Kweken en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden

Een efficiënt protocol voor het handhaven en versterken van entomopathogene nematoden is essentieel voor het begrijpen van de moleculaire basis van de pathogeniteit van nematoden en de immuniteit van gastheer-anti-nematoden. Dit protocol stelt ons in staat om een groot aantal symbiotische en axene Heterorhabditis bacteriophora en Steinernema carpocapsae IJs te produceren met behulp van insectengastheer Galleria mellonella. Begin met het bedekken van de petrischaal met een stuk filterpapier en voeg ongeveer 10 tot 15 Galleria mellonella-larven toe.

Gebruik een pipet om twee milliliter water met ongeveer 25 tot 50 infectieuze juvenielen per 10 microliter suspensie op de waswormen af te geven. En bewaar de petrischaal in een kast op kamertemperatuur. Afhankelijk van het vochtgehalte van het filterpapier, voeg je elke twee dagen een tot twee milliliter water toe.

Waswormen die besmet zijn met infectieuze juvenielen sterven meestal binnen 48 uur. Bereid white's watervallen ongeveer 10 dagen nadat de waswormen zijn geïnfecteerd met de infectieuze juvenielen. Breng de dode insecten voorzichtig over op het ongesopukte deel van het filterpapier.

Gebruik kraanwater om de onderste petrischaal te vullen en plaats een dop van een buis van 15 milliliter als afstandhouder voor ventilatie. Gebruik kraanwater in plaats van gedemineraliseerd of gedeïoniseerd water om nematodenaggregatie te voorkomen en zorg ervoor dat het waterniveau in de watervanger ongeveer de helft van de hoogte van de petrischaal bereikt. Wanneer het water in de kleine petrischaal troebel wordt als gevolg van nematoden, gebruik dan een pipet om de nieuwe generatie infectieuze juvenielen in een T25- of een T75-celkweekkolf te verplaatsen.

Voeg later kraanwater toe tot 40% volume of totdat de juiste dichtheid is bereikt. En bewaar de celkweekkolf horizontaal om congestie van nematoden te voorkomen. Herhaal de overdracht van infectieuze juvenielen in celkweekkolven en de toevoeging van water totdat de infectieuze juvenielen binnen ongeveer drie tot vijf dagen niet meer uit de kadavers van het insect komen.

Schraap met behulp van een inentingslus verschillende vlokken van een bevroren cultuur van Photorhabdus temperata Ret16 op een MacConkey-plaat en streep voor enkele kolonies. Incubeer de plaat gedurende twee tot drie dagen bij 28 graden Celsius. Ent na incubatie 10 milliliter LB-bouillon met een kolonie op MacConkey-agar in een buis van 50 milliliter en incubeer de cultuur 's nachts bij 28 graden Celsius in een schuddende incubator.

Breng na incubatie 100 microliter nachtcultuur over van een buis van 50 milliliter in een nieuwe microcentrifugebuis en was vervolgens 100 de nachtcultuur met 900 microliter pbs met één sterkte door centrifusie, in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter, bij 17.900 keer g. Decanteer het supernatant. Verdun vervolgens de cultuur 10 keer in pbs met één sterkte en laat de buis op ijs staan.

Dompel de waswormen nu onder in een 70% ethanoloplossing. Nadat je de insecten hebt gedroogd met een papieren handdoek, plaats je ze in een buis van 50 milliliter. Plaats de tube 20 minuten op ijs om de waswormen te immobiliseren.

Gebruik filterpapier om de bovenste en onderste helften van een petrischaal te bedekken. Gebruik het petrischaaldeksel bedekt met filtreerpapier als basisondersteuning voor injectie. Vochtig in het filterpapier van de onderste petrischaal en breng het over op ijs om de geïnjecteerde waswormen te helpen herstellen.

Pipetteer 50 microliter ijskoude bacteriën op een stuk Parafilm en bereid vervolgens een 22 gauge raffinaderijnaaldspuit voor en druk zachtjes op de zuiger om de lucht aan het uiteinde van de naald te verwijderen. Een wasworm dicht bij het achterste uiteinde onder de stereoscoop houden. Injecteer bacteriecultuur in de dorsale kant van de thorax.

Bij voorkeur op de kruising tussen twee segmenten net onder de cuticula parallel aan de wasworm om interne schade te minimaliseren en aandacht te besteden aan hoe het larvale lichaam begint uit te puilen. Breng vervolgens de geïnjecteerde insecten over naar de herstel petrischaal. En zodra alle insecten zijn geïnjecteerd en in de herstelschaal zijn geplaatst, plaatst u de petrischaal in het donker.

Waswormen bezwijken twee dagen na injectie en lijken na ongeveer drie tot vier dagen baksteenrood. Bruingekleurde insecten wijzen echter op een mislukte bacteriële infectie. Breng zeven dagen na de infectie de insecten met de karakteristieke baksteenrode kleur over op een met vers filterpapier beklede petrischaal en herhaal de productie van symbiotische nematoden infectieuze juvenielen.

Om oppervlaktesterilisatie te beginnen, verzamelt u voldoende symbiotische, Heterorhabditis bacteriophora en kandidaat-axeen infectieve juvenielen door centrifugatie. Om een pellet in een centrifugebuis van 1,5 milliliter te maken, voegt u 500 microliter 5% bleekmiddel toe aan de pellet in elke microcentrifugebuis en keert u de buis om. Na 10 minuten incuberen, centrifugeer op 17, 900 keer g gedurende één minuut en verwijder het supernatant.

Was de pellet vervolgens met één milliliter steriel water. Centrifugeer het, verwijder het supernatant en herhaal deze procedure nog vier keer. De grafiek toont de resultaten van het beoordelen van de status van Heterorhabditis bacteriophora nematoden die axenisatie hebben ondergaan.

Heterorhabditis bacteriophora uit de stamcultuur droeg symbiotische Photorhabdus luminescens-cellen. Nematoden zonder hun geassocieerde Photorhabdus luminescens-bacteriën waren echter axeen. Om de reproduceerbaarheid van uw experiment te behouden, streept u altijd vers uit de bacteriële stamcultuur uit een verse kolonie en verwijdert u de nachtcultuur voordat deze het stationaire gezicht bereikt.

Gebruik alleen de baksteenrode Galleria-wasworm voor white's waterval en gooi de rest weg. Na deze procedure kunnen de nematoden worden gebruikt om de interactie met het immuunsysteem van insecten te onderzoeken. Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om de moleculaire basis van nematode parasitisme en gastheer anti-nematode immuniteit te onderzoeken.