Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

De belangstelling voor vloeibare elektronenmicroscopie is de afgelopen jaren omhooggeschoten, omdat we nu realtime processen op nanoschaal kunnen visualiseren. Verbeterde kennis over deze flexibele structuren kan ons helpen bij het ontwikkelen van nieuwe reagentia om opkomende pathogenen zoals SARS-CoV-2 te bestrijden. Het bekijken van eiwitten in een vloeibare omgeving helpt om biologische systemen na te bootsen en geeft ons de mogelijkheid om op een meer dynamische manier naar de eiwitten te kijken.

En dit experiment laat je nieuwe technieken zien over het gebruik en de visualisatie van eiwitten in zowel glasachtig ijs als vloeibare omgevingen. Recente resultaten omvatten dynamische inzichten van vaccinkandidaten in op antilichamen gebaseerde therapieën afgebeeld in vloeistof. Correlatieve vloeibare en cryo-EM-toepassingen bevorderen ons vermogen om moleculaire dynamica te visualiseren en bieden een unieke context voor menselijke gezondheid en ziekte.

Lezers die conventionele TEM- of cryo-EM-technologieën gebruiken, kunnen overwegen vloeibare EM-workflows te implementeren om nieuwe dynamische observaties van hun monsters te bieden op een manier die hun huidige strategieën aanvult. In de handel verkrijgbare liquid-EM-systemen kunnen flow, mixing, elektrochemische stimuli en temperatuurregeling bieden, die essentieel zijn voor veel realtime beeldvormingstoepassingen. De hier gepresenteerde microchip sandwichmethode beschrijft een eenvoudige manier om eerst monsters in vloeistof te bekijken voordat de sprong wordt gemaakt naar een complexer commercieel systeem voor in situ experimenten.

Reinig om te beginnen de siliciumnitride-microchips door elke chip gedurende twee minuten in 150 milliliter aceton te incuberen, gevolgd door incubatie in 150 milliliter methanol gedurende twee minuten. Laat chips drogen in een laminaire luchtstroom. Plasma reinigt de gedroogde chips met behulp van een gloeiontladingsinstrument dat gedurende 45 seconden onder standaardomstandigheden werkt met behulp van argongas.

Laad vervolgens een droge basismicrochip in de punt van de monsterhouder en voeg ongeveer 0,2 microliter van het monster toe aan de basischip. Na één tot twee minuten incuberen, plaatst u de bovenste chip op de natte basischip met het monster. Plant de assemblage samen om een hermetisch afgesloten behuizing te vormen die mechanisch op zijn plaats wordt gehouden door drie messing schroeven.

Pomp de punt tot 10 tot de min zes torr met behulp van een turbogepompt droog pompstation. De houder is nu klaar om in de TEM te worden gestoken. Plasma reinigt de microchips en koolstofroosters met behulp van een gloeiontladingsinstrument gedurende 45 seconden.

En voeg ongeveer twee microliter monster toe aan een gloeiende microchip die op een gelverpakking is geplaatst. Verwijder de overtollige oplossing met filterpapier of een pipet en incubeer gedurende één tot twee minuten. Voeg vervolgens het gloeiende koolstofrooster toe aan de natte microchip die het monster bevat.

Plant de assemblage samen met behulp van een enkele kantelbare monsterhouder bij kamertemperatuur om een hermetisch afgesloten behuizing te vormen. U kunt ook rasterclips voor automatisch laden gebruiken en de sandwichassemblage op de onderste C-clip plaatsen. Plaats de bovenste clip bovenop de montage en gebruik het standaard klemgereedschap om de montage samen te dichten.

Het exemplaar is nu klaar om in de TEM te worden geplaatst. Onderzoek monsters die in autoladers zijn geplaatst onder cryo-omstandigheden of bij kamertemperatuur. Voor liquid-EM-beeldvorming laadt u de monsterhouder in de TEM die is uitgerust met een veldemissiepistool en werkt u op 200 kilovolt.

