Name: Chemische trifosforylering van oligonucleotiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Leer een chemische methode voor 5'-trifosforylering van oligonucleotiden met salicylfosforochloridiet en pyrofosfaat. Dit protocol maakt synthese van trifosforyleerde oligonucleotiden mogelijk voor biotechnologie en synthetische biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski en Katrina Tjhung dankbaar voor nuttige discussies over best practices voor chemische trifosforyleringsreacties en Gerald Joyce voor nuttige opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door subsidie MCB 2114588 van de National Science Foundation.

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De hier beschreven trifosforyleringsprocedure is in grote lijnen compatibel met oligonucleotidesynthese met behulp van standaard fosforamidietchemie. Nucleosidefosforamidieten moeten baselabiele beschermende groepen hebben die compatibel zijn met snelle deprotectie in AMA39, waaronder de standaard β-cyanoethyl op het fosfiet, en isobutyryl, dimethylformamidyl, acetyl, fenoxyacetyl of 4-isopropylfenoxyacetylgroepen op de exocyclische amines van de nucleobasen. Ribose 2'-hydroxylgroepen moeten worden beschermd door silylbeschermende groepen, hetzij t-butyldimethylsilyl (TBDMS) of tri-iso-propylsilyloxymethyl (TOM)40,41. Van de base-labile pivaloyloxymethyl (PivOM) groep is ook gemeld dat het compatibel is met chemische trifosforylering30.
Er zijn meerdere methoden beschreven voor de chemische trifosforylering van synthetische oligonucleotiden 28,29,30,31,32,33,34,35. We hebben ontdekt dat trifosforylering met behulp van het Ludwig-Eckstein-reagens37 een van de meest toegankelijke is, waarvoor geen gespecialiseerde synthese van reagentia en geen gespecialiseerde apparatuur nodig is. Oligonucleotide-5′-trifosfaten bereid volgens deze methode zijn routinematig gebruikt als substraten voor RNA-ligase ribozymen, inclusief het gebruik van enzymatisch ontoegankelijke L-RNA oligonucleotide trifosfaten om sjabloonafhankelijke synthese en replicatie van dit "spiegelbeeld" nucleïnezuur te bereiken 14,16,17,18 . De methode is ook geschikt voor de bereiding van kleine 5′-trifosforyleerde stamlus-RNA's die krachtige activatoren zijn van de aangeboren immuunrespons bij gewervelde dieren 6,7.
Het Ludwig-Eckstein-reagens, salicylfosforchloorthiaat37, is zeer reactief op water en ruimt effectief al het water op dat wordt ingebracht bij het oplossen van het reagens voordat het op de oligonucleotidekolom wordt geladen. Na dit punt zal het 5′-fosfaat-oligonucleotide echter bij voorkeur reageren met water dat in het systeem wordt ingebracht boven pyrofosfaat, waardoor een 5′-H-fosfonaatbijproduct wordt gevormd na work-up 28,37,38. Zorgvuldige bereiding van trifosforyleringsreagentia en de trifosforyleringsreactiekamer zorgen ervoor dat dit bijproduct niet wordt gevormd. Voor het drogen van oplosmiddelen worden moleculaire zeven van type 4 Å voorverpakt verkocht in teflonzakken die compatibel zijn met de meeste organische oplosmiddelen onder verschillende merknamen door de meeste oligonucleotidesynthesereagens. Aanvullende voorzorgsmaatregelen, zoals het uitvoeren van trifosforylering in een handschoenenkastje onder een watervrije atmosfeer, zijn over het algemeen niet nodig.
Reactie van het 5′-phosphitylated oligonucleotide met TBAP vormt een cyclisch 5′-trimetafosfiet intermediair, dat vervolgens wordt geoxideerd tot het cyclische 5′-trimetafosfaat met behulp van oligonucleotidesynthese-oxidatoroplossing (jodium in water/pyridine/THF). Opgemerkt moet worden dat commerciële oxidatieoplossingen verschillende hoeveelheden jodium gebruiken en het is essentieel om de hoge jodiumconcentratie van 0,1 M te gebruiken om volledige oxidatie naar het trifosfaat te garanderen. Het cyclische product wordt gehydrolyseerd tot het uiteindelijke lineaire 5′-trifosfaat in dezelfde oplossing37, en alternatieve, watervrije oxidatieoplossingen moeten worden gebruikt als linearisatie met andere nucleofielen dan water gewenst is (zie hieronder voor toepassingen)33. Eventuele resterende cyclische trimetafosfaat zal echter worden gelineariseerd tijdens de daaropvolgende alkalische deprotectie van het oligonucleotide. Hydrolyse van het cyclische 5′-trimetafosfaat levert alleen het lineaire, in plaats van vertakte trifosfaat37,46 op.
Oligonucleotide-deprotectie hoeft meestal niet te worden gewijzigd om 5′-trifosforylering mogelijk te maken, maar er moeten een paar voorzorgsmaatregelen worden genomen. Het trifosfaat is relatief stabiel tot korte blootstelling aan alkalische omstandigheden, maar er moet voor worden gezorgd dat het trifosfaat niet langer dan nodig aan AMA wordt blootgesteld. Beschermingsgroepen die een langere behandeling in ammoniak of AMA gedurende meer dan 10 minuten bij 65 °C vereisen, moeten worden vermeden. Zachtere behandelingen, zoals 2 uur ammoniak bij kamertemperatuur, zijn acceptabel wanneer ze compatibel zijn met andere fosforamidietbeschermende groepen. Een veel voorkomende, snelle deprotectiemethode voor silyl-beschermde synthetische RNA-oligonucleotiden maakt gebruik van triethylaminetrihydrofluoride en hoge temperatuur47; dit moet echter worden vermeden bij de bereiding van RNA-5′-trifosfaten, aangezien de langdurige zure omstandigheden de trifosfaathydrolyse blijken te versnellen31,32.
Preparatieve PAGE is de eenvoudigste en meest betrouwbare methode gebleken voor postdeprotectiezuivering van 5′-trifosforyleerde oligonucleotiden (figuur 3 en figuur 4). Preparatieve reverse-phase HPLC kan echter ook worden gebruikt om trifosforyleerde producten te zuiveren. De aanwezigheid van 5′-difosfaat en, in mindere mate, 5′-monofosfaatproducten wordt routinematig waargenomen bij het verifiëren van trifosforylering door massaspectrometrie. We hebben 5′-trifosfaatfragmentatie waargenomen tijdens massaspectrometrie van zeer zuiver materiaal bereid door chemische synthese of transcriptie, vooral als het instrument niet is geoptimaliseerd voor analyse van oligonucleotiden. Niettemin toont RP-LC-analyse vaak aan dat 10% -20% van het 5′-difosfaatbijproduct aanwezig is in langere 5′-trifosforyleerde oligonucleotiden (figuur 4). Commerciële preparaten van tributylammoniumpyrofosfaat kunnen worden verontreinigd met maar liefst 20% monofosfaat, dat 5′-difosfaat als bijproduct oplevert tijdens trifosforylering30,31. Een zorgvuldige voorbereiding van dit reagens in eigen huis kan veel meer zuivere TBAP-voorraden opleveren31. We hebben echter aangetoond dat oligonucleotiden trifosforyllated met behulp van commerciële bronnen van TBAP nog steeds een vergelijkbare of grotere reactiviteit vertonen wanneer ze worden gebruikt als substraten in enzymatische reacties (figuur 5B), vergeleken met materiaal bereid door in vitro transcriptie.
Een opmerkelijk verder gebruik van oligonucleotide trifosforylering met het Ludwig-Eckstein-reagens maakt gebruik van het cyclische trimetafosfiet-intermediair33. Als de daaropvolgende oxidatiestap wordt uitgevoerd met 1 M t-butylperoxide in hexanen, dat vaak wordt gebruikt voor oligonucleotide-oxidatie onder watervrije omstandigheden, treedt oxidatie van het fosfiet op zonder ringopeningshydrolyse, waardoor het cyclische trimetafosfaat ontstaat. Dit tussenproduct kan vervolgens worden gereageerd met primaire amine- of alcoholnucleofielen om 5′-trifosfaten te produceren met modificaties aan de γ-fosfaat. Deze modificaties omvatten de toevoeging van een lipofiele tag gekoppeld door een fosforamidaatbinding, die snelle trifosfaatspecifieke zuivering door RP-LC mogelijk maakt, gevolgd door zure hydrolyse van de tag uit het trifosfaat33. Fluorescerende modificaties op de γ-fosfaatpositie kunnen ook worden geïntroduceerd voor gebruik als real-time fluorescerende melders voor ribozym-gekatalyseerde ligatiereacties15,33.

