Name: Experimenteel model om de resolutie van longontsteking te evalueren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer een reproduceerbaar pneumoniemodel bij muizen om acute longbeschadiging en herstel te bestuderen. Deze methode maakt evaluatie van therapeutische strategieën voor infectieziekten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door NIH-subsidie R01 HL131812 en R01HL163881.

Alle dierprotocollen die in deze studie worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) van de Johns Hopkins University, School of Medicine voor het dierprotocol MO21M160. Bovendien werden de experimenten uitgevoerd volgens de institutionele, staats- en federale regelgeving voor dieronderzoek.
LET OP: De replicatie van alle hieronder beschreven protocollen moet worden uitgevoerd in een kast van bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2), volgens alle institutionele BSL-2-richtlijnen onder de bioveiligheidskast.
1. Plateren van bacterievoorraden uit commerciële lussen
OPMERKING: Dit protocol kan worden gebruikt voor het kweken van bacterievoorraden voor Spn (ATCC 49619) en Kpn (ATCC 43816), te beginnen met de culti-loops die zijn verkregen van de leverancier (zie Materiaaltabel voor details).
<ol><li>Verwarm een agarplaat van 5% schapenbloed gedurende 15 minuten op 37 °C in een couveuse. Hiervoor kan een celincubator worden gebruikt.</li>
	<li>Verwijder onder de kap het omhulsel van de bacteriële inoculatielus en spreid het voorzichtig uit, strepen in de agarplaat, volgens een zigzagpatroon. Herhaal deze stap met een aparte plaat als duplicaat. Er kunnen maximaal vijf platen met dezelfde lus worden gestreept.</li>
	<li>Laat de platen een nacht incuberen bij 37 °C voor een optimale bacteriegroei. Passage van de bacteriën dagelijks gedurende 3 dagen. Verwarm de bloedagarplaten gedurende 15 minuten op 37 °C, neem tussen de 15 en 20 kolonies van de eerste agarplaat met behulp van een wegwerpinoculatielus en verdeel ze over een nieuwe, voorverwarmde agarplaat. Label de plaat op de juiste manier.</li>
</ol>2. Bacteriegroei en opslag voor toekomstig gebruik
<ol><li>Pak na 3 dagen maximaal 30 kolonies van de bloedagarplaat met een streeplus en plaats deze rechtstreeks in een kolf van 250 ml met Todd Hewitt-bouillon (TH-bouillon). Incubeer bij 37 °C, schudden bij 250 tpm, met 5% CO2 gedurende ongeveer 4 uur.</li>
	<li>Neem elke 15 minuten aliquots om de OD620nm te meten totdat deze 0,3 bereikt, wat overeenkomt met ongeveer 3 x 108 kolonievormende eenheden (CFU) per ml.</li>
	<li>Doe 1 ml van de nieuwe bacteriebouillon onmiddellijk in cryogene injectieflacons van 2 ml. Vries de vers gealiquoteerde flacons snel in vloeibare stikstof gedurende 5 minuten in. Bewaar aliquots bacteriën in een vriezer van -80 °C (injectieflacons kunnen tot 6-8 maanden worden gebruikt voordat ze hun kracht verliezen).</li>
	<li>Na 7 dagen invriezen kunnen de aliquots worden gebruikt voor dierstudies. Bepaal daarom de nieuwe concentratie van de bacteriën.</li>
</ol>3. Bacteriën ontdooien voor intratracheale instillatie
<ol><li>Verwarm een bloedagarplaat gedurende 10 minuten op 37 °C in een shaker. Neem een van de nieuwe voorraadflesjes uit de vriezer en ontdooi deze door deze zachtjes te schudden in een waterbad van 37 °C gedurende ongeveer 2 min. Raak de O-ring of dop niet aan met het warme water.</li>
	<li>Plaat op een bloedagarplaat om de bacteriekolonies handmatig te tellen. Voer een verdunning van 1 x 10-6 uit en plaats 200 μL van de laatste verdunning in een voorverwarmde bloedagarplaat. Doe dit in tweevouden.</li>
	<li>Incubeer de platen een nacht bij 37 °C voor een optimale groei van de bacteriën. Pas de volgende dag de volgende formule toe om de nieuwe bacterieconcentratie te bepalen: CFU/ml = (aantal kolonies x verdunningsfactor) / volume van de geplateerde bouillon</li>
</ol>4. Intratracheale instillatie van levende bacteriën
OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd om intratracheaal een volume van 50 μl in te druppelen. Bacterievoorraden kunnen tot 6-9 maanden worden bewaard. Om ervoor te zorgen dat de bacteriële CFU in elke injectieflacon aanwezig is, moet u ervoor zorgen dat deze voor elk experiment wordt geplateerd, de CFU van de bacteriële voorraad berekent zoals hierboven beschreven en TH-bouillon gebruikt voor latere verdunningen.
LET OP: Voer onder de bioveiligheidskast een overlevingsprocedure voor knaagdieren uit met behulp van steriele chirurgische instrumenten.
<ol><li>Verdoof de muis door intraperitoneaal 100 mg/kg ketamine en 2,5 mg/kg acetylpromazine te injecteren. Herhaal dit voor het aantal muizen dat per keer wordt geïnjecteerd. OPMERKING: Muizen kunnen worden blootgesteld aan isofluraan om het hanteren van dieren te vergemakkelijken. Een ervaren verzorger die in staat is om intraperitoneale anesthetica te injecteren zonder noemenswaardig dierenleed te veroorzaken, kan blootstelling aan isofluraan echter vermijden. Het aantal muizen dat moet worden geïnjecteerd, is afhankelijk van de expertise van de chirurg.</li>
	<li>Nadat alle muizen onder de juiste narcose zijn, bevestigt u de anesthesie door in de staart te knijpen. Plaats de verdoofde muis op een schoon en gesteriliseerd oppervlak, hang het dier aan de snijtanden en plak de voorpoten voorzichtig vast (Figuur 1A). OPMERKING: Om het welzijn van het dier te garanderen, moet u het hoornvlies smeren bij alle verdoofde dieren. Carboxymethylcellulose oogdruppels kunnen worden gebruikt, waarbij één druppel per oog wordt aangebracht.</li>
	<li>Scheer de nek en desinfecteer het gebied met chloorhexidine en 70% alcohol. Maak met een chirurgische schaar een oppervlakkige incisie van 1 cm in de middellijn van de nek om de luchtpijp te visualiseren (Figuur 1B). Een kleine incisie zou voldoende moeten zijn, maar als er een overvloed aan vetweefsel wordt gezien, ontleed het vetweefsel dan voorzichtig verticaal om de luchtpijp te visualiseren. OPMERKING: Gebruik steriele handschoenen en steriele instrumenten via de techniek met alleen tips. Het risico op infectie is minimaal als de procedure onder steriele omstandigheden wordt uitgevoerd.</li>
	<li>Gebruik een pincet om elke muis te intuberen. Trek de tong voorzichtig naar buiten en breng een angiokatheter van 20 G door de mond, waarbij de katheter in de luchtpijp wordt gebracht. Oefen lichte druk uit op de luchtpijp om de intubatie te vergemakkelijken. OPMERKING: Omdat de luchtpijp zich aan de voorkant van het muislichaam bevindt, moet u de punt van de katheter lichtjes buigen, omdat dit zal helpen om de hoek te krijgen om de muis met succes te intuberen. De incisie in de nek wordt voornamelijk uitgevoerd voor visualisatiedoeleinden; Als alternatief kan de operator de luchtpijp blindelings intuberen.</li>
