Snelle visco-elastische karakterisering van luchtwegslijm met behulp van een benchtop-reometer

Muco-obstructieve ziekten worden gekenmerkt door abnormale viscositeit van het luchtwegslijm. Het protocol laat zien hoe reologie kan worden gebruikt om de viscositeit van slijm te kwantificeren en gegevens te analyseren om slijmgerichte behandelingen te testen. Slijmreologie biedt specifieke kwantitatieve biomarkers.

Het gebruik van een benchtop-apparaat vereenvoudigt de logistiek van het meten van deze biomarkers in klinische monsters zoals menselijke sputummonsters aanzienlijk. Het gebruik van slijmreologie als diagnosemiddel voor obstructieve ziekten is nog steeds een uitdaging. Een toenemende hoeveelheid bewijs toont een sterke correlatie tussen reologie-eigenschappen, ontsteking en bacteriële infectie.

Slijm is altijd aanwezig op het lichaamsvlak waar het smeert en een beschermende rol speelt. Slijmreologie kan worden toegepast op andere systemen zoals de gastro-intestinale en genitale sporen. Om nauwkeurige metingen te verkrijgen, is een correcte behandeling en plaatsing van het monster van cruciaal belang.

Een visuele demonstratie kan de precisie van deze test verbeteren. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Kendall Shaffer, een onderzoekstechnicus van het luchtlaboratorium. Begin met het sorteren van het verzamelde luchtwegsputum of slijm in steriele monsterbekers.

In het geval van sputum, verwijder overtollig speeksel onmiddellijk na het verzamelen uit het monster. Plaats de monsters op ijs voor transport. Beperk de transporttijd tot minder dan vier uur.

Analyseer de monsters op het moment van verzamelen. Homogeniseer het slijm door drie tot vijf keer voorzichtig op en neer te pipetten met een verdringerpipet. Of pipetteer rechtstreeks in de microcentrifugebuizen.

Bewaar de monsters bij 80 graden Celsius tot ze verwerkt zijn. Vul de monsters voor opslag toe in volumes groter dan of gelijk aan 500 microliter om voldoende volume voor experimenten te garanderen. Pipetteer voor het aliquoteren verse en bevroren sputum of slijm direct of homogeniseer monsters.

Repareer de benodigde aliquots voor herhaalde metingen en behandelingen. Incubeer de aliquots die moeten worden getest bij 37 graden Celsius gedurende ten minste vijf minuten voorafgaand aan de meting. Gebruik voor het testen van farmacologische middelen hoge concentraties stamoplossingen om verdunning van het monster te voorkomen.

Voeg tussen 1% en 10% volume van het gewenste reagens rechtstreeks toe aan het monster. Zorg ervoor dat er geen druppel van de verbinding aan de zijkant van de buis blijft. Incubeer de monsters bij 37 graden Celsius gedurende de vereiste tijdsduur, om een chemische reactie mogelijk te maken.

Meng het slijmmonster en het reagens door elke twee minuten over de bodem van de microcentrifugebuis te vegen om progressieve penetratie van het reagens in het slijmmonster mogelijk te maken zonder het mucinenetwerk in gevaar te brengen. Wanneer u meerdere geneesmiddelreagentia vergelijkt, moet u ervoor zorgen dat de incubatietijd vergelijkbaar is. Schakel het apparaat in en initialiseer de software.

Selecteer een nieuwe meting. Voer het monsteridentificatienummer in onder Maatregel-ID en de naam van de exploitant onder Operator om door te gaan. Voer aanvullende informatie of opmerkingen in onder Opmerkingen.

Selecteer een geometrieset en inspecteer grote en kleine platen zorgvuldig, om ervoor te zorgen dat platen schoon en in perfecte staat zijn. Plaats de grote plaat stevig op de onderste preekstoel. Plaats de kleine plaat voorzichtig op de bovenste preekstoel en vergrendel de plaat door licht te draaien totdat u een klik hoort, wat aangeeft dat de plaat goed is geklemd.