De 5′-trifosforyleerde vorm van RNA is alomtegenwoordig in de biologie omdat het wordt gegenereerd door RNA-transcriptie in alle domeinen van het leven en door RNA-replicatie tijdens de levenscyclus van veel RNA-virussen. Deze trifosfaten dienen als substraat voor de vorming van 7-methylguanylaat-capped mRNA in eukaryoten en spelen daarom een essentiële rol bij eiwitexpressie1. Het trifosfaat daarentegen wordt vastgehouden in bacteriën en virussen; RNA-5′-trifosfaten worden dus herkend door aangeboren immuniteitsresponsregulatoren in eukaryoten 2,3,4,5,6,7. Buiten de biologie is een groot aantal RNA-ligase ribozymen geëvolueerd om het 5′-trifosfaat in vitro8 te gebruiken en aangepast voor gebruik in diagnostische testen 9,10,11,12,13,14,15. Een dergelijk ribozym kan worden gebruikt voor sjabloonafhankelijke synthese van L-RNA, het niet-biologische "spiegelbeeld" enantiomeer van natuurlijk D-RNA, uit kleine L-RNA oligonucleotide 5′-trifosfaten 16,17,18. De routinematige bereiding van trifosforyleerde oligonucleotiden met een variërende sequentie en ruggengraatsamenstelling is essentieel voor het onderzoeken van deze systemen.
De meest gebruikelijke en toegankelijke methode voor het bereiden van RNA-5′-trifosfaten in het laboratorium is door in vitro transcriptie. RNA dat door deze methode wordt geproduceerd, wordt echter beperkt in sequentie en grootte door promotor- en substraatvereisten van het RNA-polymerase-enzym. T7 RNA-polymerase en gespecialiseerde derivaten zijn de meest voorkomende polymerasen die voor dit doel worden gebruikt 19,20,21,22. In vitro getranscribeerd RNA bereid met deze enzymen moet worden geïnitieerd met een 5′-terminale purine en is sterk bevooroordeeld ten opzichte van purines in de eerste 10 nucleotiden23,24. Bovendien is enzymatische integratie van base- of backbone-gemodificeerde nucleotiden op zijn best inefficiënt en vaker onmogelijk met natuurlijke polymerasen, waardoor de mogelijkheid om oligonucleotide 5′-trifosfaten te produceren die zijn samengesteld uit alles behalve natuurlijk D-RNA, wordt beperkt. Een andere beperkende factor is dat RNA gegenereerd door in vitro transcriptie aanzienlijke 5′- en 3′-heterogeniteit kan bevatten en wordt geproduceerd als extreem heterogene producten wanneer het korter is dan 20 nt 23,24,25,26,27.
Daarentegen kan chemische trifosforylering van oligonucleotiden bereid door vaste-fase fosforamidietsynthese 28,29,30,31,32,33,34,35 worden gebruikt om oligonucleotide 5′-trifosfaten van 3-50 nt lang te bereiden, van elke sequentie. Bovendien kan een breed scala aan nucleïnezuurmodificaties die toegankelijk zijn voor fosforamidietsynthese worden toegevoegd aan oligonucleotiden voorafgaand aan 5′-trifosforylering 14,15,16,17,18,29,36. Veel van deze methoden maken gebruik van het fosfaateringsreagens salicylfosforchloorniet, dat door Ludwig en Eckstein is ontwikkeld voor de oplossingsfasetrifosforylering van mononucleosiden37. Trifosforylering van oligonucleotiden met dit reagens wordt bereikt in de vaste fase door fosfaatering van het oligonucleotide 5′-hydroxyl, omzetting in het trifosfaat door reactie met pyrofosfaat en oxidatie, gevolgd door standaardprocedures voor splitsing van het oligonucleotide van de vaste ondersteuning, deprotectie en zuivering (figuur 1)28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig01v2.jpg"> Figuur 1: Schema voor trifosforylering van synthetische oligonucleotiden. In de eerste stap wordt het oligonucleotide 5ʹ-hydroxyl gefosforiseerd met SalPCl. In de volgende stap wordt het 5ʹ-salicylfosfiet gereageerd met TBAP om het cyclische metafosfiet te vormen en vervolgens in de derde stap geoxideerd om het cyclische 5ʹ-trimetafosfaat te genereren in DNA / RNA synthesizer oxidatieoplossing (0,1 M jodium / pyridine / H2O / THF), die snel wordt gehydrolyseerd om het lineaire 5ʹ-trifosfaat in dezelfde oplossing28,33 te verkrijgen, 37. Daaropvolgende alkalische splitsing van de vaste CPG-ondersteuning en deprotectie van het oligonucleotide in waterige MeNH2/ammoniak zal elk resterend cyclisch trimetafosfaat hydrolyseren naar de lineaire vorm. Afkortingen: SalPCl = salicylfosforchloorthiniet; TBAP = tributylammoniumpyrofosfaat; THF = tetrahydrofuraan; CPG = gecontroleerd poriënglas; MeNH2 = methylamine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Hoewel vroege gepubliceerde rapporten met deze methode vaak leden aan slechte opbrengsten en ongewenste nevenproducten 28,37,38, is zorgvuldig onderhoud van watervrije omstandigheden alles wat nodig is voor het routinematig verkrijgen van hoge opbrengsten. Dit kan worden bereikt door een zorgvuldige voorbereiding van reagentia en het gebruik van een eenvoudig reactieapparaat dat is samengesteld uit standaard plastic componenten. Hier demonstreren we de juiste stappen voor chemische trifosforylering van oligonucleotiden, waaronder de bereiding van reagentia, assemblage van de reactiekamer, de trifosforyleringsreactie en daaropvolgende deprotectie en zuivering van de trifosforyleerde oligonucleotiden. Ook inbegrepen is het representatieve gebruik van 5′-trifosforyleerde oligonucleotiden als substraten voor ligase ribozymen voor de synthese van grotere nucleïnezuurproducten met natuurlijke D-RNA en abiotische L-RNA-backbones.