	<li>Sluit de muis na intubatie aan op een gasmasker om de intubatie te bevestigen. De reguliere ventilatorparameters die in deze procedure worden gebruikt, zijn 200 μL slagvolume en 200 slagen per minuut. Draai de ventilatorsnelheid kort omhoog en/of omlaag voor een snelle en eenvoudige bevestiging.</li>
	<li>Na bevestiging van de intubatie koppelt u de muis los van het gasmasker en druppelt u voorzichtig 50 μl van het bacteriële agens in via de angiokatheter met behulp van een 200 μl pipetgel-laadtip. Injecteer voor controlemuizen 50 μL steriele TH-bouillon.</li>
	<li>Nadat u het bacteriële agens hebt ingedruppeld, sluit u de muis opnieuw aan op het gasmasker om de ademhaling weer op gang te brengen. Laat de muis 30-60 s op het gasmasker zitten. Nadat je alle muizen hebt geïnjecteerd, houd je hun ademhaling in de gaten. Als er een langzaam ademhalingspatroon is, sluit u de muizen weer aan op het gasmasker.</li>
	<li>Sluit de incisie door een klein druppeltje lijm op de huid aan te brengen. Breng de huidplooien samen en oefen lichte druk uit totdat de lijm droogt.</li>
	<li>Leg de muizen op een verwarmingskussen voor herstel en houd ze nauwlettend in de gaten totdat ze weer voldoende bij bewustzijn zijn. Breng de muizen terug in de kooi zodra ze volledig hersteld zijn. Voor postoperatieve pijn-/angstbeheersing kunnen de muizen worden behandeld met buprenorfine, met een dosis van 0,05-0,1 mg/kg subcutaan (SC). OPMERKING: Dieren met een gewichtsverlies van meer dan 20% of die na de procedure aanzienlijk leed ervaren, zoals lethargie, een onvermogen om bij water of voedsel te komen, moeizame ademhaling, verminderde reactie op externe stimuli of verminderde mentale alertheid, moeten worden geëuthanaseerd.</li>
</ol>5. Bronchoalveolaire lavage en longoogst
<ol><li>Euthanaseer de muis door hem in een gesloten container te plaatsen die 5% isofluraan bevat. Ga door met blootstelling aan isofluraan gedurende 1 minuut nadat de muis is gestopt met ademen. Voer thoracotomie uit om euthanasie te bevestigen. OPMERKING: Bevestig euthanasie door visueel en lichamelijk onderzoek. Het hart moet gestopt zijn met kloppen en de muizen ademden niet. Slijmvliezen moeten wit of bleek zijn.</li>
	<li>Leg de muis in rugligging op een schone operatieplank en hang hem aan de snijtanden. Spuit de muizenhuid in met 70% ethanol. Maak met een chirurgische schaar een kleine oppervlakkige incisie in de nek van de middellijn om de luchtpijp van de muis te visualiseren.</li>
	<li>Draai de luchtpijp af met een katheter van 20 G. Voeg voorzichtig 1 ml calciumvrije fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) intratracheaal toe met behulp van een spuit van 1 ml. Laat volledige longexpansie toe en zuig de vloeistof vervolgens op met dezelfde spuit. Herhaal deze stap voor een totaal van 2 ml.</li>
	<li>Breng de BAL over in een aliquot van 2 ml. Voer deze stap twee keer uit voor een eindvolume van 2 ml. Spoel de longen niet met meer dan 1 ml per keer, vanwege het hoge risico op alveolaire ruimteverstoring.</li>
	<li>Open de borstholte en leg de long, het hart en de luchtpijp bloot met een schaar en een tang. Ontleed het middenrif voorzichtig en verwijder de ribbenkast. Zorg ervoor dat het longweefsel niet bekneld raakt.</li>
	<li>Doorsnijd de abdominale aorta om bloedverbloeding mogelijk te maken. Doordrenk het longweefsel door met een schaar een kleine incisie van ongeveer 2 mm in de rechterventrikel te maken en injecteer 5 ml koude PBS met behulp van een katheter van 20 G. De PBS moet de long doordringen. Als een adequate perfusie wordt uitgevoerd, wordt het longweefsel witbleek en verlaat de PBS het intravasculaire compartiment via de abdominale aorta.</li>
	<li>Haal voorzichtig de longen eruit en ontleed ze uit de luchtpijp om histologie of verdere verwerking tot eencellige suspensie uit te voeren.</li>
	<li>Als u voor histologie wordt verwerkt, breng dan voorzichtig een katheter van 20 G in om de longen op te blazen tot 25 cm H2O met formaline-oplossing (neutraal gebufferd 10%). Zodra de longen zijn geïnstiketteerd, passeert u een 3.0 hechtdraad van ongeveer 5 cm lang onder de luchtpijp en bindt u deze twee keer stevig vast om ervoor te zorgen dat de formaline in het longweefsel blijft. Ontleed voorzichtig de long van de rest van de weefsels en plaats deze in een kegelvormige buis van 15 ml met 10 ml formaline-oplossing.</li>
</ol>6. Bronchoalveolaire lavage verwerking
<ol><li>Centrifugeer de BAL bij 500 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Verwijder het celvrije supernatans in een aparte tube en bewaar bij -80 °C. OPMERKING: Verdere analyse kan worden uitgevoerd in de BAL-supernatant, inclusief eiwitkwantificering (bijv. BCA-test13) of meting van specifieke biomarkers of cytokines (ELISA-assays en meervoudige assays met platforms zoals MSD en Luminex).</li>
	<li>Lyseer de rode bloedcellen door 100 μL lyseerbuffer toe te voegen gedurende 1 minuut. Neutraliseer de lyseerreactie door 1 ml PBS toe te voegen. Centrifugeer de BAL bij 500 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in PBS (100-300 μL; op basis van de grootte van de celkorrel). Voer een celtelling uit met 0,4% trypan blauwe vlek door handmatige of geautomatiseerde celtelling. Gebruik de resterende pellet voor flowcytometriekleuring en/of cryopreservatie (door resuspendatie in cryoconserveringsoplossing) in vloeibare stikstof voor verder onderzoek.</li>
</ol>7. Longverwerking voor eencellige suspensie
<ol><li>Ontleed de long voorzichtig van de rest van de weefsels en plaats deze in een conische buis van 15 ml met 5 ml koude PBS. Haal de long uit PBS en droog deze af met keukenpapier.</li>
	<li>Bereid een spijsverteringscocktail door 1 mg DNase en 5 mg collagenase toe te voegen aan 1 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met een laag glucosegehalte. Breng de long over naar een C-tube met 1 ml spijsverteringscocktail.</li>
	<li>Breng de C-buis over naar de weefseldissociator en volg het gestandaardiseerde protocol voor het verwerken van longweefsel14.</li>
	<li>Voeg 10 ml koude PBS toe aan de C-tube en meng goed. Filtreer de eencellige suspensie met behulp van een celzeef van 70 μm bovenop een conische buis van 50 ml. Voer de filtratie twee keer uit.</li>
	<li>Centrifugeer de suspensie bij 500 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Decanteer het supernatans voorzichtig en voeg 1 ml lysingbuffer toe gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Voeg 10 ml koude PBS toe om de lyseringsreactie te stoppen en het overtollige te verwijderen.</li>
	<li>Centrifugeer de suspensie bij 500 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Decanteer het supernatans voorzichtig en voeg 10 ml koude PBS toe.</li>
	<li>Voer een celtelling uit met trypan blauwe vlek door handmatige of geautomatiseerde celtelling. Gebruik een celpellet voor flowcytometriekleuring en/of cryopreserve in vloeibare stikstof voor verder onderzoek.</li>
</ol>

