Name: Isolatie van preadipocyten uit vleeskuikenembryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Leer preadipocyten isoleren uit vleeskuikenembryo's voor onderzoek naar vetweefselontwikkeling en metabolisme. Deze methode biedt een hoog opbrengst aan levensvatbare cellen met sterk differentiatievermogen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken UT AgResearch en de afdeling Dierwetenschappen voor het ondersteunen en optimaliseren van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door USDA-subsidie.

<ol><li>Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFryar%2C+CD+%22Prevalence+of+overweight%2C+obesity%2C+and+severe+obesity+among+children+and+adolescents+aged+2-19+years%3A+United+States%2C+1963-1965+through+2015-2016%22">Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016</a>. , (2018).</li>
<li>Siegel, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+modern+broiler+and+feed+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Animal+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Evolution of the modern broiler and feed efficiency.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).</li>
<li>Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth%2C+efficiency%2C+and+yield+of+commercial+broilers+from+1957%2C+1978%2C+and+2005%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005.</a> Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).</li>
<li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+models+for+differentiation%3A+preadipocytes+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li>
<li>Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+influence+on+stromal+vascular+fraction+cell+yield+obtained+from+human+lipoaspirates%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).</li>
<li>Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+changes+in+lipid+composition+and+lipoprotein+lipase+activity+during+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Lipids+and+Lipid+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).</li>
<li>Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+adipose+tissue+growth+through+hyperplasia+and+hypertrophy+in+the+embryonic+Leghorn+and+broiler%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler.</a> Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).</li>
<li>Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+size+and+docosahexaenoic+acid+content+of+adipocytes+during+chick+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development.</a> Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).</li>
<li>Claver, J. A., Quaglia, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+morphology%2C+development%2C+and+function+of+blood+cells+in+nonmammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Exotic+Pet+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).</li>
<li>Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg">https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg</a> (2022).</li>
<li>Nema, R., Khare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+cell+culture%3A+Advance+technology+for+modern+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Bioscience+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An animal cell culture: Advance technology for modern research.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).</li>
<li>Regassa, A., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oleic+acid+and+chicken+serum+on+the+expression+of+adipogenic+transcription+factors+and+adipogenic+differentiation+in+hen+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes.</a> Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).</li>
<li>Temkin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+crude+oil%2Fdispersant+mixture+and+dispersant+components+on+PPAR+%CE%B3+activity+in+vitro+and+in+vivo%3A+identification+of+dioctyl+sodium+sulfosuccinate+%28DOSS%3B+CAS%23+577-11-7%29+as+a+probable+obesogen%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen.</a> Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).</li>
<li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHausman%2C+DB+%22Adipose+Tissue+Protocols%22">Adipose Tissue Protocols</a>. , Springer. 201-219 (2008).</li>
<li>Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+protocol+to+maximize+differentiation+of+human+preadipocytes+and+improve+metabolic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes.</a> Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).</li>
<li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li>
<li>Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+adipocyte-derived+extracellular+vesicles+using+filtration+and+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).</li>
<li>Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Fungizone+in+control+of+fungi+and+yeasts+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).</li>
<li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+swimming+dots+in+cell+culture%3A+the+identity%2C+detection+method+and+judging+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria.</a> bioRxiv. , 366906(2018).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+animal+cells%3A+a+manual+of+basic+technique+and+specialized+applications%22">Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications</a>. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel verschillende goed beschreven protocollen de isolatie van preadipocyten 14,15,16,17 hebben gemeld, is isolatie voor embryonale preadipocyten geoptimaliseerd, wat kan worden gebruikt voor functionele analyses van de vroege groei en ontwikkeling van vetgroei en ontwikkeling bij vleeskuikens. Dit protocol levert embryonale adipocytenvoorlopers met een hoge levensvatbaarheid op met een hoog ...