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m polyethersulfone syringe filter</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP025SS</td><td>Syringe filter voor het verwijderen van vermalen polyacrylamidegeldeeltjes (Sectie 5)</td></tr><tr><td>0.22 &micro;m PTFE syringe filter</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLLG013SL</td><td>Syringe filter voor het verwijderen van CPG-hars (Sectie 5)</td></tr><tr><td>1 mL plastic syringes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-434 (BD 309659)</td><td>Componenten van trifosforyleringsapparaat (secties 2&ndash;4)</td></tr><tr><td>1,4-Dioxaan, watervrij</td><td>MilliporeSigma</td><td>296309</td><td>Trifosforyleringsoplosmiddel (secties 2&ndash;4)</td></tr><tr><td>2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on, Salicylfosforochloridite (SalPCl)</td><td>MilliporeSigma</td><td>324124</td><td>Trifosforyleringsreagens (secties 2&ndash;4)</td></tr><tr><td>30 mL glazen flessen</td><td>MilliporeSigma</td><td>23232</td><td>Flessen voor het bereiden van trifosforyleringsoplosmiddelen en TBAP-oplossing (sectie 2)</td></tr><tr><td>3-weg stopcock, polycarbonaat/polypropyleen</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7328103</td><td>Component van trifosforyleringsapparaat (secties 2&ndash;4)</td></tr><tr><td>40% acrylamide/bis-acrylamide-oplossing, 19:1</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>Voor PAGE (secties 5&ndash;7)</td></tr><tr><td>Acetonitril, watervrij, 100 mL</td><td>Glen Research</td><td>40-4050-50</td><td>Trifosforyleringsoplosmiddel (secties 2&ndash;4)</td></tr><tr><td>Ammoniak-neutraliserende val</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ANT100 en ANS121</td><td>Voor gebruik met Speedvac DNA130 (sectie 5)</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat (APS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610700</td><td>Voor PAGE, katalysator voor acrylamidepolymerisatie (secties 5&ndash;7)</td></tr><tr><td>Aqueuze ammoniak, 28%</td><td>MilliporeSigma</td><td>338818</td><td>Voor het bereiden van AMA deprotectiereagens (sectie 5)</td></tr><tr><td>Aqueuze methylamine, 40%</td><td>TCI America</td><td>TCI-M0137</td><td>Voor het bereiden van AMA deprotectiereagens (sectie 5)</td></tr><tr><td>Geautomatiseerde DNA/RNA-oligonucleôtidesynthesizer</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td>Expedite 8909 DNA/RNA Synthesizer</td><td>elke op kolom gebaseerde synthesizer is acceptabel (sectie 1)</td></tr><tr><td>Magneet voor parelketting</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12320D</td><td>Voor streptavidin parelketting (sectie 7)</td></tr><tr><td>Bromofenolblauw</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610404</td><td>Voor PAGE ureumlaadbuffer (sectie 5)</td></tr><tr><td>Diepe vacuümoliepomp</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VLP200-115</td><td>Voor gebruik met lyofilisator (sectie 5)</td></tr><tr><td>Drierite droogmiddel, 10-20 mesh</td><td>MilliporeSigma</td><td>737828</td><td>Droogmiddel voor het opslaan van trifosforyleringschemie en apparatuur (secties 1&ndash;2)</td></tr><tr><td>D-RNA 27.3t cross-chirale polymerase</td><td>bereid in huis18</td><td>5&prime;-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3&prime;</td><td>Voor cross-chirale ribozymereacties (sectie 7)</td></tr><tr><td>D-RNA CPG vaste dragers, 1.000&Aring;, voorverpakt 1 &micro;mol synthesekolom</td><td>Glen Research</td><td>20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E</td><td>representatief, voor D-RNA oligonuc-leotidesynthese (sectie 1)</td></tr><tr><td>D-RNA TOM-beschermde fosforamiden</td><td>ChemGenes</td><td>ANP-3201, 3202, 3203, 3205</td><td>representatief, voor D-RNA oligonuc-leotidesynthese (sectie 1)</td></tr><tr><td>Lege Expedite-synthesekolommen, 1&micro;m</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>Synthesekolommen voor gebruik met Expedite DNA/RNA synthesizer (sectie 1)</td></tr><tr><td>EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&prime;-(3-propaansulfonzuur), vast</td><td>MilliporeSigma</td><td>E1894</td><td>Ribozymreactiebuffercomponent (sectie 6)</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), vast</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>Chelator voor tweewaardige metaalionen voor gebruik in verschillende buffers (secties 5&ndash;7)</td></tr><tr><td>Filters voor Expedite-synthesekolommen</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F</td><td>Expedite-stijl synthesekolomfilters, voor gebruik met lege synthesekolom (sectie 1)</td></tr><tr><td>Fluorescente/fosforescente gelscanner</td><td>Cytiva</td><td>Amersham Typhoon RGB, 29187193</td><td>Voor het visualiseren van analytische PAGE (secties 6&ndash;7)</td></tr><tr><td>Formamide, gedeïoniseerd</td><td>VWR Life Science</td><td>97062</td><td>Voor PAGE formamide gel laadbuffer (secties 6&ndash;7)</td></tr><tr><td>Gelbeeldkwantificeringssoftware</td><td>Cytiva</td><td>ImageQuant TL</td><td>Voor het kwantificeren van gescande gelbeelden (sectie 6)</td></tr><tr><td>Glazen droogkast</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3121150</td><td>Opslag van trifosforyleringsoplosmiddelen (sectie 2)</td></tr><tr><td>L-RNA CPG vaste dragers, 1.000&Aring;, bulk</td><td>ChemGenes</td><td>N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10</td><td>L-RNA oligonuc-leotidesynthese (sectie 1)</td></tr><tr><td>L-RNA hammerhead-template</td><td>bereid in huis18</td><td>5&prime;-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3&prime;</td><td>Voor cross-chirale ribozymereacties (sectie 7)</td></tr><tr><td>L-RNA primer</td><td>bereid in huis18</td><td>5&prime;-fluoresceine-GGCUCGA-3&prime;</td><td>Voor cross-chirale ribozymereacties (sectie 7)</td></tr><tr><td>L-RNA TOM-beschermde fosforamiden</td><td>ChemGenes</td><td>OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205</td><td>L-

