Microfluïdische hulpmiddelen voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties op cellulair niveau

Met behulp van de gepresenteerde microfluïdische apparaten kunnen we dynamische interacties tussen schimmels en andere microben onderzoeken met nauwkeurige ruimtelijke en omgevingscontrole, evenals beeldvorming met hoge resolutie op het niveau van één cel. Belangrijk is dat schimmelgroei kan worden beperkt en gericht binnen het microfluïdische kanaal. Hiermee kunnen time-lapse-afbeeldingen van hoge kwaliteit worden verkregen.

Daarom kunnen de complexiteiten van schimmel-schimmel- en schimmel-bacteriële interacties worden onderzocht. Het begrijpen van microbiële interacties van schimmels is een essentiële stap in het definiëren en behouden van het bodemmicrobioom. Deze kennis kan worden gebruikt voor de ontwikkeling van nieuwe biocontrolemiddelen met duurzame landbouw.

Bereid om te beginnen ongeveer 40 gram poly (dimethylsiloxaan) of PDM's, door de basis en het uithardingsmiddel grondig te mengen in een verhouding van 10 tot 1 met behulp van een spatel in een schone plastic beker. Om alle luchtbellen te verwijderen, plaatst u de beker gedurende een uur in een vacuümkamer. Bevestig vervolgens met behulp van doorzichtige tape de hoofdmal in een plastic houder en gebruik gecomprimeerde gefilterde lucht om stofdeeltjes te verwijderen, giet vervolgens de PDM's op het midden van de hoofdmal en laat deze bezinken.

Om te voorkomen dat stofdeeltjes op het PDM-oppervlak bezinken, bedekt u de hoofdmal losjes met een plastic deksel, brengt u de hoofdmal over naar een oven en hardt u 's nachts uit bij 70 graden Celsius. Nadat u de hoofdmal uit de oven hebt gehaald en deze hebt laten afkoelen, verwijdert u de uitgeharde PDM's van de hoofdmal en het plastic frame zonder de hoofdmal in de PDM's te beschadigen. Om vervolgens een stofvrij oppervlak te behouden, plaatst u doorzichtige tape over de microkanalen die in reliëf in de PDM's zijn aangebracht.

Gebruik vervolgens een gemonteerde guillotine of een scheermesje om de PDM's in platen te snijden zoals aangegeven door het ontwerp. Wanneer u de laterale opening van de PDM-plaat snijdt die wordt gebruikt voor het bacterie-schimmelinteractieapparaat of BFI-apparaat, moet u ervoor zorgen dat de microkanalen volledig open zijn. Voor PDM-platen die worden gebruikt bij de assemblage van het schimmel-schimmelinteractieapparaat of FFI, moet elke hoek echter worden bijgesneden zodat deze in een petrischaal met glazen bodem past.

Gebruik vervolgens een precisiesnijder om inlaat- of uitlaatgaten te ponsen volgens het ontwerp van het apparaat. Dompel vervolgens de PDM-platen onder in een 0,5 molaire natriumhydroxideoplossing. Spoel de platen af in steriel dubbel gedestilleerd water voordat u ze overbrengt in een 70% ethanoloplossing.

Nadat u de ethanol hebt verwijderd en de platen opnieuw hebt gespoeld met dubbel gedestilleerd steriel water, dompelt u de platen onder in steriel dubbel gedestilleerd water en soniceert u gedurende vijf minuten, verwijdert u vervolgens de PDM-plaat uit het water, droogt u ze met gecomprimeerde gefilterde lucht en plaatst u ze in een steriele vierkante petrischaal. Incubeer vervolgens de petrischaal met PDM's in een oven op 70 graden Celsius gedurende een uur. Zodra de platen zijn afgekoeld in een stofvrije omgeving, verwijdert u stof van hun oppervlak met behulp van tape en perslucht.

Om de oppervlakken van de PDM-platen en petrischalen met glazen bodem te activeren, die vervolgens aan elkaar worden gebonden, plaatst u ze in een plasmareiniger met de te activeren oppervlakken naar boven gericht. Nadat u de PDM-plaat in de petrischalen uit de plasmareiniger hebt verwijderd, hecht u ze voorzichtig door de geactiveerde oppervlakken in hoekgetrouw contact met elkaar te plaatsen. Verlijm BFI- en FFI PDM-platen met petrischalen van respectievelijk 35 millimeter en 55 millimeter diameters, voor het controleren van de succesvolle verlijming, probeer het PDM-lab met een pincet van zijn petrischaal te trekken.