Obesitas is een wereldwijde bedreiging voor de gezondheid van zowel volwassenen als kinderen. Kinderen met overgewicht of obesitas hebben ongeveer vijf keer meer kans om zwaarlijvig te zijn als volwassenen, waardoor ze een aanzienlijk verhoogd risico lopen op hart- en vaatziekten, diabetes en vele andere comorbiditeiten. Ongeveer 13,4% van de Amerikaanse kinderen van 2-5 jaar heeft obesitas1, wat illustreert dat de neiging om overtollig lichaamsvet te accumuleren al heel vroeg in het leven in gang kan worden gezet. Om heel verschillende redenen is de ophoping van overtollig vetweefsel een zorg voor vleeskuikens (vleesachtige) kippen. Moderne slachtkuikens zijn ongelooflijk efficiënt, maar accumuleren nog steeds meer lipiden dan fysiologisch noodzakelijk is 2,3. Deze neiging begint kort na het uitkomen en verspilt effectief voer, de duurste productiecomponent, door het weg te trekken van spiergroei. Daarom is het voor zowel kinderen als vleeskuikens, zij het om heel verschillende redenen, nodig om factoren te begrijpen die de ontwikkeling van vetweefsel beïnvloeden en manieren te vinden om vetexpansie vroeg in het leven te beperken.
Adipocyten vormen zich uit preadipocyten, van vetweefsel afgeleide stamcellen die differentiatie ondergaan om volwassen, lipide-opslaande vetcellen te ontwikkelen. Dienovereenkomstig zijn preadipocyten in vitro een waardevol experimenteel model voor obesitasstudies. Deze cellen, geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van vetdepots, kunnen een fundamenteel begrip bieden van moleculaire routes die de differentiatie van adipocyten en het metabolisme regelen 4,5. Kuikenembryo's zijn een gunstig experimenteel model in ontwikkelingsstudies omdat het kweken van eieren volgens het gewenste schema experimentele manipulatie gemakkelijker maakt, omdat het het verkrijgen van embryo's mogelijk maakt zonder het offer van de moeder om een reeks ontwikkelingsstadia van embryo's te observeren. Bovendien zijn gecompliceerde chirurgische procedures en lange perioden niet nodig om embryo's te verkrijgen ten opzichte van grotere diermodellen. Daarom biedt het kuikenembryo een kans om preadipocyten te verkrijgen uit de vroegste stadia van de ontwikkeling van vetweefsel. Onderhuids vetweefsel wordt zichtbaar in het kuiken rond embryonale dag 12 (E12) als een duidelijk gedefinieerd depot rond de dij. Dit depot is verrijkt met zeer proliferatieve preadipocyten die actief differentiatie ondergaan onder ontwikkelingssignalen om volwassen adipocyten te vormen 6,7. Het proces van adipogene differentiatie is vergelijkbaar tussen kippen en mensen. Daarom kunnen preadipocyten geïsoleerd uit kuikenembryo's worden gebruikt als een model met twee doelen voor studies die relevant zijn voor mens en pluimvee. De opbrengst van preadipocyten neemt echter af met veroudering naarmate cellen uitgroeien tot volwassen adipocyten5.
Het huidige protocol optimaliseert de isolatie van preadipocyten uit vetweefsel tijdens het stadium (E16-E18) waarin adipogene differentiatie en adipocytenhypertrofie op hun hoogtepunt zijn in vleeskuikenembryo's8. Deze procedure kan de effecten beoordelen van factoren waaraan het zich ontwikkelende embryo in ovo wordt blootgesteld, zoals het kippendieet, op de ontwikkeling van adipocyten en adipogene potentie ex vivo. Het kan ook de impact testen van verschillende manipulaties (bijv. Hypoxie, toevoegingen van voedingsstoffen, farmacologische agonisten en antagonisten) op adipogenese of de verschillende 'omes(bijv. Transcriptoom, metaboloom, methyloom) van adipocytenvoorlopers. Als een weergave van het vroegste stadium van vetvorming, zijn cellen verkregen met behulp van dit protocol waardevolle modellen voor studies die relevant zijn voor pluimvee en mensen.