chemische trifosforylering van oligonucleotiden

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

Het 5′-trifosfaat is een essentiële nucleïnezuurmodificatie die gedurende het hele leven wordt aangetroffen en in toenemende mate wordt gebruikt als een functionele modificatie van oligonucleotiden in de biotechnologie en synthetische biologie. Oligonucleotide-5′-trifosfaten zijn van oudsher in vitro bereid met enzymatische methoden. Deze methoden zijn echter beperkt tot natuurlijke RNA-oligonucleotiden, hebben sterke sequentievoorkeuren en hebben de neiging heterogene producten te produceren. Nieuwe methoden voor chemische trifosforylering vormen een aanvulling op zowel de lagere kosten van geautomatiseerde oligonucleotidesynthese door fosforamidietchemie als het gevarieerde scala aan nucleotidemodificaties dat nu beschikbaar is. Zo is de synthese van oligonucleotidetrifosfaten van willekeurige volgorde en lengte, en optioneel met verschillende niet-natuurlijke modificaties, nu toegankelijk.
Dit artikel presenteert de geschikte methoden en technieken voor chemische trifosforylering van oligonucleotiden met behulp van salicylfosforchloorthiat en pyrofosfaat. Deze methode maakt gebruik van in de handel verkrijgbare reagentia, is compatibel met de meeste oligonucleotiden bereid met standaard vaste-fasesynthesemethoden en kan binnen 2 uur na oligonucleotidesynthese worden voltooid, vóór deprotectie en zuivering. Twee toepassingen van chemisch trifosforyleerde oligonucleotiden als substraten voor katalytische RNA-enzymen worden aangetoond, waaronder de synthese van een spiegelbeeldversie van het hamerkop ribozym uit niet-biologische L-RNA-trifosfaten.