<ol><li>Bellani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+patterns+of+care%2C+and+mortality+for+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome+in+intensive+care+units+in+50+countries%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries.</a> JAMA. 315 (8), 788-800 (2016).</li>
<li>Hariri, L., Hardin, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covid-19%2C+angiogenesis%2C+and+ARDS+endotypes%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Covid-19, angiogenesis, and ARDS endotypes.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (2), 182-183 (2020).</li>
<li>Ferguson, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Berlin+definition+of+ARDS%3A+an+expanded+rationale%2C+justification%2C+and+supplementary+material%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Berlin definition of ARDS: an expanded rationale, justification, and supplementary material.</a> Intensive Care Medicine. 38 (10), 1573-1582 (2012).</li>
<li>Tomashefski Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+pathology+of+the+adult+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Chest+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pulmonary pathology of the adult respiratory distress syndrome.</a> Clinics in Chest Medicine. 11 (4), 593-619 (1990).</li>
<li>Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cytokines+and+ARDS%3A+Roger+S.+Mitchell+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Lung cytokines and ARDS: Roger S. Mitchell lecture.</a> Chest. 116 (1 Suppl), 2S-8S (1999).</li>
<li>Colletti, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+necrosis+factor-alpha+in+the+pathophysiologic+alterations+after+hepatic+ischemia%2Freperfusion+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Role of tumor necrosis factor-alpha in the pathophysiologic alterations after hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat.</a> The Journal of Clinical Investigation. 85 (6), 1936-1943 (1990).</li>
<li>Donnelly, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+mortality+rates+and+decreased+concentrations+of+interleukin-10+and+interleukin-1+receptor+antagonist+in+the+lung+fluids+of+patients+with+the+adult+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The association between mortality rates and decreased concentrations of interleukin-10 and interleukin-1 receptor antagonist in the lung fluids of patients with the adult respiratory distress syndrome.</a> Annals of Internal Medicine. 125 (3), 191-196 (1996).</li>
<li>Miller, E. J., Cohen, A. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+interleukin-8+concentrations+in+the+pulmonary+edema+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome+from+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased interleukin-8 concentrations in the pulmonary edema fluid of patients with acute respiratory distress syndrome from sepsis.</a> Critical Care Medicine. 24 (9), 1448-1454 (1996).</li>
<li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report%3A+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (5), 725-738 (2011).</li>
<li>Kulkarni, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals%3A+an+official+American+Thoracic+Society+Workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Update on the features and measurements of experimental acute lung injury in animals: an official American Thoracic Society Workshop report.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), e1-e14 (2022).</li>
<li>Borsa, N., Pasquale, M. D., Restrepo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animal models of pneumococcal pneumonia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4220(2019).</li>
<li>Rubins, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+pneumolysin+in+the+early+pathogenesis+of+murine+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Dual function of pneumolysin in the early pathogenesis of murine pneumococcal pneumonia.</a> The Journal of Clinical Investigation. 95 (1), 142-150 (1995).</li>
<li>Thermo Scientific, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pierce+BCA+Protein+Assay+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pierce BCA Protein Assay Kit.</a> , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23225 Forthcoming.</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1266(2009).</li>
<li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+an+official+American+Thoracic+Society+Workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. an official American Thoracic Society Workshop report.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).</li>
<li>Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+acute+respiratory+distress+syndrome%3A+a+review+of+analytical+approaches%2C+pathologic+features%2C+and+common+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of acute respiratory distress syndrome: a review of analytical approaches, pathologic features, and common measurements.</a> Toxicologic Pathology. 43 (8), 1074-1092 (2015).</li>
<li>Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Pneumonia.</a> Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 25(2021).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+resolves+pneumonia+via+ER%CE%B2+in+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Estradiol resolves pneumonia via ERβ in regulatory T cells.</a> JCI Insight. 6 (3), e133251(2021).</li>
<li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resolution+of+experimental+ARDS+through+IL-4-mediated+lung+macrophage+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced resolution of experimental ARDS through IL-4-mediated lung macrophage reprogramming.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (8), L733-L746 (2016).</li>
<li>D'Alessio, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+acute+lung+injury+and+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of acute lung injury and ARDS.</a> Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).</li>
<li>Gotts, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+model+of+pneumococcal+pneumonia%2C+ARDS%2C+and+nonpulmonary+organ+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), L717-L736 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Experimentele muizenmodellen van PNA bieden een platform om de cellulaire en moleculaire mechanismen te evalueren die ten grondslag liggen aan letsel en resolutie van ARDS. De pathofysiologische componenten die kunnen worden geëvalueerd, zijn onder meer vroege ontstekingsroutes, bacteriële opruiming, dynamische veranderingen in het immuunlandschap, resolutie van ontstekingen, fibroproliferatie en epitheel- en vasculair herstel16. Er moet echter rekening worden gehouden met verschillende aspecten bij het plannen van het repliceren van dit model van door longontsteking veroorzaakt longletsel, waaronder leeftijd, geslacht, muizenstam, intrinsieke gastheerfactoren (bijv. immuungecompromitteerde toestand), de specifieke ziekteverwekker en bacteriële belasting die wordt gebruikt, en de ervaring van het personeel dat de procedure uitvoert.
PNA is een van de belangrijkste oorzaken van ARDS. We hebben ervoor gekozen om live Spn en Kpn te gebruiken, die respectievelijk veel voorkomende oorzaken zijn van door de gemeenschap en het ziekenhuis verworven PNA bij mensen17. We stellen voor om bacteriemodellen van PNA te optimaliseren door doses levende bacteriën te titreren om het gewenste mortaliteits- en letselresolutieprofiel te bereiken dat het beste past bij de hypothese van de onderzoeker. We hebben een intratracheale bacterie-inoculatie van 3 x 106 CFU voor Spn en 200 CFU voor Kpn bij muizen geoptimaliseerd, wat alveolaire ontsteking, verstoring van de alveolocapillaire barrière en orgaandisfunctie veroorzaakte (Figuur 2). Bacteriële batches uit verschillende bronnen of zelfs in dubbele lussen kunnen echter verschillende gradaties van ontsteking en letsel vertonen, zelfs bij gebruik van dezelfde stam en CFU.
Om de resultaten in dit manuscript te repliceren, moeten onderzoekers daarom beginnen met de hier beschreven bacterieconcentratie; Het kan echter nodig zijn de dosis te verhogen of te verlagen om een vergelijkbaar modelprofiel te verkrijgen. Daarom moet elke nieuwe batch bacteriën die wordt gebruikt, worden geoptimaliseerd voor het mogelijke effect op het oplossen van verwondingen. We presenteren een robuust model van PNA met twee verschillende resolutie-uitkomsten, een zelfoplossend (Spn) en een ander een langzaam/niet-oplossend (Kpn) dat kan dienen als platform voor onderzoekers om immunologische mechanismen te evalueren en therapeutische interventies te testen, met name bij of na piekinfectie (bijv. 2 dagen na infectie).
Leeftijd, geslacht, spanning en genetische factoren zijn van invloed op de kinetiek van de patronen voor het oplossen van letsels16. Geslacht zorgt bijvoorbeeld voor een snellere resolutie bij vrouwen in vergelijking met mannen18; Daarom leidt een toename van de bacteriële belasting tot verhoogde mortaliteit en vertraagde resolutie bij mannen in vergelijking met vrouwen. Veroudering is een andere factor waarmee rekening moet worden gehouden bij het titreren van de CFU van gebruikte bacteriën. Ouder wordende muizen vertoonden 100% mortaliteit wanneer we de gespecificeerde Spl-dosis gebruikten (hier niet weergegeven). Jonge muizen worden het vaakst gebruikt in de pneumokokken PNA-modellen (variërend van 6 tot 14 weken), terwijl oudere muizen (19-26 maanden oud) een veranderde immuunrespons vertonen en worden gebruikt om de rol van veroudering bij PNA11 te onderzoeken. We moesten de kve verlagen tot 300% om overleving te bereiken bij ouder wordende dieren (hier niet weergegeven). Mannelijke C57BL/6-muizen (8-12 weken oud) werden in deze studie gebruikt en werden gedurende 6 tot 10 dagen na infectie gevolgd. Er zijn ook significante verschillen in gevoeligheid te vinden tussen stammen; ingeteelde stammen zoals BALB/C en C57BL6/J hebben verschillende reacties op infectie11,19.
Directe inoculatie van bacteriën intratracheaal zorgt voor een nauwkeurigere afgifte van het inoculum (tot 99%) in de longen12, wat een alternatief vormt voor minder virulente serotypen en de aerosolisatie van bacteriën vermindert11. Er kan echter worden gesteld dat het een invasieve procedure is. Intubatie kan een uitdaging zijn, vereist systemische anesthesie en kan leiden tot tracheaal trauma met daaropvolgend luchtwegoedeem en stridor. Muizen kunnen een vasovagale reflex ontwikkelen die leidt tot apneu, waarvoor het nodig is om een kleine muisventilator te hebben om indien nodig extra beademingsondersteuning te bieden. De expertise van de chirurg die de procedure uitvoert, is een cruciaal onderdeel om een succesvolle intubatie te garanderen11. In onze studie hoefden geen muizen te worden geëuthanaseerd vanwege de juiste pijnbestrijding en niet meer dan 20% verlies van lichaamsgewicht. Er werden geen tekenen van pijn en angst gezien, zoals lethargie, een onvermogen om water of voedsel te bereiken, moeizame ademhaling of verminderde mentale alertheid. Alternatieve methoden voor directe bacteriële afgifte aan de longen zijn orofaryngeale aspiratie, hoewel het verdwijnen van longbeschadiging sneller lijkt op te treden en sommige bacteriën in de maag en het maagdarmkanaal kunnen eindigen20.
Preklinische modellen van PNA stellen onderzoekers in staat om het immuunlandschap te evalueren. Bronchoalveolaire en interstitiële compartimenten kunnen worden beoordeeld op dynamische veranderingen in immuuncellen16. Bovendien kunnen cellen ex vivo worden gekweekt en gestimuleerd om hun specifieke productie van cytokinen en chemokinen te bepalen. Hier richten we ons op het verkennen van het immuuncellandschap in de long en BAL door gebruik te maken van meerkleurige flowcytometrie. Single cell RNA-sequencing kan ook worden uitgevoerd om de celspecifieke transcriptomische handtekeningen in verschillende stadia van letselresolutie te begrijpen.
PNA-ARDS-modellen genereren systemische effecten die vroeg kunnen worden gedetecteerd door het lichaamsgewicht tijdens het verloop van de ziekte te meten10. Hoewel we de systemische effecten van ARDS niet direct meten, kan orgaandisfunctie ook worden beoordeeld door bloedmeting van chemische profielen en door verschillende weefsels zoals milt, nieren en lever te oogsten voor histologie. Systemische effecten van pneumokokken PNA-ARDS zijn eerder beschreven door andere groepen die dezelfde bacteriestam21 gebruiken.
Hier wordt een model van experimentele PNA beschreven dat lijkt op enkele van de belangrijkste pathofysiologische bevindingen die ten grondslag liggen aan menselijke ARDS. Hoewel er geen ideale modellen zijn die de complexiteit en heterogeniteit van menselijke ARDS9 volledig samenvatten, zijn deze modellen relevant en reproduceerbaar voor het bestuderen van de mechanismen van longbeschadiging en -herstel, en dienen ze ook als een platform voor de identificatie van nieuwe potentiële farmacologische doelen die zich richten op het versnellen van de resolutie van longontsteking en het bevorderen van longherstel.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63925">Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Host infection response graphs; body weight, protein, cell counts vs. days; infection comparison." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2">
to:
<img alt="Body weight and immune cell count graphs; infection time course; statistical analysis; infection study." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2">

