Name: Tijd-opgeloste in vivo meting van neuropeptidedynamica door capacitieve immunoprobe in porcine heart (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Leer tijd-opgeloste meting van neuropeptidedynamica in vivo met een capacitieve immunoprobe in een porcine heart. Deze methode biedt bijna-realtime analyse op discrete locaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Dr. Olu Ajijola (UCLA Cardiac Arrhythmia Center) voor deskundige ondersteuning voor de in vivo experimenten. Dit werk werd ondersteund door NIH U01 EB025138 (JLA, CS).

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de University of California, Los Angeles Animal Research Committee en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8e editie, 2011). Volwassen mannelijke Yorkshire-varkens van ongeveer 75 kg werden gebruikt voor in vivo studies10.
1. Capacitieve immunoprobe fabricage en functionalisatie
<ol><li>Snijd een 25 cm lengte van perfluoroalkoxy (PFA) -gecoate platinadraad (zie Tabel van materialen) en strip ongeveer 5 mm PFA-coating van het ene uiteinde met behulp van een scalpel, waarbij u voorzichtig bent om niet in de platinadraad te snijden.</li>
	<li>Steek het gestripte uiteinde van de platinadraad in een vergulde 1 mm mannelijke connectorpen en krimp de connectorpentanden rond het gestripte uiteinde van de platinadraad met behulp van een naald-neustang (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Soldeer de platinadraad aan de vergulde connectorpen. Zorg ervoor dat u geen overmatige hoeveelheid soldeer gebruikt.</li>
	<li>Bereid dopamine-oplossing door 50 mg dopamine HCl op te lossen in 50 ml 10 mM fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 6,0) door te roeren.</li>
	<li>Zodra de dopamine volledig is opgelost, plaatst u de punt van de platinadraad in het vat met de vers gemaakte dopamine-aangevulde PBS. Steek een gouden connectorpen in een kanaal van het hoofdpodium (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Sluit de AgCl-schijfelektrode (massa-elektrode, zie Materiaaltabel) aan op het grondkanaal in het hoofdbeeld. Plaats de AgCl-schijf in het vat met dopamine-aangevulde PBS en platinadraad; pas alleen op dat u de schijfelektrode onderdompelt en niet de lengte van de draad of het soldeer. Sluit een draadshunt aan op de referentiekanalen van het hoofdpodium voordat u verder gaat.</li>
	<li>Open de interactieve software voor gegevensverzameling (zie Materiaaltabel). Bereid een zaagtand elektrodepositie commando potentiaal protocol voor met de volgende parameters: startpotentiaal = −0,6 V; eindpotentiaal = +0,65 V; scansnelheid = 0,04 V∙s-1; duur van de depositie = 420 s. Begin met het polydopamine-depositieprotocol en zorg ervoor dat alle draden correct zijn aangesloten.</li>
	<li>Verwijder na het voltooien van de polydopamineafzetting de AgCl-gemalen pellet en de punt van de platinadraad uit het vat en zorg ervoor dat u de punt van de platinadraadelektrode niet verstoort. Plaats de punt van de draad in een microbuis met PBS (pH 7,4) gedurende 2-5 minuten terwijl de antilichaamoplossing wordt bereid; zorg ervoor dat de draadpunt geen contact maakt met de zijkanten of onderkant van de microbuis. OPMERKING: Antilichaamoplossing kan worden gemaakt tijdens polydopamineafzetting; de overdracht van de platinadraad van het dopaminebevattende vat naar de microbuis van PBS na polydopamineafzetting mag echter niet worden overgeslagen.</li>
	<li>Bereid de antilichaamoplossing voor. Combineer het antilichaam van belang met PBS (pH 7,4) in een verhouding van 1:20 in een vat van de juiste grootte (bijvoorbeeld een microbuisje). OPMERKING: Het anti-NPY monoklonale antilichaam (zie tabel met materialen) dat hier werd gebruikt, werd aliquoteerd met 1 mg / ml; een voorbeeld van een antilichaampreparaat hier zou 4 μL antilichaam tegen 76 μL PBS zijn.</li>
	<li>Week de polydopamine-gedeponeerde punt van de platina-elektrode minimaal 2 uur in antilichaamoplossing bij kamertemperatuur, zorg er opnieuw voor dat de platinadraadpunt in oplossing wordt gesuspendeerd en niet op het binnenoppervlak van de microbuis rust. OPMERKING: Recente implementatie van deze techniek heeft de voorkeur gegeven aan het gebruik van de platinadraadelektrode onmiddellijk na deze stap in plaats van natte of droge opslag voor later gebruik.</li>
	<li>Spoel na het weken in de antilichaamoplossing de nieuw gefunctionaliseerde capacitieve immunoprobe (CI probe) tip kort in PBS (pH 7,4). De sonde is nu klaar voor gebruik.</li>
</ol>2. Experimentele opzet voor in vitro detectie en meting van peptide
<ol><li>Plaats de functionele punt van de CI-sonde in de stroomkamer en zorg ervoor dat de punt van de elektrode op geen enkele manier wordt verstoord, omdat dit de sensorische punt van de sonde kan beschadigen. OPMERKING: De stroomkamer is gemaakt door siliconenelastomeer (zie tabel met materialen) in een 35 mm kweekschaal te gieten met een langwerpige eivormige ruimtevuller in het midden van de schaal. Na het uitharden wordt de eivormige vorm uit het elastomeer verwijderd. De kamer wordt vervolgens overgoten met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) en heeft een stroomsnelheid van 3 ml / min. Zorg ervoor dat de in- en uitstroom het vloeistofniveau in de kamer zodanig handhaaft dat er geen getijdenwerking van het superfusaat wordt waargenomen. De stroom moet op zijn plaats blijven zolang de CI-sonde in gebruik is.</li>