Oligonucleotiden moeten worden gesynthetiseerd met behulp van standaardprotocollen die geschikt zijn voor de fosforamidieten en geautomatiseerde DNA/RNA-synthesizer, waarbij het product oligonucleotide wordt afgeroomd van de vaste drager in de oorspronkelijke plastic synthesekolom, waarbij de 5ʹ-terminale dimethoxytritylgroep wordt verwijderd om de vrije 5ʹ-hydroxyl te verkrijgen (sectie 1). Alle oligonucleotiden die in deze demonstratie werden gebruikt, werden bereid met behulp van 1.000 Å-gecontroleerde porieglas (CPG) hars als de vaste ondersteuning en uitgevoerd op de schaal van 0,2 of 1 μmol. Representatieve voorbeelden van synthesizerkolommen, harsen, reagentia en fosforamidieten zijn te vinden in de Tabel van Materialen. Voor reacties op grotere schaal moeten mogelijk volumes en tijden die in volgende stappen worden gebruikt, worden aangepast.
De trifosforyleringsreactie wordt op de kolom uitgevoerd in een op maat gemaakte reactiekamer (figuur 2, punt 3) met behulp van standaard, in de handel verkrijgbare componenten die zijn opgenomen in de materiaaltabel en volgt het schema dat wordt geïllustreerd in figuur 1 (sectie 4) 28. Het is van essentieel belang dat de omstandigheden tijdens trifosforylering strikt watervrij worden gehouden en dat alle oplosmiddelen en reagentia van tevoren over moleculaire zeven worden bereid en vóór gebruik volledig worden gedroogd (punt 2). Trifosforylering duurt meestal 2 uur en daarna kan de gewassen en gedroogde kolom worden behandeld volgens standaard oligonucleotide-deprotectie- en zuiveringsprocedures (sectie 5).
Na deprotectie worden oligonucleotidetrifosfaten gezuiverd door polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) te denatureren, waarbij een enkele belangrijke productband wordt getoond door UV-back-shadowing die uit de gel kan worden weggesneden en geëlueerd. Het 5′-trifosfaatproduct wordt gemakkelijk gescheiden van reactiezijdeproducten voor korte oligonucleotiden, zoals aangetoond voor DNA-trinucleotide 5ʹ-trifosfaten, pppAAA en pppCCC, en L-RNA-trinucleotide 5ʹ-trifosfaat pppGAA in figuur 3A,B. Zowel de 5′-hydroxyl- als de 5′-trifosfaatproducten voor AAA- en CCC-DNA-trimers werden weggesneden en geïdentificeerd door massaspectrometrie en dienovereenkomstig geëtiketteerd in figuur 3A. Extra banden, zoals zichtbaar voor de AAA DNA-trimer, bevatten over het algemeen niet genoeg materiaal om te herstellen en te identificeren. De aanwezigheid van deze banden correleert echter met extra productmassa's in de niet-gezuiverde reactieproducten (figuur 3C), die doorgaans 5′-difosfaat, monofosfaat en H-fosfonaatzijdeproducten vertegenwoordigen, zoals hieronder besproken.
Na PAGE-zuivering kunnen grotere oligonucleotiden worden geëlueerd met behulp van de crush and soak-methode42 en de daaropvolgende ethanolprecipitatie. Oligonucleotiden van minder dan 15 nt kunnen echter niet efficiënt worden neergeslagen en vereisen dus een gewijzigde procedure voor gel-elutie (stap 5.11.3). De kolom met uitsluiting van wegwerpgroottes in de tabel met materialen is alleen geclassificeerd voor gebruik met oligonucleotiden langer dan 10 nt. We hebben echter ontdekt dat oligonucleotiden zo kort als trimers effectief kunnen worden ontzout met behulp van het door de fabrikant aanbevolen protocol. Niettemin wordt aanbevolen bij het ontzouten van korte oligonucleotiden (zoals in stappen 5.6 en 5.11.3) dat het kolomaccum in fracties wordt verzameld en dat productfracties worden geïdentificeerd door absorptie bij 260 nm met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer. Een kolom voor het uitsluiten van grootte die is geoptimaliseerd voor kortere oligonucleotiden is als alternatieve keuze beschikbaar in de tabel met materialen . De uiteindelijke opbrengst van oligonucleotidesynthese op schaal 1 μmol na zuivering is 50-300 nmol.
Trifosforylering kan worden bevestigd door massaspectrometrie, waarbij het trifosforyleerde product een massa heeft van +239,94 Da groter dan het 5′-hydroxyl-oligonucleotide, hoewel de aanwezigheid van materialen die overeenkomen met het 5′-di- en monofosfaat (respectievelijk +159,96 en +79,98 Da) vaak wordt waargenomen. Een 5′-H-fosfonaat bijproduct met een massa +63,98 Da uit de 5′-OH-massa kan ook worden waargenomen, en hoge niveaus van dit product wijzen erop dat de omstandigheden tijdens trifosforylering niet voldoende watervrij waren. Voorafgaand aan de zuivering zullen beschermde oligonucleotiden doorgaans al deze producten tonen (figuur 3C), terwijl gezuiverd materiaal een piek zal vertonen die overeenkomt met het 5′-trifosfaatproduct samen met 5′-di- en monofosfaten (figuur 3D,E).
Massaspectrometrie alleen zal meestal geen rigoureuze meting van 5′-trifosfaatzuiverheid geven als gevolg van differentiële ionisatiesnelheden en fragmentatie van het trifosfaat tijdens ionisatie. Om de zuiverheid van het eindproduct te meten, worden omgekeerde fase vloeistofchromatografie en tandem ESI-MS (RP-LC/ESI-MS) aanbevolen, met name voor langere oligonucleotiden. Analyse van D-RNA 5ʹ-trifosfaten pppACGAGG en pppGACCGCAACUUA door RP-LC/ESI-MS (respectievelijk figuur 4A,B) toont een typische zuiverheid van het eindproduct, met 20% 5ʹ-difosfaat, aangezien deze twee soorten moeilijk te scheiden zijn wanneer ze aanwezig zijn op langere oligonucleotiden.
Synthetische 5′-trifosfaat oligonucleotiden functioneren doorgaans even goed of beter dan materialen die enzymatisch worden bereid in biochemische studies. In rubriek 6 werden bijvoorbeeld 5′-trifosfaat 14 nt RNA-substraten die synthetisch of door in vitro transcriptie waren bereid, vergeleken in een RNA-gekatalyseerde zelfreplicatiereactie 14,15,43,44,45. Ribozym E katalyseert het samenvoegen van substraten A en B om een nieuwe kopie van E te verkrijgen in een autokatalytische reactie die exponentiële groei mogelijk maakt (figuur 5A). E- en 32P-gelabelde A-componenten werden bereid door in vitro transcriptie en trifosforyleerd substraat B werd synthetisch bereid, zoals hierboven beschreven, of door in vitro transcriptie14. De voortgang van de zelfreplicatiereactie werd gemonitord door periodieke monsters te nemen die werden geanalyseerd door PAGE te denatureren en gekwantificeerd via een fluorescerende / fosforescerende gelscanner. De resulterende gegevens, passend bij een logistieke groeifunctie, onthulden dat getranscribeerd of synthetisch B-substraat exponentiële groei ondersteunt, maar synthetische B geeft een iets grotere hoeveelheid product (figuur 5B). Dit resultaat kan heterogeniteit weerspiegelen aan het 5′-einde van RNA bereid door in vitro transcriptie23,24.
