Zuivering en kwaliteitscontrole van recombinante septinecomplexen voor celvrije reconstitutie

Dit protocol maakt het mogelijk om hoogwaardige septinecomplexen te zuiveren, en dit is essentieel om de vele rollen van septines in de cel te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is de synthese van een eenvoudige procedure om hoogwaardige septine te zuiveren met behulp van Addgene-plasmiden. Septines zijn moeilijk te bestuderen in cellen vanwege hun vele interacties.

Zwavelreconstitutie helpt ons deze complexiteit te ontwarren door ze in een eenvoudig systeem te bestuderen. We raden aan om zuivering in één dag te doen om degradatie te voorkomen. Onze ervaring is dat dit de levensduur en de kwaliteit van het eiwit zal verhogen.

Om te beginnen, kweek de getransformeerde bacteriecultuur bij 37 graden Celsius in een shaker-incubator totdat de optische dichtheid bij een golflengte van 600 nanometer twee tot drie bereikt voor ongelabelde septines, of 0,6 tot 0,8 voor msfGFP of mEGFP-gelabelde septines. Induceer na incubatie de eiwitexpressie door IPTG toe te voegen aan een eindconcentratie van 0,5 millimol en incubeer de cellen die ongelabelde septine hetero-oligomeren tot expressie brengen bij 37 graden Celsius gedurende drie uur, of de cellen die msfGFP tot expressie brengen met het label hetero-oligomeren bij 17 graden Celsius 's nachts. Pelleteer vervolgens de cellen op 4.000 keer G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.

Gooi het supernatant weg en los de pellet op in 100 milliliter lysisbuffer om de cellen te lyseren. Gebruik vervolgens een tip sonicator met 30% amplitude om de cel te soniceren. Verduidelijk het cellysaat door gedurende 30 minuten op 20.000 maal G te centrifugeren bij vier graden Celsius en bewaar het supernatant.

Neem eventueel een monster voor het denatureren van elektroforese zoals beschreven in het manuscript. Voor affiniteitschromatografie van His-tagged septines, equilibrate een voorverpakte nikkel sepharose high performance chromatografie kolom met alle vereiste buffers. Laad het geklaarde supernatant tot in de kolom en start het chromatografiesysteem.

Eluteer vervolgens de septinecomplexen met 50%HisTrap-elutiebuffer met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Om een imidazolconcentratie van 250 millimol te verkrijgen, verzamelt u 0,5 milliliterfracties. Controleer nu de optische absorptie van het eluaat op 280 nanometer met een snel eiwitvloeistofchromatografiesysteem en kies de fracties die septinecomplexen bevatten.

Voor affiniteitschromatografie van Strep-II gelabelde eiwitten equilibrate een voorverpakte StrepTactin sepharose high performance chromatografie kolom met septine buffer. Laad het septine met fracties die uit de nikkelkolom zijn teruggewonnen met een snelheid van één milliliter per minuut en start het chromatografiesysteem. Was vervolgens het gebonden eiwit en eluuteer de septinecomplexen met 100% StrepTrap elutiebuffer met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut.

Om een concentratie van 2,5 millimol desthiobiotine te verkrijgen, verzamelt u 0,5 milliliterfracties. Kies de fracties die septinecomplexen bevatten zoals aangegeven door de optische absorptie van het eluaat op 280 nanometer die online wordt bewaakt met een snel eiwitvloeistofchromatografiesysteem. Na het verwijderen van de desthiobiotine door dialyse aliquot de eiwitcomplexen in de gewenste aliquot grootte, snap vries de aliquot in en bewaar het bij min 80 graden Celsius.

Voor interferometrische verstrooiingsmicroscopie, was glasglijbanen nummer 1.5 door ze gedurende vijf minuten in een ultrasone reiniger te soniceren, elk in water, isopropanol en opnieuw in gedeïoniseerd water. Droog twee glazen glijbanen met een zachte stroom stikstofgas. Plaats vervolgens een druppel van zeven microliter van 0,01% Poly-L-Lysine-oplossing op het midden van een van de dia's en plaats het midden van de andere dia bovenop de Poly-L-Lysine-druppel, waarbij de twee dia's orthogonaal worden georiënteerd voor een gemakkelijke scheiding.

Na 30 seconden broeden, wast u de glijbaan door eenmaal onder te dompelen in een bekerglas met gedeïoniseerd water en twee keer direct een stroom water aan te brengen. Droog ze met een stikstofgasstroom en deze dia's kunnen bij kamertemperatuur in droge omstandigheden ongeveer zes weken worden bewaard. Snijd voorafgaand aan het experiment een stuk van twee bij twee, drie bij twee of drie bij drie pakkingen en plak ze op het met Poly-L-Lysine behandelde deel van een glazen glijbaan, waarbij de glazen glijbaan en de pakkingen die in contact komen met een vuil oppervlak worden vermeden door de schuif op een licht ruitenwisserweefsel te plaatsen.