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63925">Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia</a>. A figure was updated.

Erratum: Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

Acuut respiratoir distress syndroom (ARDS) blijft een veel voorkomend dodelijk en invaliderend syndroom dat ongeveer 10% van de patiënten op de intensive care (ICU) treft en tot 23% van de personen die mechanische beademing ondergaan, wat leidt tot een sterftecijfer in het ziekenhuis van 35%-46%1. Bovendien heeft de recente COVID-19-pandemie het belang van het bestuderen van ARDS opnieuw benadrukt. COVID-19-positieve gevallen zijn verantwoordelijk voor een toename van de ARDS-mortaliteit, wat de beperking van farmacologische therapieën benadrukt2.
Bij mensen wordt ARDS gekenmerkt door het snelle begin van hypoxemie (PaO2/FiO2 < 300) en bewijs van niet-hydrostatisch bilateraal longoedeem als gevolg van overmatige alveolaire-capillaire permeabiliteit en alveolitis3. Hoewel ARDS traditioneel is beschreven als een patroon van acuut longletsel (ALI) secundair aan een verscheidenheid aan beledigingen, blijft bacteriële en virale longontsteking (PNA) een van de meest voorkomende oorzaken. Er zijn drie belangrijke pathofysiologische stadia beschreven, namelijk de exsudave, proliferatieve en fibrotische stadia, terwijl de twee belangrijkste kardinale kenmerken van ARDS ontregelde ontsteking en alveolocapillaire verstoringzijn4. Tijdens deze processen wordt alveolaire schade veroorzaakt door het vrijkomen van inflammatoire cytokines (bijv. tumornecrosefactor [TNF-α], interleukine [IL-1β, IL-6, IL-8, enz.]), een instroom van neutrofielen en inflammatoire macrofagen en het overstromen van eiwitrijke vloeistof. Uiteindelijk leiden deze gebeurtenissen tot fragmentarische en bilaterale alveolaire schade 5,6,7,8.
Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het begrijpen van vroege longbeschadiging en ontsteking, zijn de mechanismen die ten grondslag liggen aan de resolutie van PNA minder bekend en zouden ze de focus moeten zijn van toekomstig mechanistisch onderzoek. Het belangrijkste doel van dit methodedocument is om onderzoekers te voorzien van een model voor het oplossen van letsel van infectieuze longontsteking dat de belangrijkste pathofysiologische kenmerken van ARDS kan repliceren. We stellen voor dat dit model zal helpen om de biologische mechanismen die ten grondslag liggen aan het oplossen van longontsteking en -herstel beter te begrijpen, en zo te dienen als een platform voor reddingstherapieën.
De belangrijkste fysiopathologische stadia die optreden tijdens ARDS kunnen worden gerepliceerd in preklinische diermodellen van ALI, die een histologisch bewijs van ontstekingsreactie, weefselbeschadiging, fysiologische disfunctie, alveolitis en verandering van de alveolaire-capillaire barrière9 moeten omvatten. Een muismodel dat PNA en ALI induceert, is voordelig vanwege de hoge reproduceerbaarheid, snelle fokkerij en de beschikbaarheid van meerdere tools om mechanistische en moleculaire studies uit te voeren. Er is geen enkel model dat alle kenmerken van menselijke ARDS9 volledig recapituleert.
Modellen van PNA bij muizen maken replicatie mogelijk van de belangrijkste pathofysiologische mechanismen die worden geproduceerd door infectieuze-ARDS bij mensen, zoals het snelle begin, bewijs van weefselbeschadiging in de histologie, stoornissen van de alveolo-capillaire barrière, bewijs van ontstekingsreactie en fysiologische disfunctie terwijl ze een bescheiden mortaliteit veroorzaken10. Infectieuze modellen kunnen worden geïnduceerd door lokale of systemische toediening van de ziekteverwekker, waarbij intranasale, intratracheale en intraveneuze toediening de meest voorkomende toedieningsroutes zijn. De intratracheale route maakt directe inoculatie van het infectieuze agens in de longen mogelijk, waardoor aerosolisatie wordt verminderd en de afgifte wordt geoptimaliseerd11,12.
De methodologie voor een preklinisch muizenmodel van PNA door intratracheale instillatie van levende Streptococcus pneumoniae (Spn) of Klebsiella pneumoniae (Kp) wordt hier beschreven. Deze modellen vertegenwoordigen een goed surrogaat van ARDS geproduceerd door bacteriële PNA, met verschillende voordelen, waaronder: veel voorkomende oorzaken van humane PNA-ARDS (door de gemeenschap en in het ziekenhuis verworven); hoge reproduceerbaarheid; mortaliteit en letsel kunnen gemakkelijk worden getitreerd (modellering van verschillende gradaties van longontsteking) om een robuuste ontstekingsreactie te vertonen, wat leidt tot alveolitis en alveolocapillaire disfunctie; de evaluatie van vroege en late fasen van longbeschadiging en het verdwijnen ervan; en de evaluatie van therapeutische strategieën in verschillende stadia van PNA-ARDS.