Chemische trifosforylering maakt ook de synthese mogelijk van oligonucleotidetrifosfaten die niet biologisch kunnen worden bereid, noch in vitro , noch in cellen. In rubriek 7 werden niet-biologische oligonucleotidetrifosfaten bestaande uit L-RNA, het enantiomeer van natuurlijk D-RNA, bereid zoals in rubriek 1-5, gebruikt als substraten voor het D-RNA "cross-chirale" polymerase ribozyme 27.3t (figuur 6A), dat de sjabloongerichte polymerisatie van een langer L-RNA-product van kort L-RNA-oligonucleotide 5′-trifosfaten op een sequentie-algemene manier katalyseert. Als voorbeeld kan het ribozym een L-RNA-versie van het hamerkopzelfsplitsingsmotief synthetiseren (figuur 6B)18. Gezuiverde L-RNA trinucleotide trifosfaten werden gecombineerd met een fluoresceïne-gelabelde L-RNA primer en L-RNA template (Figuur 6C) en reageerden met de cross-chiral ligase. Monsters in de loop van de reactie werden geanalyseerd door PAGE en in beeld gebracht met behulp van een fluorescerende / fosforescerende gelscanner om de synthese van een L-RNA-versie van het hamerkop ribozym gecodeerd door de sjabloon aan te tonen (figuur 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig03.jpg"> Figuur 3: Zuivering van trinucleotide 5ʹ-trifosfaten. (A) PAGE-analyse (gevisualiseerd door UV-back-shadowing) van trifosforylering van DNA-trinucleotiden tri-deoxyadenosine (AAA, blauw) en tri-deoxycytidine (CCC, rood), opzettelijk overbelast om kleine bijproducten te visualiseren. Zowel het 5ʹ-trifosfaatproduct (ppp) als het 5ʹ-hydroxyl (OH) uitgangsmateriaal werden door MALDI-MS weggesneden en geïdentificeerd. (B) Preparatieve PAGINA van trifosforylering van L-RNA-trinucleotide GAA, waarbij de belangrijkste productband is weggesneden en door ESI-MS is geïdentificeerd als het 5ʹ-trifosfaat (ppp). C) MALDI-MS van producten met ruwe reactie na deprotectie en D) gezuiverde producten van (A). 5ʹ-trifosfaat (ppp; pppAAA verwachtte 1.119 Da, waargenomen 1.118 Da; pppCCC verwachtte 1.047 Da, waargenomen 1.046); 5ʹ-difosfaat (pp), 5ʹ-monofosfaat (p), 5ʹ-hydroxyl (OH) en 5ʹ-H-fosfonaat (Hp) zijn gelabeld. (E) Gedeconvolueerd massaspectrum van directe injectie ESI-MS van geïsoleerd 5ʹ-trifosfaatproduct uit (B), met geïdentificeerde pieken gelabeld (verwacht 1.181,6 Da, waargenomen 1.181,0 Da). 5ʹ-difosfaat (pp) producten worden ook waargenomen, evenals natriumion pieken voor zowel de tri- als di-fosfaat producten (+22 Da). Veelvoorkomende verontreinigingspieken zijn gelabeld met een sterretje. Voor het gemak van vergelijking werden massaspectra genormaliseerd tot de hoogste intensiteit gemeten in elk spectrum en worden gerapporteerd als een percentage ten opzichte van die waarde. Afkortingen: PAGE = polyacrylamide gel elektroforese; MALDI-MS = matrixondersteunde laserdesorptie/ionisatie; ESI-MS = elektrospray ionisatie massaspectrometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig04.jpg"> Figuur 4: Analytische RP-LC van 6 nt en 14 nt D-RNA oligonucleotide trifosfaten. (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ en (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. Tandem ESI-MS identificeerde de belangrijkste piek van beide (~ 70%) als het 5ʹ-trifosfaat (ppp), met kleinere hoeveelheden van het 5ʹ-difosfaat (pp). Afkortingen: RP-LC = reverse-phase liquid chromatography; nt = nucleotiden; ESI-MS = elektrospray ionisatie massaspectrometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig05.jpg"> Figuur 5: Vergelijking van oligonucleotide 5ʹ-trifosfaatsubstraten bereid door chemische synthese of in vitro transcriptie. (A) Het zelfreplicerende ribozym E ligeert RNA A en 5′-trifosforyleerd RNA B. (B) Vergelijking van zelfreplicatiereacties met behulp van 10 μM A en 10 μM B, hetzij synthetisch (open cirkels) of in vitro getranscribeerd (gevulde cirkels). (B) Gegevens waren geschikt voor de logistieke groeivergelijking: [E] = a / (1 + b e-ct), waarbij a de uiteindelijke opbrengst is, b de mate van sigmoidicity en c de exponentiële groeisnelheid. De groeipercentages voor de twee reacties waren identiek, bij 1,14 h-1, terwijl de uiteindelijke omvang 10% hoger was voor reacties met synthetische B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig06.jpg"> Figuur 6: Cross-chirale L-RNA polymerisatie met een ribozym. (A) Het D-RNA 27.3t polymerase ribozyme, dat sjabloonafhankelijke ligatie van L-RNA katalyseert. (B) Het door 27,3 ton gesynthetiseerde L-RNA-product maakt deel uit van een hamerkop-endonucleasemotief. (C) L-RNA-polymerisatie gekatalyseerd door 27,3 ton met behulp van een gebiotinyleerd L-RNA-sjabloon (bruin), een end-label L-RNA-primer (magenta) en vier L-RNA-trinucleotidetrifosfaten (cyaan), synthetisch bereid. (D) PAGE-analyse van uitbreidingsproducten van (B) na 4 uur en 24 uur, waarbij elke trinucleotide-incorporatie tot een volledig product (zwarte stip) wordt getoond. Niet-gereageerde L-RNA-primer is opgenomen als referentiemarker. Afkortingen: PAGE = polyacrylamide gel elektroforese; M = referentiemarkering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Oligonucleotide 5′-trifosfaten zijn alomtegenwoordige componenten in essentiële biologische routes en worden steeds vaker gebruikt in biotechnologische toepassingen. Hier beschrijven we technieken voor de routinematige synthese en zuivering van oligonucleotide-5′-trifosfaten, uitgaande van oligonucleotiden bereid door standaard geautomatiseerde synthesetechnieken.