Druk nu met een pipetpunt op de pakkingen om ze te plakken met het beschermende plastic dat op de pakkingen aanwezig is. Verwarm vervolgens de septinebuffer tot kamertemperatuur. Ontdooi de eiwitten in de hand en bewaar ze daarna op ijs.

Plaats vervolgens de dia met pakkingen op het commerciële massafotometriesysteem met 19 microliter septinebuffer en stel de microscoop scherp met behulp van de autofocusoptie. Stel opnieuw scherp met de nieuwe instellingen, met behulp van de autofocusoptie. Als u een projectmap wilt maken, klikt u op Bestand gevolgd door Nieuw project en als u een projectmap wilt laden voor het opslaan van gegevens, klikt u op Bestand gevolgd door Project laden.

Pipetteer vervolgens een microliter monster naar 19 microliter septumbufferdruppel. Meng en raak tijdens het mengen niets aan om de beweging van de dia te voorkomen. Neem vervolgens een video van 6.000 frames op door op Record te klikken.

Analyseer de video's met behulp van de software van de fabrikant om de eiwitmassaverdeling te verkrijgen. Als de pieken van verschillende septine hetero-oligomeergroottes elkaar te veel overlappen of te veel gebeurtenissen worden gedetecteerd, verlaag dan de uiteindelijke septineconcentratie en meet opnieuw. En wanneer er niet genoeg tellingen van afzonderlijke moleculen worden gemeten, verhoog dan de septineconcentratie en meet opnieuw.

Bereid voor septineanalyse de 5X darkSPB en een septinemix bestaande uit 100% donker septine in zes keer hogere concentratie dan de gewenste eindconcentratie in septinebuffer en één millimolaire Dithiothreitol. Polymeriseer vervolgens het septine door water, 20% 5X darkSPB en 16,67% septinemix te mengen, in deze specifieke volgorde, en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg drie tot vijf microliter monster toe aan een gloeiend elektronenmicroscopieraster en incubeer gedurende één minuut.

Was het rooster nu twee keer door een druppel darkSPB-buffer toe te voegen en absorbeer de vloeistof met een filterpapier. Was eenmaal met water en incubeer gedurende 30 seconden met 2% uranylacetaat. Dep vervolgens de vlek en droog het monster een paar minuten aan de lucht.

Beeld vervolgens de septinebundels in op 120 kilovolt en vergrotingen tussen 5.000X en 60.000X met een onscherpte van één tot twee micrometer. Het HisTrap- en StrepTrap-chromatogram toonde aan dat de gepoolde fractie vanaf het begin van de elutiepiek ging totdat de absorptie stabiliseerde op respectievelijk ongeveer 250 milliliter en 50 milliliter. De septinebanden vertoonden vergelijkbare intensiteiten in het denatureren van gel-elektroforese, wat suggereert dat de septines intact zijn.

Bij inheemse elektroforese werden de hoofdband waargenomen die overeenkomt met de intacte hetero-oligomeren en een kleine band die overeenkomt met trimoren of tetrameren. Het schijnbare molecuulgewicht van de msfGFP-gelabelde complexen is niet te onderscheiden van dat van de niet-gecodeerde complexen. Massafotometrie detecteerde intacte octameren en hexameren van septines.

Een extra piek bij 241 kilodalton wees op de aanwezigheid van twee pinda-eiwitten, DSep1 en mEGFP-DSep2. Transmissie-elektronenmicroscopiebeelden van septinecomplexen toonden staafjes van hexameren en octameren. De msfGFP-tags zijn zichtbaar als vage dichtheden aan de twee uiteinden in septine 2 msfGFP human septin octamers_9i1.

Kleine clusters van eiwitten kunnen worden waargenomen in het ondiepe TIRF-veld. De confocale microscopie onthulde grote clusters van zwevende filamenteuze structuren. Transmissie-elektronenmicroscopie toonde kleine en grote septinebundels die overeenkomen met de clusters waargenomen door totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie en confocale microscopie.

We raden aan om tijdens de zuiveringen te allen tijde op ijs te werken en verse reagentia toe te voegen die we in het protocol specificeren. We zijn geïnteresseerd in interacties van septines in de context van cytokinese. We reconstitueerden septine samen met moderne membranen actine en microtubuli om ze te bestuderen met microscopie en verschillende biofysische testen.

We gebruiken de gezuiverde septines om te bestuderen hoe septines interageren met actinefilamenten, microtubuli en lipiden. En we gebruiken de gezuiverde septines ook om synthetische cellen te bouwen waar de septines de celdeling vergemakkelijken.