<table><tbody><tr><td>1 mL Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>Z683825</td><td>Single Channel Pipette, 100 - 1000 &micro;L</td></tr><tr><td>1 mL Pipette Tip</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-402</td><td></td></tr><tr><td>100% Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426P4</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Flask</td><td>Pyrex</td><td>4980-25</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>F75P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>6-Well Plate</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>Tissue Culture-treated</td></tr><tr><td>96-Well Assay Plate</td><td>Costar</td><td>3632</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Plate, Black Bottom</td><td>Costar</td><td>3603</td><td>Tissue Culture-treated</td></tr><tr><td>AdipoRed</td><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Bench Top Wiper (Kimtechwiper)</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Up &amp; Up</td><td>NDC 1167300334</td><td>20% Working Solution</td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>Corning</td><td>6749</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer, 40 &micro;m</td><td>SPL</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugaton</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Chicken Serum</td><td>Gibco</td><td>16110082</td><td></td></tr><tr><td>Conical Centrifuge Tubes, 15 mL</td><td>VWR</td><td>10025-690</td><td></td></tr><tr><td>Conical Centrifuge Tubes, 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Nunc</td><td>343958</td><td></td></tr><tr><td>Curved Forceps, 100 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Curved Surgical Scissors, 115 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6839</td><td></td></tr><tr><td>Distilled Water</td><td>Millipore</td><td>SYNSV0000</td><td>Despensed as needed</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>70% Working Solution</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope</td><td>EVOS</td><td>M7000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>Foil</td><td>Reynolds</td><td></td><td>Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.</td></tr><tr><td>Freezing Container</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Millipore</td><td>4055</td><td>2% Working Solution</td></tr><tr><td>Hematocytometer (Counting Chamber)</td><td>Corning</td><td>480200</td><td>0.1 mm deep</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>6845</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Sterilizer</td><td>VWR</td><td>B1205</td><td></td></tr><tr><td>Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin</td><td>Sigma</td><td>L9655</td><td>1x Working Solution</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Evos</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Channel Pipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661070</td><td>12-Channel Pipetters, 30 - 300 &micro;L</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-7907</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>IKA</td><td>KS130BS1</td><td></td></tr><tr><td>Paper Towel</td><td>Tork</td><td>RK8002</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Steptomycin (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>1x Working Solution</td></tr><tr><td>Petri dishes, 100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes, 60 mm</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Plate Shaker</td><td>VWR</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer</td><td>Roche</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Reservior</td><td>VWR</td><td>89094-680</td><td></td></tr><tr><td>Small Beaker, 100 mL</td><td>Pyrex</td><td>1000-100</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gauze</td><td>McKesson</td><td>762703</td><td></td></tr><tr><td>Straight Forceps, 120 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-4960</td><td></td></tr><tr><td>Straight Scissors, 140 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6762</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Flask</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Tissue Culture-treated</td></tr><tr><td>Tissue Culture Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Strainer, 250 &micro;m</td><td>Pierce</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td>0.1% Working Solution</td></tr><tr><td>Tweezers, 110 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5035</td><td></td></tr><tr><td>Type 1 Collagenase</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 1 Filter Paper</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van preadipocyten uit vleeskuikenembryo's