	<li>Voer voorafgaand aan de eerste experimentele test een TBS-standaardrun uit om de CI-sonde te conditioneren. Stel het volgende commandospanningsprotocol in: positieve stappotentiaal = +100 mV; negatieve stappotentiaal = −5 mV; stapduur = 20 ms; duur van de verwerving = 600 s. OPMERKING: Het is belangrijk om rekening te houden met de evenwichtswerking van de sonde tijdens de eerste fase van het fietscommandopotentieel voorafgaand aan gegevensverzameling.</li>
	<li>Maak een oplossing van het peptide van belang met behulp van dezelfde TBS om de samenstelling van het superfusaat te behouden. Stel een spruitstuksysteem in waarbij het superfusaat kan worden geschakeld tussen TBS en peptide-aangevulde TBS zonder bellen in het slangsysteem of de stroomkamer te introduceren. OPMERKING: Synthetisch varkens NPY-peptide (zie Tabel van materialen) werd gebruikt in deze studie.</li>
	<li>Stel het peptide-sensing data acquisition protocol in met behulp van TBS-standaardparameters (zie stap 2.2.). OPMERKING: In deze implementatie was de duur van elke experimentele test 360 s (120 s TBS, 120 s peptide-aangevulde TBS, 120 s TBS).</li>
</ol>3. Aanpassing van de CI-sonde voor in vivo gebruik
<ol><li>Voorafgaand aan polydopamineafzetting (stap 1.7.), rijg de blootgestelde punt van de platinadraadelektrode door een hypodermische naald van 22 G, waardoor ongeveer 2 mm voorbij de punt van de naald overblijft. Buig met behulp van een tang voorzichtig de punt van de platinadraadelektrode terug, waardoor een "weerhaak" ontstaat die aan het uiteinde van de hypodermische naald hangt.<ol>
<li>Trek de naald voorzichtig uit de prikkeldraadpunt en laat voldoende draad over om in het vat te plaatsen zonder dat de naald in contact komt met de vloeistof. Ga verder met stappen 1.4.-1.11. OPMERKING: Afhankelijk van de in vivo opstelling kan het nodig zijn om een lengte platinadraad langer dan 25 cm door te snijden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voordat u de CI-sonde op het hoofdpodium aansluit, moet u ervoor zorgen dat de volledige elektrische opstelling goed is geaard. Als u dit niet doet, kan dit ongewenste elektrische interferentie veroorzaken tijdens de experimentele opnames.</li>
	<li>Verdoof de dieren na een eerder gepubliceerd rapport10.</li>
	<li>Voer een operatie uit om de regio van belang bloot te leggen. OPMERKING: In deze studie werd een mediane sternotomie uitgevoerd om het hart bloot te leggen. Zie Kluge et al.10 voor meer informatie over dierchirurgie.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de gefunctionaliseerde punt uit de PBS-spoeling (stap 1.11.), stuur de hydodermische naald naar de prikkeldraad C.I.-sonde en implanteer deze voorzichtig in het interessante gebied voordat u de gouden connectorpen in het hoofdpodium steekt. Eenmaal geïmplanteerd, trekt u de hypodermische naald terug en laat u de elektrode op zijn plaats. OPMERKING: Voor dit onderzoek werd de sonde in de middelste zijwand van het linkerventrikelmyocardium10 geplaatst.</li>
	<li>Nadat u de juiste elektrische installatie hebt gegarandeerd, gaat u verder met standaard- en experimentele testprotocollen (stap 2.2. en stap 2.4.).</li>
	<li>Na voltooiing van de experimenten, euthanaseer het dier volgens institutioneel goedgekeurde technieken. OPMERKING: In deze studie worden de dieren geëuthanaseerd onder diepe anesthesie via inductie van ventriculaire fibrillatie10.</li>
</ol>

<ol><li>Chow, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Biomarkers+for+the+prevention%2C+assessment%2C+and+management+of+heart+failure%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).</li>
<li>Goldstein, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenal+responses+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Adrenal responses to stress.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+plasma+neuropeptide-Y+in+coronary+care+unit+patients+with+and+without+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).</li>
<li>Farrell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+modulates+catecholamine+release+into+interstitial+fluid+of+canine+myocardium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).</li>
<li>Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathectomy+and+spinal+cord+stimulation+attenuate+reflex-mediated+norepinephrine+release+during+ischemia+preventing+ventricular+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation.</a> JCI Insight. 4 (23), 131648(2019).</li>
<li>Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+Y+and+sympathetic+control+of+heart+contractility+and+coronary+vascular+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).</li>
<li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+neurocardiology%3A+development%2C+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li>
