensen in de Verenigde Staten1. Platina-gebaseerde chemotherapie is al meer dan drie decennia de standaardzorg voor patiënten met gevorderde blaaskanker. Het landschap van de behandeling van blaaskanker is revolutionair veranderd door de recente goedkeuring door de Food and Drug Administration (FDA) van immunotherapie (anti-PD-1 en anti-PD-L1 immuuncheckpointremmers), erdafitinib (een fibroblastgroeifactorreceptorremmer) en enfortumab vedotin (een antilichaam-geneesmiddelconjugaat)2,3,4. Er zijn echter geen klinisch goedgekeurde biomarkers beschikbaar voor het voorspellen van de reacties op chemotherapie of immunotherapie. Er is een kritieke behoefte om informatieve preklinische modellen te genereren die het begrip van de mechanismen die de progressie van blaaskanker stimuleren kunnen verbeteren en voorspellende biomarkers voor verschillende behandelingsmodaliteiten kunnen ontwikkelen.
Een belangrijk obstakel in blaastranslationele onderzoeken is het gebrek aan preklinische modellen die de pathogenese en behandelingsresponsen van menselijke blaaskanker samenvatten 5,6. Er zijn meerdere preklinische modellen ontwikkeld, waaronder in vitro 2D-modellen (cellijnen of voorwaardelijk geherprogrammeerde cellen), in vitro 3D-modellen (organoïden, 3D-printen) en in vivo modellen (xenograft, kankerverwekkende, genetisch gemanipuleerde modellen en patiënt-afgeleide xenograft)2,6. Genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's) zijn nuttig voor vele toepassingen in de blaaskankerbiologie, waaronder analyses van tumorfenotypen, mechanistisch onderzoek van kandidaatgenen en/of signaalroutes, en de preklinische evaluatie van therapeutische responsen 6,7. GEMM's kunnen site-specifieke recombinases (Cre-loxP) gebruiken om genetische deleties in een of meer tumorsuppressorgenen te controleren. Het proces van het genereren van gewenste GEMM's met meerdere gendeleties is tijdrovend, arbeidsintensief en duur5. Het algemene doel van deze methode is het ontwikkelen van een snelle en efficiënte methode van ex vivo Cre-toediening voor het vaststellen van blaas triple knockout (TKO) modellen van normale muis urotheelcellen met triple floxed allelen (Trp53, Pten en Rb1)8. Het grote voordeel van de ex vivo methode is de snelle workflow (1-2 weken in plaats van jaren muizenfok). Dit artikel beschrijft het protocol voor het oogsten van normale urotheelcellen met gevlokte allelen, ex vivo adenovirustransductie, organoïde culturen en in vitro en in vivo karakterisering bij immunocompetente C57 BL/6J muizen. Deze methode kan verder worden gebruikt om klinisch relevante blaaskankerorganoïden te genereren in immunocompetente muizen die een combinatie van gevlokte allelen herbergen.

