Bottom-up in vitro methoden om de ultrastructurele organisatie, membraanhervorming en krommingsgevoeligheidsgedrag van septines te testen

Met behulp van dit protocol visualiseerden we de organisatie van cytoskeletale filamenteuze eiwitten op patroonsubstraten met verschillende krommingen. We kunnen de krommingsgevoeligheid testen. De resolutie van scanning elektronenmicroscoopbeelden is hoog genoeg zodat nanometerschaalorganisaties worden gevisualiseerd.

De methoden die we gebruiken voor fixatie zijn mild genoeg om de intra-structurele organisatie van het eiwit te behouden. Dit blijft in het kader van fundamenteel onderzoek om het gedrag van cytoskeletale filamenten te begrijpen. Begin met het ontwerpen van een golvende Norland Optical Adhesive, of NOA-replica, in een cleanroom-omgeving van golvende polydimethylsiloxaan golvende patronen van 250 nanometer amplitude en twee micrometer laterale periodiciteit.

Om dit te doen, deponeert u vijf microliter vloeibare NOA op een cirkelvormige glazen afdekslip met een diameter van één centimeter en plaatst u vervolgens de PDMS-sjabloon op de druppel. Behandel de assemblage met UV-licht op 320 nanometer gedurende vijf minuten om de vloeibare NOA te fotopolymeriseren tot een dunne polymeerfilm. Als u klaar bent, pelt u voorzichtig de PDMS-sjabloon van de afdekslip met de vers gepolymeriseerde NOA.

Behandel de NOA-film met een luchtplasmareiniger gedurende vijf minuten om het oppervlak hydrofiel te maken. Bereid een oplossing van kleine unilamellaire blaasjes of SUV's, zoals beschreven in het manuscript, en verkrijg de SUV's door een gedroogde lipidefilm in de observatiebuffer onder de ultrasoonapparaat in een badsonicator gedurende vijf tot 10 minuten te resuspenderen totdat de oplossing transparant is. Plaats later de afdeksels die de NOA-patronen ondersteunen in de putten van celkweekdozen en incubeer de vers gloeiende NOA-patronen met 100 microliter van één milligram per milliliter SUV-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om een ondersteunde lipide bilayer te genereren.

Om de ongefundeerde SUV te verwijderen, spoelt u de zijkanten zes keer grondig af met de septine lage zoutbuffer zonder het monster volledig te laten drogen tussen twee wasbeurten. Verdun de octomerische septine stockoplossing in een septine lage zoutbuffer tot eindconcentraties, variërend van 10 tot 100 nanomolaar en volumes van één milliliter. Incubeer vervolgens de eiwitoplossing op de dia's gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Was de NOA-dia's met gesmolten ondersteunde lipide bilayers en incubeer eiwit met septine lage zoutbuffer. Vervang septine lage zoutbuffer door 2% glutaaraldehyde fixatieve oplossing in 0,1 molaire natriumcacodylaatbuffer, voorgewarmd bij 37 graden Celsius, en laat de reactie gedurende 15 minuten doorgaan en was het vaste monster driemaal, elk vijf minuten met 0,1 molaire natriumcacroodylaat. Incubeer na het wassen het monster in de fixatieve oplossing van osmiumtetroxide, vervolgens het gefilterde looizuur en ten slotte het gefilterde uranylacetaat gedurende 10 minuten elk.

Was het monster driemaal in gedestilleerd water na elke oplossing. Incubeer het monster serieel in ethanoloplossingen vanaf 50% tot 100% gedurende elk twee tot drie minuten. Breng de glasglaasjes over in de kritische puntdroger die is voorgevuld met ethanol en volg de instructies van de fabrikant voor het drogen.

Omdat gedroogde monsters zeer hydroscopisch zijn, moet u ze onmiddellijk coaten door de afdekslip aan de stompen te bevestigen. Voeg vervolgens een strook zilververf toe aan de bovenkant van de afdekslip zonder verfdeglomeraties te creëren. Zorg ervoor dat de verbinding met de stomp bevredigend is.

Wanneer het monster volledig verdampt, gebruikt u een apparaat dat is uitgerust met een plasma-magnetron sputterkop en een roterend planetaire fase en volgt u de standaardprotocollen van de fabrikant. Voer pre-sputtering uit op 120 milliamperes gedurende 60 seconden om de oxidelaag aan het oppervlak te verwijderen. Deponeer vervolgens 1,5 nanometer wolfraam met een filmdiktemonitor op 90 milliamperes en een werkafstand van 50 milliliter.

Bewaar de monsters later onder een vacuüm om ze te beschermen tegen de omgevingslucht tot en met de SEM-analyses. Om hoge oplossingsbeeldvorming te bereiken door de secundaire elektronen met de binnenlandse detector te detecteren, stelt u de versnellende spanning in op drie kilovolt en de bundelstroom op een diafragma van 20 micrometer. Gebruik voor waarnemingen resoluties variërend van 21,25 nanometer per pixel tot 1,224 nanometer per pixel.

Gebruik een resolutie van 5,58 nanometer per pixel voor data-analyse. Stel de werkafstand in tussen één en twee millimeter voor observatie met hoge resolutie en ongeveer drie millimeter als een grotere scherptediepte vereist is. Pas de scansnelheid en lijnintegratie continu aan om een constante signaal-ruisverhouding te garanderen met een acquisitietijd van ongeveer 30 tot 45 seconden per beeld.

De representatieve analyse illustreert het effect van het materiaal dat op de septinefilamenten wordt afgezet op golvende PDMS-patronen met 1,5 nanometer platina en 1,5 nanometer wolfraam. Er werd waargenomen dat kale gigantische unilamellaire blaasjes, of GUVs, perfect bolvormig waren. Na de septine-geïnduceerde vervorming leken de blaasjes gefacetteerd en bleven de vervormingen statisch en fluctueerden dus niet.

Bij hogere concentraties van de septines werden periodieke vervormingen in de blaasjes waargenomen. Zelfassemblage van de septinefilamenten gebonden aan grote unilamellaire blaasjes, of LUV's, werd onderzocht met een cryo-elektronenmicroscopiebeeld en 3D-reconstructie werd verkregen uit een gekantelde reeks. De krommingsafhankelijke rangschikking van de septinefilamenten werd gevisualiseerd door scanning elektronenmicroscopie.

Bij lage vergroting was een golvend patroon met de periodiciteit van negatieve en positieve krommingen zichtbaar. De ultrastructurele organisatie van de septinefilamenten werd bekeken bij een hogere vergroting. De NOA moet voorzichtig worden afgepeld om degradatie te voorkomen.

Na beeldvorming kan enige beeldanalyse worden uitgevoerd om de ultrastructuurkenmerken te kwantificeren die door SCM worden gevisualiseerd, zoals de afstand tussen filamenten en de oriëntatie van het filament. De huidige methode is toegepast op septines, maar het kan ook worden gebruikt voor andere cytoskeletale eiwitten of eiwitten die zich organiseren als lange filamenten en dus gevoelig zijn voor kromming.