<li>Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+activation+circumvents+high-dose+beta+blocker+therapy+in+part+through+release+of+neuropeptide+Y%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y.</a> JCI Insight. 5 (11), 135519(2020).</li>
<li>Rigel, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neuropeptides+on+heart+rate+in+dogs%3A+comparison+of+VIP%2C+PHI%2C+NPY%2C+CGRP%2C+and+NT%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT.</a> American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).</li>
<li>Kluge, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+cardiac+neuropeptide+dynamics+by+capacitive+immunoprobe+in+the+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).</li>
<li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitive+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Electroanalysis%22%5BJournal%5D)">Capacitive biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li>
<li>Prodromidis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedimetric+immunosensors-A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Electrochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Impedimetric immunosensors-A review.</a> Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).</li>
<li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318 (5849), 426-430 (2007).</li>
<li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+catecholamines+from+individual+adrenal+medullary+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells.</a> Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).</li>
<li>Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+cyclic+voltammetric+measurements+of+epinephrine+and+norepinephrine+as+a+method+to+measure+secretion+from+single+bovine+adrenal+medullary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells.</a> Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).</li>
<li>Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+vesicular+transmitter+release+from+the+somata+of+substantia+nigra+neurons+in+rat+midbrain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).</li>
<li>Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+splanchnic+nerve+and+chromaffin+cell+stimulation+in+mouse+adrenal+slices+with+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).</li>
<li>Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+recombinant+Ca%28v%293.2%2C+T-type%2C+Ca%282%2B%29+channel+currents+by+CaMKIIgamma%28C%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C).</a> The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).</li>
<li>Chan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+in+vivo+detection+of+myocardial+norepinephrine+levels+in+the+beating+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).</li>
<li>Chow, R. H., von Rüden, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChow%2C+RH+%22Single-Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single-Channel Recording, Second Edition</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 245-275 (1995).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile%2C+high+efficiency+immobilization+of+lipase+enzyme+on+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+via+a+biomimetic+coating%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating.</a> BMC Biotechnology. 11, 63(2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten, financieel of anderszins.

Het huidige protocol beschrijft de productie en het testen van een capacitieve immunoprobe (CI-sonde) die in staat is om biomarkers van belang te detecteren en te meten in zowel in vitro als in vivo omgevingen. Detectie wordt bereikt door de biomarker op de elektrodepunt te vangen. De vanggebeurtenis verandert de capacitieve overgang tussen een capacitieve immunoprobe van platinadraad en de omringende geleidende vloeistofomgeving, gemeten als een verandering in de laadstroom als reactie op een potentiël...

Verschillende chemische methoden voor het detecteren en kwantificeren van biomarkers worden routinematig gebruikt in zowel eiwitchemie als klinische diagnostiek, met name bij kankerdiagnoses en de beoordeling van de progressie van hart- en vaatziekten. Momenteel zijn methoden zoals high-performance vloeistofchromatografie (HPLC), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en massaspectrometrie afhankelijk van monsterverzameling uit het vasculaire compartiment 1,2,3 door bulkvloeistoftrekking of het interstitiële compartiment door microdialyse. Microdialyse maakt gebruik van een semipermeabele membraanbuis van bekende lengte die in een interessant gebied wordt geplaatst. Verzamelvloeistof wordt gedurende enkele minuten door de buis gedrenkt4 om het monster te verzamelen voor analyse5, waardoor de temporele resolutie wordt beperkt. Op deze manier bieden de verzamelde monsters slechts een gemiddelde waarde in de tijd van de lokale micro-omgeving en worden ze beperkt door de perfusiesnelheid en de verzameling van voldoende monstervolume. Bovendien vereisen deze methoden de bundeling van experimentele gegevens en signaalmiddeling; daarom kunnen ze geen rekening houden met variabiliteit tussen proefpersonen. Belangrijk is dat de tijd tussen monsterverzameling en daaropvolgende offline analyse onmiddellijke klinische interventie en therapeutica uitsluit.