Chemische trifosforylering van oligonucleotiden

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

Trifosforylering is een alomtegenwoordige 5'modificatie van RNA in de biologie en wordt steeds vaker gebruikt in biotechnologische toepassingen. Het hier beschreven protocol maakt 5'trifosforylering mogelijk van elk oligonucleotide bereid door standaard geautomatiseerde synthese. Chemische trifosforylering werkt op oligonucleotiden die RNA, DNA of niet-natuurlijk nucleïnezuur bevatten.Hier wordt trifosforyleerd linkshandig L-RNA, het enantiomeer van biologisch D-RNA, gesynthetiseerd gezuiverd en gebruikt in een ribosoomreactie. Trifosforylering wordt uitgevoerd na geautomatiseerde oligonucleotidesynthese en vóór deprotectie. Deze stappen worden hier niet getoond, maar de onderzoekers moeten bekend zijn met standaardmethoden voor beide.Zorg er om te beginnen voor dat de werkruimte voor fosforylering een gasspruitstuk heeft met ten minste twee lijnen en de bubbler verbonden met een droge argonbron met instelbare druk, omdat de trifosforyleringsreactie onder argon moet worden uitgevoerd. Bevestig vervolgens een milliliter plastic spuiten aan de leidingen om de verbinding met het reactieapparaat te vergemakkelijken. Verzamel vervolgens de apparatuur, waaronder een milliliter plastic spuiten, een drieweg polypropyleen stopkraan, niet-coring naalden, polypropyleenbuizen van 1,5 milliliter, een kleine metalen spatel en bewaar ze in een verzegelde container of exsiccator met een dessicant bij kamertemperatuur gedurende ten minste één dag voorafgaand aan gebruik.Trek onder argondruk 30 milliliter watervrij 1, 4-dioxaan uit een afgesloten fles. Breng over in een gedroogde glazen fles van 30 milliliter en voeg een droogval toe. Afdichten met rubber septa en bewaren in een exsiccator met dessicant.Bereid op dezelfde manier 30 milliliter N, N-dimethylformamide, acetonitril en het mengsel van drie delen dioxaan en een deel pyridine per volume. Bereid TBAP-oplossing door vast tributylammoniumpyrofosfaat te mengen met dimethylformamide en tributylamine in een glazen fles van 30 milliliter zoals beschreven in het manuscript. Voeg drie tekenvallen toe.Sluit de fles af met een rubberen septum onder argon en bel met argon gedurende 30 minuten. Na het bereiden van een oligonucleotide met een vrije 5'hydroxyl op een synthesekolom met behulp van een geautomatiseerde DNA/RNA synthesizer. Bereid de kamer voor door de zuiger uit een droge spuit van één milliliter te verwijderen.Knip de bovenkant van de spuit af met een schaar of een scheermesje en bevestig de spuit aan de synthesekolom. Bevestig aan de bovenkant van de spuit de driewegstopkraan en bevestig de zijinlaat van de stopkraan met de bubbler aan de droge argonbron, zodat de bovenste inlaat van de stopkraan fungeert als de reagensinjectiepoort. Bevestig deze operators aan een standaard met klemmen en sluit alle upstream-verbindingen af met wasafdichtingsfolie.Stel vervolgens de stopkraan zo in dat de injectiepoort gesloten is en het apparaat open is voor de argonbron. Sluit de bubbler en laat argon bij lage druk gedurende vijf minuten door de actiekamer stromen. Nadat u de bubbler opnieuw hebt geopend, bevestigt u een spuit aan de onderkant van de synthesekolom, die de afvalspuit zal zijn.Trek vervolgens argon herhaaldelijk door de kolom met behulp van de afvalspuit en bevestig de spuit vervolgens opnieuw met de zuiger volledig naar binnen geduwd. Om een reagens of oplosmiddel toe te voegen, bevestigt u een naald aan de droge argonbron en plaatst u deze in het reagens- of oplosmiddelflestussenschot, waarbij u ervoor zorgt dat u de naald niet onderdompelt in de inhoud van de fles. Monteer vervolgens een droge spuit met een naald en steek deze in het reagens- of oplosmiddelflestussenschot zonder het onder te dompelen in de inhoud van de fles.Vul daarna de spuit met argon, trek de naald uit het septum en verdrijf het argon. Nadat u de spuit met argon hebt gevuld en nog een keer hebt uitgestoten, vult u de spuit met het vereiste volume oplosmiddel of reagens onder argondruk. Stel de stopkraan zo in dat de argonbron gesloten is en de injectiepoort open is.Zodra de stop op het apparaat snel is aangepast, verwijdert u de gevulde spuit en naald uit de bronfles, veegt u het oplosmiddel weg dat aan de zijkant of punt van de naald is geplakt en steekt u de naald vervolgens in de injectiepoort. Nadat een reagens in de antikamer van de operators is uitgestoten, verwijdert u de naald en sluit u de injectiepoort terwijl u het apparaat opnieuw opent naar de argonbron. Zuig de vloeistof voorzichtig uit de antikamer helemaal door de synthesekolom met behulp van de afvalspuit, zodat alle vloeistof nu in de afvalspuit wordt bewaard.Duw de oplossing nu langzaam terug in de synthesekolom, zodat er geen gasbellen in de kolom zitten. Om te mengen of te roeren, trekt u de oplossing voorzichtig op en neer over de kolom met de afvalspuit. Om een reagens of oplosmiddel uit de kolom te verwijderen, trekt u de oplossing langzaam in de afvalspuit.Nadat het grootste deel van de oplossing in de afvalspuit is gegaan, trekt u argon door om het resterende oplosmiddel uit de kolom te spoelen. Verwijder vervolgens de wasafdichtingsfolie rond de afvalspuitverbinding. Verwijder vervolgens de spuit en gooi de afvaloplossing weg.Vervang daarna de afvalspuit door een nieuwe droge spuit en sluit het gewricht opnieuw. Na het assembleren van het trifosforyleringsapparaat, begint u de trifosforyleringsreactie door 200 microliter pyridinedioxaan aan de antikamer toe te voegen, zoals eerder aangetoond. Maar trek nog geen monster op de synthesekolom.Voeg salpcl na het oplossen van SalPCl in dioxaan zoals beschreven in het manuscript toe aan de antikamer en laad het met een droge spuit op de synthesekolom. Laat het vervolgens 15 minuten reageren en verwijder en gooi vervolgens de SalPCl-oplossing weg met behulp van een afvalspuit zoals eerder aangetoond. Voeg onmiddellijk na het verwijderen van de SalPCl-oplossing 250 microliter TBAP-oplossing toe aan de antikamer en laad deze op de synthesekolom.Laat het 20 minuten reageren met agitatie en gooi het weg zoals eerder beschreven. Daarna de kolom gewassen met 0,5 milliliter N, N-dimethylformamide en vervolgens 0,5 milliliter acetonitril, waarbij het oplosmiddel na elke toevoeging werd verwijderd. Na het toevoegen van oxidatoroplossing, het verwijderen en het opnieuw wassen van de kolom met acetonitril volgens dezelfde procedure als afgebeeld, demonteer het apparaat en was de kolom met vijf milliliter acetonitril.Droog daarna de kolom. Splits het trifosforyleerde oligonucleotide van de vaste ondersteuning en deprotecteer met behulp van standaardprotocollen zoals beschreven in het manuscript. Vervolgens loste het gedroogde gedeprotected oligonucleotide op in ureumbelastingsbuffer, verwarmd tot 80 graden Celsius, laad vervolgens op een polyacrylamidegel en draai gedurende één tot twee uur op 25 tot 35 watt.Aan het einde van de gel-elektroforese, na het verwijderen van de gelplaat, demonteer deze en wikkel de gel in polyvinylchloridefilm. Identificeer vervolgens de productbanden door terugschaduwing met 254 nanometer UV-licht en snijd de belangrijkste productband weg met behulp van een scheermesje. Plet de weggesneden gel door deze door een plastic spuit of mechanisch te extruderen.Voor oligonucleotiden korter dan 15 nucleotide, elueren in drie keer het gelvolume van nucleasevrij water gedurende ten minste 12 uur met agitatie of schudden. Verwijder vervolgens vaste gelstukken door de oplossing door een spuit met een filter van 0,2 micrometer te laten gaan en concentreer door lyofilisatie. Verwijder na de concentratie resterende zouten en saluutschoten met behulp van een wegwerpmaatuitsluitingskolom en concentreer door lyofilisatie zoals eerder aangetoond.Na het bereiden van 10 microliter van een RNA-oplossing die polymerase ribozym en L-RNA primer sjabloon en trifosfaat trinucleotiden bevat zoals beschreven in het manuscript, gloei het door het gedurende één minuut te verwarmen tot 90 graden Celsius en het te koelen tot 23 graden Celsius bij 0,2 graden Celsius per seconde in een PCR-thermocycler. Na het incuberen van de RNA-oplossing bij 17 graden Celsius, stopt u de reactie door 10 microliter tweemaal de concentratie van de startbuffer toe te voegen terwijl de reactie vordert, neemt u 10 microliter aliquots en blust u met vijf microliter 0,5 molaire EDTA bij pH 8 en verwerkt u elk monster om RNA te isoleren zoals beschreven in het manuscript. Los het neergeslagen RNA op in 10 microliter geformaliseerde gellaadbuffer en bereid een niet-gereageerde primer voor zoals beschreven in de tekst.Zodra de monsters zijn voorbereid, verwarmen tot 80 graden Celsius. Laad vijf microliter van het monster in elke put en laat de gel ongeveer 40 minuten op 40 watt draaien. Nadat u de gelplaat van de standaard hebt verwijderd, scant u met behulp van een fluorescerende of fosforescerende gelscanner om kruis chirale L-RNA-uitbreidingsproducten te visualiseren.Na gelzuivering onthult UV-back shadowing de aanwezigheid van 5'trifosfaat als een enkel belangrijk product, zoals getoond voor AAA- en CCC DNA-trimers en GAA L-RNA-trimer. Het 5'hydroxyl side product is vaak zichtbaar als een langzamer migrerende band, die werd geïsoleerd en geïdentificeerd door massaspectrometrie voor DNA-trimers. Extra banden tijdens gelzuivering correleren met 5'difosfaat, monofosfaat en H-fosfonaat zijproducten in massaspectrometrie van de ongezuiverde reactieproducten.5'trifosfaatproducten vertonen een primaire massapiek die overeenkomt met het 5'trifosfaat samen met 5'di en monofosfaatmassa's. Chemisch trifosfaat gerelateerde L-RNA trinucleotiden werden gebruikt met een L-RNA primer en L-RNA template in een RNA polymerisatie reactie geanalyseerd door PAGE en in beeld gebracht met behulp van een fluorescerende gel scanner. Het uitgebreide product gemarkeerd door zwarte cirkels demonstreerde de synthese van een L-RNA-versie van het hamerkop ribozym gecodeerd door de sjabloon.Blootstelling aan water tijdens trifosforylering zal de opbrengst verminderen. Volg de stappen voor het bereiden van droge reagentia en het zorgvuldig samenstellen van het reactieapparaat. Verplaats vloeistoffen langzaam door het apparaat om breuk in afdichtingen te voorkomen.Chemische trifosforylering is essentieel voor de bereiding van niet-biologische oligonucleotidetrifosfaten, waaronder linkshandig RNA. Dit heeft cross chirale ribozymsynthese mogelijk gemaakt van de spiegelbeeldversies van RNA-moleculen die in de biologie worden aangetroffen.