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Primaire preadipocyten zijn een waardevol experimenteel systeem voor het begrijpen van de moleculaire routes die de differentiatie en het metabolisme van adipocyten regelen. Kippenembryo's bieden de mogelijkheid om preadipocyten te isoleren vanaf het vroegste stadium van de ontwikkeling van vetstoffen. Deze primaire cel kan worden gebruikt om factoren te identificeren die de proliferatie van preadipocyten en adipogene differentiatie beïnvloeden, waardoor ze een waardevol model zijn voor studies met betrekking tot obesitas bij kinderen en de controle van overtollige vetafzetting bij pluimvee. De snelle groei van postnatale vetweefsel verspilt effectief voer door het weg te trekken van spiergroei bij vleeskuikens. Daarom kunnen methoden om de vroegste stadia van de ontwikkeling van vetweefsel te begrijpen aanwijzingen geven om deze neiging te reguleren en manieren te identificeren om vetexpansie vroeg in het leven te beperken. De huidige studie was ontworpen om een efficiënte methode te ontwikkelen voor isolatie, primaire cultuur en adipogene differentiatie van preadipocyten geïsoleerd uit het ontwikkelen van vetweefsel van commerciële vleeskuiken (vleestype) kuikenembryo's. De procedure is geoptimaliseerd om cellen op te leveren met een hoge levensvatbaarheid (~ 98%) en een verhoogd vermogen om te differentiëren tot volwassen adipocyten. Deze eenvoudige methode van embryonale preadipocytenisolatie, -cultuur en -differentiatie ondersteunt functionele analyses van vetgroei en -ontwikkeling in het vroege leven.

Primaire preadipocyten zijn morfologisch vergelijkbaar met fibroblasten, met onregelmatige, sterachtige vormen en een centrale kern (figuur 2A-C). De cellen hechten zich gemakkelijk aan weefselkweekplastic en beginnen zich snel na aanhechting te vermenigvuldigen. Ze differentiëren en accumuleren snel lipidedruppels (figuur 3D) wanneer ze worden voorzien van vetzuren in de media. De levensvatbaarheid (98%, gebaseerd op kleurstofu...

Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het isoleren van preadipocyten uit vetweefsel in vleeskuikenembryo's. Deze methode maakt isolatie mogelijk met een hoge opbrengst, primaire cultuur en adipogene differentiatie van preadipocyten. Olie Rode O-kleuring en lipide/ DNA-kleuring maten het adipogene vermogen van geïsoleerde cellen geïnduceerd met differentiatiemedia.