<table><tbody><tr><td>1-200 &micro;L Round 0.5 mm Thick Gel-Loading Pipet Tips</td><td>Corning</td><td>4853</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Cryogenic vials</td><td>Corning Incorporated</td><td>431420</td><td>2 mL self standing, round bottom, red cap, polypropylene</td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf&nbsp;Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes</td><td>Fisherscientific</td><td>05-402-24C</td><td>Shape:&nbsp;Round, Length (Metric):&nbsp;38mm, Diameter (Metric) Outer:&nbsp;10mm, Capacity (Metric):&nbsp;2mL</td></tr><tr><td>70 &micro;m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>White, Sterile, Individually Packaged</td></tr><tr><td>96-well Clear Round Bottom</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td>&nbsp;TC-treated Cell Culture Microplate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile</td></tr><tr><td>Acepromizine Maleate Injection, USP 500 mg/50 mL (10mg/mL)</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-604-04</td><td>EACH mL CONTAINS: acepromazine maleate 10 mg, sodium citrate 0.36%, Citric acid 0.075%, benzyl alcohol 1% and water for injection.</td></tr><tr><td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-721</td><td>4 x 100mL</td></tr><tr><td>Anti-mouse I-A/I-E</td><td>Biolegend</td><td>107628</td><td>APC/Cyanine7 anti-mouse I-A/I-E [M5/114.15.2]; Isotype: Rat IgG2b</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BD Trypticase Soy Agar&nbsp;</td><td>BD-Biosciences</td><td>90001-276</td><td>5% Sheep Blood Prepared Media Stacker Plates, BD Diagnostics</td></tr><tr><td>Biotix Disposable Reagent Reservoirs</td><td>Biotix</td><td>89511-194</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD103</td><td>Invitrogen</td><td>509723</td><td>Integrin alpha E) Armenian Hamster anti-Mouse, FITC, Clone: 2E7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Invitrogen</td><td>RM2817</td><td>PE-Texas Red, Clone: M1/70.15, Invitrogen</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td>565872</td><td>Hamster anti-Mouse, APC-R700, Clone: N418, BD Horizon</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Biolegend</td><td>152410</td><td>APC anti-mouse CD19 [1D3/CD19]; Isotype: Rat IgG2a, &kappa;</td></tr><tr><td>CD24</td><td>BD Biosciences</td><td>563450</td><td>Rat anti-Mouse, Brilliant Violet 711, Clone: M1/69</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>563790</td><td>BUV395; Clone: GK1.5</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Biolegend</td><td>103157</td><td>Brilliant Violet 750 anti-mouse CD45 [30-F11]; Isotype: Rat IgG2b, &kappa;;</td></tr><tr><td>CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>612759</td><td>Rat anti-Murine, Brilliant Ultraviolet 737, Clone: 53-6.7</td></tr><tr><td>Cell Counting Slides&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1450017</td><td>For TC20 Cell Counter</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &micro;L Nylon</td><td>Falcon</td><td>198718</td><td>REF 352350</td></tr><tr><td>Collagenase Type1&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Culti-Loop Streptococcus pneumoniae&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>R4609015</td><td>ATCC 4961</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Disposable inoculation loops/needles</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-603</td><td>Color blue; Volume 1 &micro;L</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium)</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>CD16/CD32 Rat anti-Mouse, Unlabeled, Clone: 2.4G2</td></tr><tr><td>Formalin solution</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>HT501640</td><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td></tr><tr><td>Gauze Sponges, Covidien</td><td>Curity</td><td>2146-</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>SN: 4715</td></tr><tr><td>Hema 3 Manual Staining System and Stat Pack</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>23123869</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Liquid Inhalation</td><td>Henry Schein</td><td>1182097</td><td></td></tr><tr><td>IV CATHETER JELCO 20GX1.25"</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc</td><td>405611</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl Injection</td><td>Henry Schein</td><td>1049007</td><td>Ketamine HCl Injection MDV 100mg/mL 10mL 10/Box</td></tr><tr><td>Klebsiella pneumoniae&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>43816</td><td>subsp. pneumoniae (Schroeter) Trevisan</td></tr><tr><td>Loctite 409</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>7257009</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6C</td><td>Biolegend</td><td>128036</td><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6C [HK1.4]; Isotype: Rat IgG2c</td></tr><tr><td>Ly-6G</td><td>BD Biosciences</td><td>740157</td><td>Rat anti-Mouse, Brilliant Violet 510, Clone: 1A8, BD Optibuild</td></tr><tr><td>MiniVent Type 845</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>4694</td><td>D-79232 March (Germany)</td></tr><tr><td>NK-1.1</td><td>BD Biosciences</td><td>553165</td><td>Mouse anti-Mouse, PE, Clone: PK136, BD</td></tr><tr><td>Phase Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>1X without calcium and magnesium,</td></tr><tr><td>Round Bottom</td><td>Sarstedt</td><td>55.476.305</td><td></td></tr><tr><td>Round-Bottom Polystyrene Test Tubes&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>With Cell Strainer Snap Cap, 5mL</td></tr><tr><td>SealRite 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Free of detectable Rnase, DNase, DNA and pyrogens.</td></tr><tr><td>Shandon EZ Single Cytofunnel</td><td>Epredia</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>Siglec-F</td><td>BD Biosciences</td><td>562681</td><td>Anti-Mouse, Brilliant Violet 421, Clone: E50-2440</td></tr><tr><td>Silk Black Braided 30"(75 cm) Sterile, nonabsorbable surgical suture U.S.P.</td><td>Ethicon</td><td>K-83