chemical-triphosphorylation-of-oligonucleotides

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De hierin beschreven protocol heeft tot doel uit te leggen en verkorten de vele obstakels in de weg van de ingewikkelde route die leidt tot gewijzigde nucleosidetrifosfaten. Bijgevolg Dit protocol maakt zowel de synthese van deze geactiveerde bouwstenen en hun beschikbaarheid voor praktische toepassingen.

Nucleosidetrifosfaten - Van Synthese tot biochemische karakterisering

Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

Dit artikel geeft een gedetailleerde procedure voor de solide fase synthese, zuivering en karakterisering van dodecamers van RNA gemodificeerd op de C2'- O- positie. UV-vis en cirkelvormige dichroïstische fotometrische analyses worden gebruikt om structurele aspecten te kwantificeren en karakteriseren, dwz enkelstrengen of dubbelstrengen.

Protocol voor de vaste fase synthese van oligomeren van RNA die een 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethylmodificatie en karakterisering via cirkelvormige dichroïsme

We melden de protocollen voor de synthese en zuivering van Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomeren opnemen gewijzigd residuen. De biochemische en Biofysische methoden voor de karakterisatie van de erkenning van RNA duplexen door de gewijzigde PNAs worden beschreven.

Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

Eiwitten die specifieke RNA opeenvolgingen binden spelen een kritieke rol in genexpressie. Gedetailleerde karakterisering van deze bandplaatsen is van cruciaal belang voor ons begrip van de genexpressie. Hier, wordt een-voor-stapmodus aanpak voor verzadiging mutagenese van eiwit-bandplaatsen in RNA beschreven. Deze aanpak geldt voor alle websites van de binding aan eiwitten in RNA.

Een roman verzadiging mutagenese aanpak: Macrostap karakterisering van regelgevende proteÃ¯ne bindend Sites in RNA met behulp van fosforthioaten

Dit protocol beschrijft een niet-radioactieve test om kinase activiteit van polynucleotide kinases (PNKs) te meten op kleine DNA- en RNA-substraten.

Niet-radioactieve test om polynucleotide fosforylatie van kleine nucleotide substraten te meten

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het bepalen van nucleïnezuurmetaboliserende enzymen, met behulp van voorbeelden van ligase-, nuclease- en polymerase-enzymen. De test maakt gebruik van fluorescerend gelabelde en niet-gelabelde oligonucleotiden die kunnen worden gecombineerd om duplexen te vormen die RNA- en/of DNA-schade of tussenproducten van de route nabootsen, waardoor het enzymgedrag kan worden gekarakteriseerd.

Gebruik van gemodificeerde synthetische oligonucleotiden om nucleïnezuurmetaboliserende enzymen te testen

Een 3D cultuur voor hematopoiesis beschreven met menselijke navelstrengbloed en leukemische beenmergcellen. De methode is gebaseerd op het gebruik van een poreuze kunststof polyurethaan scaffold bekleed met extracellulaire matrix. Deze steiger is aanpasbaar aan een groot aantal cellen te passen.

Ex vivo Mimicry van normale en abnormale Human Haematopoiese

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Millifluidic apparaten worden gebruikt voor gecontroleerde synthese van nanomaterialen tijdsopgeloste analyse van reactiemechanismen als continu katalyse.

Millifluidics voor chemische synthese en Tijdopgeloste mechanistische studies

Leer een chemische methode voor 5'-trifosforylering van oligonucleotiden met salicylfosforochloridiet en pyrofosfaat. Dit protocol maakt synthese van trifosforyleerde oligonucleotiden mogelijk voor biotechnologie en synthetische biologie.

Chemische trifosforylering van oligonucleotiden

Meer video's verkennen