Schakel het pistool in en pas de eucentrische hoogte van het microscoopstadium aan ten opzichte van het monster met behulp van de wobbler-functie, waarbij het monster wordt gekanteld van min 15 graden naar plus 15 graden in de kolom. Deze procedure past het podium in de Z-richting aan de monsterdikte aan en helpt een nauwkeurige vergroting tijdens het opnemen van het beeld te garanderen. Neem afbeeldingen op als lang ingelijste films of individuele afbeeldingen met behulp van het softwarepakket voor seriële gegevensverzameling, waarbij geautomatiseerde beeldroutines worden geïmplementeerd.

Verkrijg beelden onder omstandigheden met een lage dosis bij vergrotingen variërend van 28.000x tot 92.000x en 40 frames per seconde. Pas de belichtingstijden aan om stralingsschade aan het monster te minimaliseren en gebruik een onscherptebereik van min één tot vier micrometer bij de opgegeven vergroting. Als er een dikke oplossing wordt aangetroffen, gebruikt u hogere onscherptewaarden of selecteert u een ander interessegebied.

Zorg ervoor dat de oplossing aanwezig is in de monsters tijdens de beeldvormingssessie door de elektronenbundel te richten op een opofferingsgebied dat niet wordt gebruikt voor gegevensverzameling totdat bellen zijn gevormd. Analyseer films op SARS-CoV-2-deeltjes met behulp van het RELION-3.0.8-programma of andere beeldverwerkingssoftware. Voer bewegingscorrectie uit met behulp van het MotionCor2-programma.

Eenmaal gecorrigeerd, extraheer deeltjes met behulp van de auto-picking tool in het programma softwarepakket. Typische doosformaten zijn 330 pixels voor vloeibare exemplaren en 350 pixels voor ijsmonsters. Bereken de initiële reconstructies met behulp van C1-symmetrie met de 3D-initiële modelroutine van het programma en de ab initio-modelopties in het softwarepakket voor gegevensverwerking.

Voer vervolgens verfijningsprotocollen uit in de gegevensverwerkingssoftware. Onderzoek de resultaten met behulp van een softwarepakket voor moleculaire structuuranalyse terwijl u dynamische veranderingen beoordeelt. Een vergelijking van liquid-EM en cryo-EM structuren in adeno-geassocieerd virus subtype drie of AAV wordt hier getoond.

De representatieve beelden tonen de structuur van AAV in de oplossing en in ijs. De rotatieweergaven van de AAV VP1-subeenheid die uit de vloeistof- en ijsstructuren wordt geëxtraheerd, worden hier weergegeven. Deze afbeeldingen vertegenwoordigen de dynamische waarden in de vloeibare structuren die worden gegenereerd met behulp van de morph map-functie in de moleculaire structuuranalysesoftware.

De gemiddelde structuren van meerdere virusassemblages vertonen conformatieveranderingen met een diameterverandering van bijna 5%, gemeten met behulp van EM-gegevens. Een afbeelding van SARS-CoV-2 subvirale assemblages geïsoleerd uit serumfracties van COVID-19-patiënten wordt hier getoond. Deze witte bubbels duiden op de aanwezigheid van vloeistof in het monster.

Een EM-reconstructie van deze subvirale assemblages wordt hier getoond met gekleurde radiale dichtheden op vijf nanometer plakjes door de kaart. De representatieve afbeelding beschrijft de analyse van rotavirus dubbellaagse deeltjes bereid in glasachtig ijs met behulp van de microchip sandwich techniek. Het gebruik van detergentia, glycerol, polyethyleen, glycolen en hoge niveaus van suikers moet worden geminimaliseerd of vermeden voor liquid-EM-beeldvorming.

Deze reagentia kunnen artefacten introduceren, overmatig borrelen, hydrolyseproducten en vrije radicalen veroorzaken als gevolg van stralingsschade. Het gebruik van deze protocollen zal wetenschappers in staat stellen om dynamische processen tot in de kleinste details te bestuderen. En dit strekt zich uit over meerdere wetenschapsgebieden, waaronder geneeskunde, levenswetenschappen en materiaalonderzoek.

De hier gepresenteerde protocollen beschrijven hoe state-of-the-art tools een opwindend middel kunnen bieden om biologische macromoleculen door nieuwe ogen te visualiseren. Het veld van vloeibare elektronenmicroscopie kan de manier waarop we deze nieuwe virussen bestuderen die een bedreiging vormen voor de menselijke gezondheid, verheffen en misschien zelfs bijdragen aan onze pandemieparaatheidsmaatregelen.