Isolatie van preadipocyten uit vleeskuikenembryo's

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

Primaire preadipocyten zijn een waardevol experimenteel systeem voor het begrijpen van de moleculaire routes die het metabolisme van adipocyten regelen. Kippenembryo's bieden de mogelijkheid om preadipocyten te isoleren vanaf het vroegste stadium van de ontwikkeling van adipocyten. Deze methode is geoptimaliseerd om cellen op te leveren met een hoge levensvatbaarheid en een verhoogde capaciteit om te differentiëren tot volwassen adipocyt, die kan worden gebruikt voor functionele analyse van vetgroei en ontwikkelingsembryo in het vroege leven bij kuikens.Het proces van adipogene differentiatie is zeer vergelijkbaar tussen kippen en mensen. Daarom kunnen geïsoleerde preadipocyten worden gebruikt als een dubbel voorgesteld model voor studies die relevant zijn voor mens en pluimvee. Om te beginnen swab het embryolichaam met 70% ethanol.Vervolgens om interferentie tijdens filtratie bij latere stappen na de spijsvertering te voorkomen, schrobt u het huidoppervlak voorzichtig met steriel gaas om veren te verwijderen. Snijd vervolgens de huid tussen de benen en het abdominale gebied af om het paar femorale vetafzettingen te onthullen. Gebruik een gebogen tang met één hand om de huid rond het been te houden en verwijder voorzichtig het femorale onderhuidse vet.met de andere hand. Gebruik later een gebogen tang om het depot voorzichtig van het been weg te trekken. Breng de weefsels over in een buis van 15 milliliter met vijf milliliter verzamelmedia en herhaal de dissectie voor de andere kant van het vetkussen.Breng nu de verzamelde vetkussens over naar een petrischaaltje van 60 millimeter met sterilisatieoplossing en spoel kort af door het gerecht een paar keer te draaien. Spoel vervolgens de sterilisatieoplossing af door de vetkussens over te brengen naar een petrischaaltje van 60 millimeter met PBS. Draai het bord voorzichtig rond en was nogmaals met PBS.Breng ze voor de vertering van de vetweefsels over naar een buis van 15 millimeter met voorwarmende enzymatische oplossing. Dompel vervolgens een lange rechte schaar in de buis en gehakt ten slotte de vetweefsels in de oplossing in zo klein mogelijke stukjes. Breng het gehakte weefsel en de enzymatische oplossing over in een kolf van 25 milliliter met autoclaven.Wikkel de kolf in met paraffinefilm en plaats de kolf in een orbitale shaker incubator op 37 graden Celsius voor de spijsvertering. Pipetteer na de spijsvertering voorzichtig op en neer om goed te mengen. Verwijder vervolgens alle stukjes onverteerde weefsel en puin door door een 250 micrometer weefselzeef in een buis van 15 milliliter te filteren door te pipetteren.Verwijder nu de cellen die aan de kolf zijn gehecht door de kolf te spoelen met vier milliliter groeimedia en filter de celsuspensie in dezelfde buis van 15 milliliter. Spoel vervolgens de zeef door het groeimedium opnieuw te pipetteren om eventuele cellen die in het filter vastzitten te verwijderen. Centrifugeer op 300 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de celfractie te pelleteren en het supernatant aan te zuigen zonder de celpellet te verstoren.Resuspenseer de pellet voorzichtig in één milliliter rode bloedcellysisbuffer, meng goed door pipetteren en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verdun vervolgens de cellen door vijf milliliter groeimedia toe te voegen aan de buis die de cellen bevat en meng ze voorzichtig door pipetteren. Pipetteer de cellen nu op een celzeef van 40 micrometer en filter ze in een nieuwe buis van 50 milliliter.Spoel vervolgens de zeef af met nog eens vijf milliliter groeimedia en pelleteer de cellen door zeven minuten bij kamertemperatuur op 300 maal G te centrifugeren. Adem het supernatant voorzichtig op. Resuspendeer de resterende celpellet in één milliliter groeimedia door pipetteren Om de celdichtheid en levensvatbaarheid te bepalen, mengt u 10 microliter van elk monster in trypanblauw door pipetteren.Laad 10 microliter van het mengsel op de hemocytometer en tel de cellen. Analyse van preadipocyten na 24, 48 en 72 uur toonde normale celmorfologie en aantal. Adipogene inductie van preadipocyten vertoonde een snelle differentiatie en accumulatie van lipidedruppels.Agressieve behandeling van preadipocyten tijdens isolatie resulteerde in celbeschadiging en een laag celaantal. Microbiële besmetting kan worden waargenomen ondanks het nemen van preventieve maatregelen. Lipidekleuring met olierood O gaf aan dat de preadipocyten snel lipidedruppels beginnen te ontwikkelen onder adipogene inducering en de accumulatie vordert in de loop van de tijd zoals waargenomen in 24, 48 en 72 uur.De lipide accumulatie ten opzichte van het celgetal werd gekwantificeerd met behulp van lipide- en DNA-vlekken. Zowel de lipidenaccumulatie als de celproliferatie namen in de loop van de tijd toe. Een laag celaantal of beschadigde cellen kan worden waargenomen wanneer de weefselfracties te lang worden verteerd.Daarom wordt aanbevolen dat anderhalf uur spijsvertering niet wordt overschreden. Geïsoleerde preadipocyten kunnen worden gebruikt voor genexpressiestudies. Er kan voldoende RNA worden verkregen voor gebruik in cDNA-synthese en follow-on qPCR of RNAseq.

isolation-of-preadipocytes-from-broiler-chick-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit artikel geeft een methode voor het isoleren en kweken van kwartels of kippen...