Merk op dat vrije oscillatie van de bovenste plaat normaal is. Wacht tot de temperatuur de streefwaarde van 37 graden Celsius bereikt. Start vervolgens de automatische kalibratie, zoals gevraagd door de software.

Pipetteer met behulp van een positieve verplaatsingspioneer langzaam tussen 250 en 500 microliter van het monster op het midden van de grote bodemplaat. Eenmaal op de plaat gedeponeerd, zullen viskeuze monsters een koepelvorm aannemen, terwijl zeer elastische monsters fysieke scheiding kunnen vereisen. Laat de meetkop met de kleine plaat via de software zakken en observeer het monster.

Indien correct geladen op de bodemplaat zal het monster contact maken en gecentreerd zijn tussen de twee platen. Om ervoor te zorgen dat het monster de opening vult, gebruikt u de functie voor verminderde opening totdat het monster niet langer in de biconcave-vorm is of is uitgelijnd met de rand van de plaat. De gereduceerde spleetfunctie verlaagt de meetrand in stappen van 0,1 millimeter en is beperkt tot 7 stappen.

Als er na de stappen van 7 stappen een tussenruimte blijft bestaan, klikt u op Installatie opnieuw uitvoeren om terug te keren naar de oorspronkelijke positie en de positie en het volume van het monster aan te passen. Als de opening buitengewoon is verkleind, verwijdert u het overtollige monster met een spatel door een cirkelvormige beweging langs de rand van de bovenste plaat. Snijd het overtollige monster voorzichtig af om schuifspanning te voorkomen.

Laat de beschermkap zakken om te voorkomen dat verontreinigde vloeistoffen per ongeluk worden geprojecteerd tijdens oscillatie. Om de meting te starten, klikt u op Analyse starten. Een hele cyclus duurt vier tot zeven minuten.

Vermijd luid praten en het apparaat of de bank aanraken gedurende de gehele duur van de cyclus. Een rustige omgeving is cruciaal voor de eerste twee minuten. Zodra de cyclus is voltooid, klikt u op Volgende om de meetkop te verhogen en het monsteranalyserapport te genereren.

Zodra de meetkop volledig is ingetrokken, tilt u de beschermkap op. Gooi het monster weg en verwijder voorzichtig de platen. Reinig en desinfecteer de platen met warm water en zeep.

De visco-elastische eigenschappen van acht megadalton PEO werden gemeten bij vijf concentraties en direct vergeleken tussen de geëvalueerde benchtop rheometer en een traditionele bulkreometer. In tegenstelling tot PEO-oplossingen vertegenwoordigt status asthmaticus-slijm een solide-achtig elastisch gedomineerd gedrag bij lage spanning en heeft het een crossover bij hoge spanning. Bovendien bevestigden drievoudige metingen uitgevoerd in 1,5% PEO-oplossing en klinisch testslijmmonster dat lineaire visco-elastische kenmerken zeer herhaalbaar waren voor de waarden verkregen uit het biologische monster.

Veranderingen werden gemeten in de visco-elastische eigenschappen van slijm na behandeling met een slijmmiddel. TCEP-effecten op de visco-elasticiteit van assay slijm werden getest in een klinische setting met behulp van de benchtop rheometer. Mucolytische behandeling resulteerde in een meer vloeistofachtig monster met een afname van de complexe modulus met een 4,6-voudige, elastische modulus met een 5,1-voudige, viskeuze modulus met een 1,9-voudige, crossover-spanning met een 3,3-voudige en crossover-opbrengstspanning met een 5,7-voudige en een toename van de dempingsverhouding met 2,8-voudige.

Het meten van de visco-elasticiteit van luchtwegslijm in een snelle klinische setting kan helpen de behandeling van patiënten van geval tot geval aan te passen, evenals een gestandaardiseerd protocol bieden voor het testen van nieuwe farmacologische verbindingen. Deze techniek wordt momenteel gebruikt om de effecten van zeer effectieve CFTR-modulatoren op cystic fibrosis sputum te onderzoeken en om de potentie van verschillende geneesmiddelen gericht op het veranderen van slijmeigenschappen te testen.