Visualiseer het apparaat zorgvuldig met het oog of door generieke microscopie om ervoor te zorgen dat de inentingsinlaten of microkanalen niet instorten. Voor waterverzadigde of voedselrijke omstandigheden pipet u 100 microliter van de gewenste oplossing om BFI-apparaten onmiddellijk na het verlijmen te vullen. Voeg voor FFI-apparaten 30 microliter van het medium toe aan elke inlaat.

Voeg ten slotte 100 tot 200 microliter steriel dubbel gedestilleerd water toe aan de petrischaal om de luchtvochtigheid op peil te houden. Voor onverzadigde wateromstandigheden voegt u echter gewoon 100 tot 200 microliter steriel dubbel gedestilleerd water toe aan de petrischaal om de luchtvochtigheid te handhaven. Voor schimmelinenting, in een laminaire stromingskap, met behulp van een gesteriliseerde kurkboorder, verwijder een agarplug uit een kolonie aan de rand van een drie dagen oude cultuur, om ervoor te zorgen dat het groeiende hyphal-front intact blijft.

Breng vervolgens de agarplug in de schimmelinlaat van het BFI- en / of FFI-apparaat met de myceliumzijde naar beneden in de hyphal-voorkant gericht op de microkanaalopeningen om hyphale infiltratie van de kanalen aan te moedigen. Voor het FFI-apparaat, introduceer een andere agarplug met een tweede schimmelsoort in de tegenovergestelde inlaat. Sluit vervolgens de petrischaal af met een transparante film en incubeer bij 25 tot 28 graden Celsius in het donker totdat u in beeld wordt gebracht.

Voor bacteriële inenting, na het verwijderen van het BFI-apparaat uit de incubator, pipet u 10 microliter van een bacteriële suspensie in de bacteriële inlaat in een steriele omgeving. Zodra de petrischaal is verzegeld met een transparante film, bewaart u het apparaat rechtop bij 25 graden Celsius in het donker totdat de beeldvorming begint. Met behulp van dit protocol kon de interactie tussen de schimmel Coprinopsis cinerea en de bacterie Bacillus subtilis met succes worden gevisualiseerd.

Er werd waargenomen dat in aanwezigheid van de bacterie de groeisnelheid van de schimmel drastisch begon af te nemen na ongeveer vijf uur co-inenting. Bovendien hadden de schimmeldraden geassocieerd met de bacteriën een dun en transparant uiterlijk. Timelapse fluorescentiemicroscopie onthulde ook schimmeldraden collaps na vijf uur co-collulatie met Bacillus subtilis.

Vanaf zes uur begon echter ook de bacteriepopulatie af te nemen. Visualisatie van schimmel-schimmelinteracties toonde aan dat Fusarium graminearum de groei van Trichoderma rossicum sterk remde, wat duidelijk was met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit protocol onthulde verder significante morfologische veranderingen in de schimmel Verticillium longisporum in de aanwezigheid van bacteriën Pseudomonas synxantha en Pseudomonas fluorescens.

De hoge resolutie dynamische beeldvormingstechniek die in de studie werd gebruikt, onthulde ook septavorming in Fusarium graminearum in aanwezigheid van de schimmel Clonostachys rosea. Fluorescentielabeling bood de dynamische kwantificering van Clonostachys rosea hyphal proliferatie in het FFI-apparaat. Deze apparaten kunnen door de gebruiker worden aangepast en aangepast om verschillende soorten van belang op te nemen en hun specifieke experimentele vragen over microbiële interacties van schimmels aan te pakken.

Zowel de BFI- als de FFI-apparaten hebben wetenschappelijke grenzen verlegd en onthulden hoe schimmels verdedigingssignalen en voedingsstoffen verspreiden bij aanvallen door schimmels, virussen, nematoden en onderzoeken naar bacteriële verspreiding mogelijk maken.