experimenteel model om de resolutie van longontsteking te evalueren

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) veroorzaakt acuut longletsel, gekenmerkt door snelle alveolaire schade en ernstige hypoxemie. Dit leidt op zijn beurt tot hoge morbiditeit en mortaliteit. Momenteel zijn er geen preklinische modellen die de complexiteit van menselijke ARDS samenvatten. Infectieuze modellen van longontsteking (PNA) kunnen echter de belangrijkste pathofysiologische kenmerken van ARDS repliceren. Hier beschrijven we een model van PNA geïnduceerd door de intratracheale instillatie van levende Streptococcus pneumoniae en Klebsiella pneumoniae in C57BL6 muizen. Om het model te evalueren en te karakteriseren, hebben we na het induceren van letsel seriële metingen uitgevoerd van lichaamsgewicht en bronchoalveolaire lavage (BAL) voor het meten van markers van longletsel. Daarnaast hebben we longen geoogst voor celtelling en differentiëlen, kwantificering van BAL-eiwitten, cytospin, tellingen van bacteriële kolonievormende eenheden en histologie. Ten slotte werd hoogdimensionale flowcytometrie uitgevoerd. We stellen dit model voor als een hulpmiddel om het immuunlandschap te begrijpen tijdens de vroege en late resolutiefasen van longletsel.

De hierboven beschreven procedures maakten het mogelijk om de pathofysiologische mechanismen te modelleren die ten grondslag liggen aan door bacteriële longontsteking veroorzaakt longletsel bij muizen. Om te beginnen met modelleren, werden C57BL/6 wild-type (WT) muizen verkregen van het Jackson Laboratory en gefokt in de dierenfaciliteit van het instituut. Mannelijke WT C57BL/6-muizen, 8 weken oud, ondergingen intratracheale inoculatie van TH-bouillon (controle), 3 x 106 CFU levende Spn of 200 CFU levende Kpn. Na de infectie werden de muizen gedurende 6 en 10 dagen gecontroleerd op respectievelijk Spn en Kpn. Hoewel de geïnfecteerde groepen een lager lichaamsgewicht vertoonden in vergelijking met de niet-geïnfecteerde controlegroep, herstelde de Spng-groep hun lichaamsgewicht in de richting van de uitgangswaarde, terwijl Kpn-geïnfecteerde muizen langzaam herstelden na 6 dagen infectie (Figuur 2A). Tijdens de duur van het onderzoek hoefden geen muizen euthanasie te ondergaan vanwege een lichaamsgewicht van meer dan 20%, en er was geen bewijs van pijn en angst.
We hebben longletsel gemeten over verschillende intervallen. De BAL-eiwitconcentratie en het totale celgetal voor zowel de BAL als de longen waren opmerkelijk hoger in de geïnfecteerde groepen (Figuur 2). Representatieve histologische secties die het ontstekingsproces in beide modellen weergeven, werden verkregen op dag 2, 4 en 6 na inoculatie (Figuur 3), met bewijs van aanhoudende alveolaire ontsteking bij de Kpn-geïnfecteerde muizen (Figuur 4), zelfs op dag 10. Kpn-geïnfecteerde muizen zetten de verwonding voort op dag 10 (Figuur 2 en Figuur 4), terwijl Spn-geïnfecteerde muizen de longontsteking op dag 6 hadden opgelost (Figuur 2 en Figuur 3).
Eencellige suspensies in de longen werden gebruikt om het immuunlandschap te onderscheiden door middel van hoogdimensionale flowcytometrie op dag 6 na infectie in het Ssn-model , met behulp van een 18-kleurenpaneel bij fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Met behulp van t-gedistribueerde stochastische bureninbedding (t-SNE) kunnen algemene verschillen in de samenstelling van immuuncellen worden gevisualiseerd, wat opmerkelijk is voor een verhoogd aantal granulocyten (CD45+, CD11b+, CD24+, MHC-II-), interstitiële macrofagen (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-), monocyten (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-, CD64-), B-cellen (CD45+, CD19+) en T-cellen (CD45+, CD3+), inclusief natural killer-cellen (CD45+, CD3+, NK1.1+), zoals weergegeven in figuur 5. Poortstrategieën worden weergegeven in figuur 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig01.jpg"> Figuur 1: Chirurgische ingreep voor intratracheale instillatie van levende bacteriën. (A) Positie van de muis in het steriele operatiegebied, hangend aan de snijtanden. (B) Incisiegebied en blootstelling aan luchtpijp. (C) Intubatieproces waarbij de katheter van 20 G wordt ingebracht. Figuur gemaakt met Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02v3.jpg"> Figuur 2: Profielen van acuut longletsel (ALI) na modellen voor longontsteking. (A) Lichaamsgewicht in de loop van de tijd ten opzichte van de uitgangswaarde, controle versus Kpn en Spn (n = 4, per groep). (B) Kwantificering van het totale BAL-eiwit door middel van BCA-test (n = 4, per groep). (C) BAL totaal aantal cellen in de controlegroep (n = 3), Kpn (n = 4) en Spn (n = 3). (D) Totaal aantal cellen in de longen in de controlegroep (n = 3), Kpn (n = 4) en Spn (n = 3). (E-G) BAL-celdifferentieel door handmatige histologietelling van de BAL-cytospin in controle (n = 3), Kpn (n = 4) en Spn (n = 3). Statistische tests werden gedaan door individuele t-test, waarbij de niet-geïnfecteerde controle werd vergeleken met de geïnfecteerde groepen. *P < 0,05. De gegevens worden weergegeven met behulp van een standaardfout (SE) voor elk perceel. De y-as is dagen na infectie voor alle panelen. Afkortingen: BAL = bronchoalveolaire lavage; Spn = Streptococcus pneumoniae; Kpn = Klebsiella pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig02v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig03.jpg"> Figuur 3: Histopathologische bevindingen van de longen tijdens Spn-infectie . Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring van histologische secties van een representatieve BAL en longsectie na de intratracheale infectie van Spn en op dag 2, 4 en 6. BAL vergroting = 100x; longvergroting = 10x. Afkortingen: BAL = bronchoalveolaire lavage; Spn = Streptococcus pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig04.jpg"> Figuur 4: Histopathologische bevindingen van de longen tijdens Kpn-infectie . Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring van histologische secties van een representatieve BAL en longsectie na de intratracheale infectie van Kpn op dag 2, 4, 6 en 10. Afbeeldingen tonen een vergroting met een hoog vermogen (schaalbalk = 50 μm). Afkortingen: BAL = bronchoalveolaire lavage; Kpn = Klebsiella pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig05.jpg"> Figuur 5: Immuuncellandschap door veelkleurige flowcytometrie na 6 dagen Spn-infectie . (A) T-gedistribueerde stochastische buurinbedding (t-SNE) werd gebruikt om de immuuncelpopulaties (CD45+) van de long te visualiseren, waarbij de niet-geïnfecteerde controlegroep werd vergeleken met de geïnfecteerde groep. (B) Samenvatting van de immuuncelfrequenties van het totale aantal CD45+-cellen in de long. (C) Totaal celgetal van elke individuele populatie. Statistische vergelijkingen werden gedaan door t-tests tussen de controlegroep en de geïnfecteerde. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. De gegevens worden weergegeven met behulp van een standaardfout (SE) voor elk perceel. Afkortingen: BAL = bronchoalveolaire lavage; Spn = Streptococcus pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig06.jpg"> Figuur 6: Gatingstrategieën voor het identificeren van de subpopulatie van immuuncellen in de longen bij aanvang en na longontsteking. BAL en longcelsuspensie ondergingen kleuring voor veelkleurige flowcytometrie. Puin werd eerst afgeschermd met behulp van SSC-A en FSC-A, en de afzonderlijke cellen werden afgeschermd door twee strategieën (SSC-W vs. SSC-H en FSC-W vs. FSC-H). Levende cellen werden geïdentificeerd met behulp van een levende/dode discriminator versus SSC-A. Daaropvolgende celpopulaties werden geïdentificeerd aan de hand van eerder geïdentificeerde markers 15. Afkorting: BAL = bronchoalveolaire lavage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit manuscript beschrijft de opstelling van een infectieus model van longontsteking bij muizen en de respectieve karakterisering van letselresolutie, samen met methoden voor het kweken van bacteriën en intratracheale instillatie. Een nieuwe benadering met behulp van hoogdimensionale flowcytometrie om het immuunlandschap te evalueren, wordt ook beschreven.