Isolatie en Cultuur van Aviaire Embryonic Valvulaire Progenitor Cellen

This video demonstrates the isolation of tumor-bearing chorioallantoic membrane from the chicken embryo. The harvested CAM can be used for further downstream applications.

Chick Chorioallantoic Membrane Harvest: A Method to Isolate Tumor Graft-bearing Chorioallantoic Membrane from Chicken Egg

Celkweekmodellen gedetailleerde controle milieuomstandigheden en dus een krachtig platform om verschillende aspecten van neuronale cel biologie. We beschrijven een snelle, goedkope en betrouwbare wijze te isoleren, dissociëren en cultuur sensorische neuronen van kippenembryo's. Details van de ondergrond voorbereiding en immuuncytochemie zijn ook aanwezig.

Isolatie en Cultuur van Gedissocieerde sensorische neuronen van Chick Embryo

Hier beschrijven we een chromatine immunoprecipitation (ChIP) en ChIP-seq de protocol van de voorbereiding van de bibliotheek voor het genereren van wereldwijde epigenomic profielen van lage-overvloed kip embryonale monsters.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

Dit artikel bevat een methode voor het isoleren van pure embryonale weefsels van kwartel en kip embryo's die kunnen worden samengevoegd tot ex vivo chimeer organen.

Isolatie van embryonale weefsels en vorming van kwartel-kip chimeer organen met behulp van het voorbeeld van de Thymus

Dit rapport beschrijft een protocol voor de gelijktijdige isolatie van primaire bruine en witte preadipocyten van pasgeboren muizen. Geïsoleerde cellen kunnen in cultuur worden gekweekt en worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in volgroeide witte en bruine adipocyten. De methode maakt genetische, moleculaire en functionele karakterisering van primaire vetcellen in cultuur mogelijk.

Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen

Dit is een effectieve methode om te screenen op suppressors of drivers van kankermetastase. Cellen, getransduceerd met een expressiebibliotheek, worden geïnjecteerd in het kippen chorioallantoïsche membraan vasculatuur om gemetastaseerde kolonies te vormen. Kolonies met verminderde of verhoogde invasiviteit worden verwijderd, uitgebreid, opnieuw geïnjecteerd om hun fenotype te bevestigen en ten slotte geanalyseerd met behulp van sequencing met hoge doorvoer.

Ontdekking van gemetastaseerde regulatoren met behulp van een snel en kwantitatief intravital chick chorioallantoic membraanmodel

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Hier beschrijven we een protocol voor het scheiden van dooier-, granulosacellen en thecacellen in preovulatoire follikels van vogels. Deze precisiebehandeling maakt kritisch onderzoek mogelijk naar de rol van deze lagen in de voortplantingsfunctie, wat helpt bij het begrijpen van folliculaire ontwikkeling, hormonale regulatie en ziekteonderzoek voor verbeterde landbouwopbrengst en biomedische inzichten.

Scheiding van pre-ovulatoire follikelgranulosa- en thecacellagen voor stroomafwaartse toepassingen

Het bekijken en toegang krijgen tot het kippenembryo tijdens de ontwikkeling kan een uitdaging zijn. We hebben een ex ovo methode ontwikkeld die eenvoudig, kosteneffectief is en gemakkelijk kan worden gebruikt in een klaslokaal of onderzoeksomgeving. Deze methode biedt toegang tot het embryo tot in de late stadia van de embryonale ontwikkeling (HH 40).

Geoptimaliseerd Ex-ovo Het kweken van kippenembryo's tot geavanceerde stadia van ontwikkeling

Leer preadipocyten isoleren uit vleeskuikenembryo's voor onderzoek naar vetweefselontwikkeling en metabolisme. Deze methode biedt een hoog opbrengst aan levensvatbare cellen met sterk differentiatievermogen.

Isolatie van preadipocyten uit vleeskuikenembryo's

Meer video's verkennen