<table><tbody><tr><td>100 &mu;m steriele celstrainer</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>1 mL spuit</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>25G 1,5 inch naald</td><td>EXELINT International</td><td>26406</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td><td>UI Viral Vector Core</td><td>VVC-U of Iowa-5-HT</td><td></td></tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>Jackson Lab</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Charcoal-gestroopt FBS</td><td>Gibco</td><td>A3382101</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase/hyaluronidase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07912</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07913</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine substituut (GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>Borstepitheelcelgroeimedium</td><td>Lonza</td><td>CC-3150</td><td></td></tr><tr><td>Matrix-extracten uit Engelbreth&ndash;Holm&ndash;Swarm muizensarcoom (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaal muis anti-CK20</td><td>DAKO</td><td>M7019</td><td>IF 1:100</td></tr><tr><td>Monoklonaal muis anti-CK7</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-23876</td><td>IHC 1:50</td></tr><tr><td>Monoklonaal muis anti-p63</td><td>Abcam</td><td>ab735</td><td>IHC 1:100, IF 1:50</td></tr><tr><td>Monoklonaal muis anti-Upk3</td><td>Fitzgerald</td><td>10R-U103A</td><td>IHC 1:50</td></tr><tr><td>Monoklonaal muis anti-Vimentin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6260</td><td>IF 1:100</td></tr><tr><td>Monoklonaal rat anti-CK8</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>TROMA-I-s</td><td>IF 1:100</td></tr><tr><td>HERAcell vios 160i CO2-incubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonaal kippen anti-CK5</td><td>Biolegend</td><td>905901</td><td>IF 1:500</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant enzym van trypsin-substituut (TrypLE Express Enzyme)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Signature benchtop schuddende incubator Model 1575</td><td>VWR</td><td>35962-091</td><td></td></tr><tr><td>Specimenverwerkingsgel (HistoGel)</td><td>Thermo Fisher</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch mesje maat 10</td><td>Integra Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004377</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall T1 centrifuge</td><td>Thermo Fisher</td><td>75002383</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo organoïde model van adenovirus-cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Blaaskanker is een onderbelicht gebied, met name in genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's). Inteelt GEMM's met weefselspecifieke Cre- en loxP-sites zijn de gouden standaard voor voorwaardelijke of induceerbare gentargeting. Om snellere en efficiëntere experimentele modellen te bieden, wordt een ex vivo organoïde kweeksysteem ontwikkeld met behulp van adenovirus Cre en normale urotheelcellen die meerdere loxP-allelen van de tumoronderdrukkers Trp53, Pten en Rb1 dragen. Normale urotheelcellen zijn enzymatisch gescheiden van vier blazen van triple floxed muizen (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). De urotheelcellen worden ex vivo getransduceerd met adenovirus-Cre aangedreven door een CMV promotor (Ad5CMVCre). De getransduceerde blaasorganoïden worden gekweekt, vermeerderd en gekarakteriseerd in vitro en in vivo. PCR wordt gebruikt om gendeleties in Trp53, Pten en Rb1 te bevestigen. Immunofluorescentie (IF) kleuring van organoïden toont positieve expressie van urotheliale afstamming markers (CK5 en p63). De organoïden worden subcutaan geïnjecteerd in gastheermuizen voor tumorexpansie en seriële passages. De immunohistochemie (IHC) van xenografts vertoont positieve expressie van CK7, CK5 en p63 en negatieve expressie van CK8 en Uroplakine 3. Samenvattend is adenovirus-gemedieerde gendeletie uit muizenurotheelcellen die zijn gemanipuleerd met loxP-sites een efficiënte methode om snel het tumorigene potentieel van gedefinieerde genetische veranderingen te testen.

De workflow van adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizenurotheelcellen is weergegeven in figuur 1A. De bijbehorende video laat zien hoe de urotheelcellen worden losgekoppeld van de fundus van de blaas en hoe de triple floxed cellen ex vivo worden getransduceerd met Ad5CMVCre. Figuur 1A toonde aan dat minimale submucosa en spiercellen werden gedisassocieerd na enzymvertering. Om de efficiëntie van adenovirus-Cre-toediening te bevestigen, werden g...

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren en karakteriseren van muis urotheliale organoïden die deleties in genen van belang herbergen. De methoden omvatten het oogsten van muizenurotheelcellen, ex vivo transductie met adenovirus dat Cre-expressie drijft met een CMV-promotor, en zowel in vitro als in vivo karakterisering.

Ex Vivo Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

We ontwikkelden een snel en efficiënt protocol om blaaskankerorganoïden te genereren via ex vivo genbewerking van normale muis-urotheelcellen die floxed allelen dragen in genen van belang. Deze ex vivo methode heeft een workflow van één tot twee weken in plaats van jaren van muizen fokken, en het is zeer efficiënt in adenovirustransductie op de Cre-gemedieerde gendeleties. Bereid om te beginnen alle steriele instrumenten en reagentia voor, inclusief scharen, tangen, DPBS in 35-milliliter kweekschalen, 70% ethanol, gaas en schone papieren handdoeken.Reinig vervolgens alle oppervlakken van het dissectiegebied en bedek het dissectiegebied met een schone papieren handdoek. Plaats de geëuthanaseerde muis op het gaas in het dissectiegebied en spuit 70% ethanol op de buik van de muis, maak vervolgens met behulp van een steriele dissectieschaar een onderste buikincisie om de blaas bloot te leggen. Gebruik nu de tang om de blaas vast te pakken en voorzichtig omhoog te trekken om de bilaterale ureterovesicale overgang te identificeren.Verwijder met een schaar de blaasfundus, volg de grenslijn tussen de twee urineleideropeningen en breng de blaas over in een steriele schaal met 2 milliliter D

ex-vivo-organoid-model-adenovirus-cre-mediated-gene-deletions-mouse

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In deze video gebruiken we een adenovirus het dragen van de Cre-recombinase-gen tot de primaire muis embryonale fibroblasten het dragen van een floxed Rac1 allel infecteren.

Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

Mechanosensorische haarcellen zijn de receptor cellen van het binnenoor. De meest...

Dissectie van volwassen muis Utricle en Adenovirus-gemedieerde Ondersteunende-cel infectie

This video describes the generation of a colorectal mouse model by segmental adeno-cre infection. The infected colon segment leads to tumorigenesis within this segment of the mucosa, resulting in adenomas ultimately progressing to invasive and metastatic carcinoma. This model is an attractive platform for studies of cancer biology and preclinical therapeutic trials.

Segmental Adeno-Cre Infection: A Technique to Generate Isolated Colorectal Cancer using Genetically Engineered Mouse Models

This video describes a method for editing specific genes in prostate gland cells using an adenovirus-based delivery system. The approach allows for orthotopic and localized alteration of gene expression utilizing CRISPR technology to develop novel mouse models for prostate cancer.

Modeling Prostate Cancer in Genetically-engineered Mouse Models: A CRISPR/Cas9-mediated Localized Gene Editing Technique in Mouse Anterior Prostate Lobe Cells

This video demonstrates the delivery of DNA plasmid into the urothelium of the mouse bladder using a combination of urethral catheterization and electroporation techniques. The described procedure allows the generation of mouse bladder cancer models.

Delivery of DNA Plasmids into Urothelium of Mouse Bladder: An Electroporation-based Procedure to Efficiently Deliver DNA Plasmids into Urothelial Cells of Murine Bladder to Generate Genetically Engineered Models

Implantatie van kankercellen in het orgaan van oorsprong kan dienen als een nuttige preklinisch model om nieuwe therapieën te evalueren. MB49 blaascarcinoom cellen kunnen worden gekweekt in de blaas na intravesicale instillatie. Dit protocol toont katheterisatie van de blaas muis behoeve van tumor implantatie en adenovirale levering.

Een orthotope Blaaskanker Model voor Gene Delivery Studies

Een protocol voor de oprichting van een genetisch gemanipuleerde muismodel van colorectale kanker door middel van segmentale adeno-cre infectie en zijn bewaking via hoge resolutie colonoscopie wordt gepresenteerd.

Een genetisch ontwikkeld muis model van sporadische colorectale kanker

Dit protocol beschrijft een nieuw opgerichte methode voor virus levering aan de lymfkliertest prostaat. Met behulp van technologie van de CRISPR/Cas9, gene overexpressie of Cre recombinase levering, de techniek kunt orthotopic wijziging van genexpressie en implementeert een roman muismodel voor prostaatkanker.

Virus levering van CRISPR gidsen voor de lymfkliertest prostaat voor Gene wijziging

Beschrijven we een nieuwe methode voor de levering van DNA plasmide in de cellen van de urothelial van muis blaas in vivo via de urinebuis catheterisatie en electroporation. Het biedt een snelle en gemakkelijke manier voor het genereren van autochtone Muismodellen van ziekten van de blaas.

Nieuwe methode van plasmide DNA levering aan muis blaas Urothelium door Electroporation

Er worden methoden beschreven voor het genereren van grote hoeveelheden recombinante adenovirussen, die vervolgens kunnen worden gebruikt om het inheemse knaagdier urotheel te transduceren, waardoor expressie van transgenen of downregulatie van endogene genproducten mogelijk is.

Expressie van transgenen in native blaasurotheel met behulp van adenovirus-gemedieerde transductie

Dit protocol beschrijft de generatie van een muisprostaat-organoïde-gebaseerd model dat in 2D is gekweekt. Het omvat organoïde dissociatie, celzaadvorming, differentiatie, beoordeling van de epitheelintegriteit en in-vitro infectie met uropathogene Escherichia coli. Het model biedt apicale toegankelijkheid en is geschikt voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties, waarmee het beperkingen van traditionele 3D-organoïde systemen overwint.

Generatie van een model gebaseerd op een muisprostaatorganoïde voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties

Leer een snelle methode voor ex vivo gendeletie in muizen urotheelcellen met adenovirus-Cre om blaaskanker organoïden te genereren. Deze aanpak versnelt onderzoek naar kankerbiologie aanzienlijk.

Ex Vivo Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen

Meer video's verkennen