Experimenteel model om de resolutie van longontsteking te evalueren

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to ...

Dit protocol biedt een reproduceerbaar model van longontsteking dat een robuust, acuut longletsel genereert. Andere voordelen van dit model zijn dat het kan worden gebruikt om infectieuze ARDS of acute respiratory distress syndrome bij muizen te reproduceren. Zoals ik al zei, is dit model zeer reproduceerbaar, waarbij de mortaliteit en het letselniveau gemakkelijk kunnen worden getitreerd om vroege en late fasen van acuut longletsel en -oplossing te evalueren, wat dient als een platform om therapeutische strategieën te evalueren.Hoewel dit protocol geen nieuwe benadering biedt voor de diagnose of behandeling van longletsel, is het een betrouwbaar model waarin nieuwe therapieën kunnen worden getest, wat met name nuttig is op gebieden die verband houden met immunologie, longziekten en infectieziekten. Een van de voordelen van deze techniek is de reproduceerbaarheid. Mensen die deze techniek voor de eerste keer uitvoeren, kunnen echter problemen ondervinden bij het intratracheaal inbrengen van de katheter.Dat is de reden waarom mensen die deze techniek leren, idealiter zouden moeten beginnen met oefenen bij geëuthanaseerde dieren. Verwarm om te beginnen een bloedagarplaat gedurende 10 minuten op 37 graden Celsius in een verwarmde shaker of incubator. Neem een nieuwe injectieflacon met bacteriebouillon uit de vriezer en ontdooi deze door zachtjes te roeren in een waterbad van 37 graden Celsius totdat de injectieflacon volledig is ontdooid.Raak de O-ring of dop niet aan met warm water. Om de bacteriekolonies op een plaat handmatig te tellen, voert u een verdunning van 1 keer 10 tot de zesde uit en plaatst u 200 microliter vanaf de laatste verdunning op een voorverwarmde bloedagarplaat. Incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius.Bepaal de volgende dag de nieuwe bacterieconcentratie door de gegeven formule toe te passen. Plaats de verdoofde muis op een schoon en gesteriliseerd oppervlak. Hang de muis aan de snijtanden en plak de voorpoten voorzichtig vast.Scheer de nek en desinfecteer het gebied met chloorhexidine en 70% alcohol. Maak vervolgens met een chirurgische schaar een incisie van één centimeter in de oppervlakkige middellijn van de nek om de luchtpijp te visualiseren. Als er een overvloed aan vetweefsel wordt gezien, ontleed dan voorzichtig het vetweefsel verticaal om de luchtpijp te visualiseren.Trek de tong voorzichtig naar buiten en breng een angiokatheter van 20 gauge door de mond, waarbij de katheter in de luchtpijp wordt gebracht. Oefen lichte druk uit op de luchtpijp om de intubatie te vergemakkelijken. Sluit de muis na intubatie aan op een gasmasker om de intubatie te bevestigen.Stel de ventilatorparameters in op 200 microliter ademvolume en 200 slagen per minuut. Nadat de intubatie is bevestigd, koppelt u de muis los van het gasmasker en druppelt u voorzichtig 50 microliter van het bacteriële agens via de angiokatheter met behulp van een pipet van 200 microliter, een gellaadtip. Sluit de muis na installatie weer aan op het gasmasker om de ademhaling weer op gang te helpen.Laat de muis 30 tot 60 seconden op het gasmasker om de ademhaling te controleren. Als er een langzaam ademhalingspatroon wordt waargenomen, sluit u de muis opnieuw aan op het gasmasker. Sluit de incisie door een druppel lijm op de huid aan te brengen.Breng de huidplooien samen en oefen lichte druk uit totdat de lijm droogt. Leg de geëuthanaseerde muis op een schone operatieplank en hang deze aan de snijtanden. Nadat u de muizenhuid met 70%ethanol met een schaar hebt besproeid, maakt u een kleine, oppervlakkige nekexcisie in de middellijn om de luchtpijp te visualiseren.Draai de luchtpijp af met een katheter van 20 gauge en voeg voorzichtig intratracheaal een milliliter calciumvrije PBS toe met behulp van een spuit van één milliliter. Laat de longen volledig uitzetten en zuig de vloeistof vervolgens op met dezelfde spuit. Herhaal de procedure twee keer voor een totaal van twee milliliter.Breng de bronchoalveolaire lavage, of BAL, over in een aliquot van twee milliliter. Open met een schaar de borstholte om de long, het hart en de luchtpijp bloot te leggen. Ontleed het middenrif voorzichtig en verwijder de ribbenkast, zorg ervoor dat het longweefsel niet bekneld raakt.Doorsnijd de abdominale aorta om bloedverbloeding mogelijk te maken. Doordrenk het longweefsel door met een schaar een kleine incisie van ongeveer één tot twee millimeter in de rechterventrikel te maken en vijf milliliter koude PBS te injecteren met behulp van een katheter van 20 gauge. Bij een succesvolle perfusie wordt het longweefsel wit en bleek en verlaat de PBS het intravasculaire compartiment via de abdominale aorta.Haal vervolgens voorzichtig de long eruit en ontleed deze uit de luchtpijp. Als alternatief, als de long wordt gebruikt voor histologie, breng dan voorzichtig een katheter van 20 gauge in om de longen tot 25 centimeter op te blazen met een formaline-oplossing. Zodra de longen zijn geïnjecteerd, passeert u een 3/O-hechtdraad van ongeveer vijf centimeter lang onder de luchtpijp en bindt u deze twee keer stevig vast om ervoor te zorgen dat de formaline in het longweefsel blijft.Ontleed de long voorzichtig van de rest van de weefsels en plaats deze in een conische buis van 15 milliliter met 10 milliliter formaline-oplossing. Centrifugeer de BAL bij 500 G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten en verwijder het celvrije supernatans in een apart buisje. Lyseer de rode bloedcellen door gedurende één minuut 100 microliter lyseerbuffer toe te voegen.Neutraliseer de lyseerreactie door één milliliter PBS toe te voegen. Centrifugeer de BAL en verwijder het supernatans voordat u de pellet opnieuw suspendeert in 100 tot 300 microliter PBS. Voer vervolgens een celtelling uit met 0,4% trypan blauwe vlek door geautomatiseerde celtelling.Ontleed de long voorzichtig uit de weefsels in een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter koude PBS. Verwijder na dissectie de long uit de PBS en droog deze af met keukenpapier. Ontleed de rechter- en linkerlong van andere weefsels die ook zijn geëxtraheerd, zoals de luchtpijp.Bereid een spijsverteringscocktail zoals beschreven in het tekstmanuscript en breng de long over naar een C-buis met daarin één milliliter spijsverteringscocktail. Breng de buis over naar de weefseldissociator en volg het gestandaardiseerde protocol voor het verwerken van longweefsel. Voeg na dissociatie 10 milliliter koude PBS toe aan de tube en meng goed.Filtreer de eencellige suspensie met behulp van een celzeef van 70 micron bovenop een conische buis van 50 milliliter op ijs. Centrifugeer de suspensie en verwijder het supernatant. Voeg een millimeter lyseerbuffer toe gedurende één minuut bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 10 milliliter koude PBS toe om de lyseerreactie te stoppen en het supernatant te verwijderen. Suspendeer de cellen opnieuw in PBS en voer een celtelling uit met trypan blauwe vlek door geautomatiseerde celtelling. Na door bacteriële longontsteking veroorzaakte longbeschadiging bij muizen vertoonden de geïnfecteerde groepen een lager lichaamsgewicht in vergelijking met de niet-geïnfecteerde controlegroep.De streptococcus pneumoniae- of Spng-groep herstelde hun lichaamsgewicht in de richting van de basislijn, terwijl Klebsiella pneumoniae of Kpn-geïnfecteerde muizen langzaam herstel vertoonden na zes dagen infectie. De BAL-eiwitconcentratie en het totale celgetal voor zowel de BAL als de longen waren duidelijk hoger in de geïnfecteerde groepen. Representatieve histologische secties die het ontstekingsproces in beide modellen weergeven, werden verkregen op dag twee, vier en zes na inoculaties die bewijs vertoonden van aanhoudende alveolaire ontsteking bij de Kpn-geïnfecteerde muizen, zelfs op dag 10.Kpn-geïnfecteerde muizen zetten de verwonding voort op dag 10, terwijl Spn-geïnfecteerde muizen de longontsteking op dag zes hadden opgelost. Immuuncellandschap door veelkleurige flowcytometrie na zes dagen Spn-infectie vertoonde een verhoogd aantal granulocyten, interstitiële macrofagen, monocyten, B-cellen en T-cellen, inclusief natuurlijke killercellen. Tijdens het proberen van deze methode is het inbrengen van de katheter de sleutel tot het krijgen van repliceerbare infecties.Dit is een betrouwbare methode die dient als platform voor het identificeren van doelen voor de studie van acuut longletsel en het oplossen ervan.

experimental-model-to-evaluate-resolution-of-pneumonia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the establishment of lung infection in an immunocompetent rodent model via intubation and installation of bacterial suspensions into lung lobes. This model enables antibacterial efficacy studies in immunocompetent animals.

Intrabronchial Instillation of Streptococcus pneumoniae in Immunocompetent Rodent Models

Streptococcus pneumoniae is de toonaangevende ziekteverwekker waardoor ernstige community-acquired pneumonie en verantwoordelijk voor meer dan 2 miljoen doden wereldwijd. De invloed van bacteriële factoren betrokken bij fitness of virulentie kan worden gevolgd in real-time in een acute muis longontsteking of bacteriëmie model met behulp van bioluminescentie bacteriën.

Na in Real Time de impact van Pneumokokken virulentiefactoren in een acute longontsteking Muis Model Met behulp van Bioluminescent Bacteriën

We hebben een muislongletselmodel ontwikkeld door intra-tracheale injectie van bacteriën Pseudomonas aeruginosa. Dit model bootst longletsel tijdens pneumonie na en is klinisch relevant.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor het modelleren van bacteriële pneumonie bij muizen. Hierin beschrijven we een niet-invasieve, goedkope, snelle werkwijze voor het induceren via aspiratie pneumonie (bijvoorbeeld inhalatie) van een bacterieel inoculum gepipetteerd in de orofarynx. Downstream methoden voor de beoordeling van de pulmonaire aangeboren immuunrespons zijn ook gedetailleerd.

Een niet-invasieve en Technisch Niet-intensieve methode voor Inductie en fenotypering van experimentele bacteriële longontsteking in Muizen

Een methode voor het veroorzaken van longinfecties bij immuungeschikt knaagdieren wordt beschreven. Met vaardigheid kan deze methode snel en eenvoudig worden uitgevoerd om een stabiele infectie te induceren met veel isolaten van S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae en A. baumannii.

Een robuuste Longontsteking Model in Immunocompetente Knaagdieren om Antibacteriële Werkzaamheid Evalueer tegen<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; of<em&gt; A. baumannii</em

Besmettelijke longontsteking is een van de meest voorkomende infecties bij de mens. Een passende in-vivo -model is van cruciaal belang voor het begrijpen van de pathogenese van de ziekte en het testen van de werkzaamheid van roman therapeutics. Met dit model lymfkliertest orofaryngeale aspiratie longontsteking, kan men de pathogenese en nieuwe behandelingen tegen deze dodelijke infecties onderzoeken.

Lymfkliertest orofaryngeale aspiratie Model Ventilator-geassocieerde en ziekenhuizen opgelopen bacteriële longontsteking

Hier presenteren we methoden om secundaire bacteriële pneumonie onderzoeken te verbeteren door een niet-invasieve route van instillatie in de onderste luchtwegen te bieden, gevolgd door pathogeen herstel en transcriptie analyse. Deze procedures zijn reproduceerbaar en kunnen worden uitgevoerd zonder gespecialiseerde apparatuur zoals canules, geleidings draden of glasvezelkabels.

Een nauwkeurig pathogeen lever-en Terugwinningssysteem voor Muriene modellen van secundaire bacteriële pneumonie

Selectieve intra-bronchiale zuur instillatie naar de linker long bij muizen resulteert in unilaterale en zelf beperkte acute longschade die het menselijk acute respiratoir Distress syndroom (ARDS) veroorzaakt door maagzuur aspiratie.

Een model van zelf beperkte acute long letsel door unilaterale intra-bronchiale zuur Instillatie

Dit artikel beschrijft een nieuw muismodel voor de overgang van pneumokokken van een asymptomatische kolonisator naar een ziekteverwekkende ziekteverwekker tijdens virale infectie. Dit model kan gemakkelijk worden aangepast om polymicrobiële en gastheer-pathogeen interacties te bestuderen tijdens de verschillende fasen van ziekteprogressie en tussen verschillende gastheren.

Een muismodel voor de overgang van Streptococcus pneumoniae van kolonisator naar pathogeen bij virale co-infectie vat leeftijdsverergerde ziekte samen

Een experimentele long metastase en CTL immunotherapie muis-model voor de analyse van...

Experimentele metastase en CTL adoptieve overdracht Immunotherapie Muis Model

Leer een reproduceerbaar pneumoniemodel bij muizen om acute longbeschadiging en herstel te bestuderen. Deze methode maakt evaluatie van therapeutische strategieën voor infectieziekten mogelijk.

Experimenteel model om de resolutie van longontsteking te evalueren

Meer video's verkennen