In dit protocol wordt het gebruik van een capacitieve immunoprobe biosensor (CI-sonde) voor de tijd-opgeloste elektrische detectie van specifieke bioactieve peptiden beschreven. Neuropeptide Y (NPY), vrijgegeven uit post-ganglionaire sympathische neuronen die de vasculatuur, endocardium, cardiomyocyten en intracardiale ganglia innerveren, is een belangrijke neuromodulerende peptidetransmitter in het cardiovasculaire systeem 6,7,8,9. De hier gepresenteerde methode is ontworpen om NPY te meten en de experimentele haalbaarheid wordt aangetoond in een varkenshartmodel. Deze benadering is echter van toepassing op elk bioactief peptide waarvoor een selectief antilichaam beschikbaar is10. Deze methode is gebaseerd op de capacitieve overgang tussen een platinadraadsonde en de geleidende vloeistof aan de gefunctionaliseerde punt11,12. In deze toepassing werd de interactie gemedieerd door een antilichaam tegen het doelneuropeptide (NPY), dat gebonden was aan de elektrodepunt, waarbij de geleidende vloeistofomgeving werd gekoppeld. Deze functionalisatie werd bereikt door elektrodepositie van reactief polydopamine op de punt van de platinadraadsonde10,13.
Wanneer de antilichaam-gefunctionaliseerde sonde in vivo in een gebied van belang wordt geplaatst, leidt de geëvoceerde endogene NPY-afgifte tot binding aan de vangantistoffen op de sondepunt en wordt de geleidende vloeistof aan het elektrodeoppervlak verplaatst door het NPY-eiwit. Lokale verandering in de elektrische omgeving resulteert in de verplaatsing van hoog-mobiliteit, hoog-diëlektrische vloeistof met een onbeweeglijk, statisch geladen molecuul. Dit verandert de elektrode-vloeistofinterface en dus de capaciteit ervan, die wordt gemeten als een verandering in de laadstroom als reactie op een stapfunctiecommandopotentiaal. Een negatieve "reset" potentiaal wordt onmiddellijk na elke individuele meetcyclus gebruikt om gebonden NPY van het antilichaam af te weren door middel van elektrostatische interactie, waardoor de antilichaambindingsplaatsen worden vrijgemaakt voor volgende meetrondes10. Dit maakt het effectief mogelijk om NPY op een tijdsgebonden manier te meten. De unieke CI-techniek overwint de beperkingen van de hierboven beschreven op microdialyse gebaseerde immunochemische methoden om dynamische biomarkerniveaus van een enkel experiment te meten zonder gegevens te poolen of signaalmiddeling over verschillende experimenten9, waardoor gegevens in bijna realtime worden verstrekt. Bovendien biedt het vermogen om deze methode aan te passen aan elke biomarker van belang waarvoor er een geschikt antilichaam bestaat op een tijdsgeodepareerde en gelokaliseerde schaal een belangrijke technische vooruitgang in immunochemische metingen voor de evaluatie van ziekteprogressie en de begeleiding van therapeutische interventies.
De software voor data-acquisitie en -analyse is op maat geschreven in IGOR Pro (een volledig interactieve softwareomgeving). Een analoog naar digitaal converter (A/D) systeem gaf een commandospanning onder computerbesturing en verkreeg gegevens van een aangepaste versterker. De versterker bezat bepaalde unieke eigenschappen. Deze omvatten een feedbackweerstand (schakelbaar) voor elk van de vier acquisitiekanalen, waardoor 1 MOhm of 10 MOhm feedbackspanningspancircuits konden worden gekozen om de variabiliteit van de elektrode te integreren. Een podiumeenheid met een enkele kop en een wederzijds aard- / referentiecircuit voor alle vier de acquisitiekanalen werd ook gebouwd om het apparaat dicht bij de borst in een enkele fysieke module te plaatsen. Een 1 MOhm feedbackweerstandsinstelling werd gebruikt om alle gerapporteerde gegevens te verzamelen.
De filter- en versterkingsinstellingen werden getelegrafeerd van de versterker en opgenomen in het gegevensbestand. Gegevens werden gefilterd op 1 kHz via een 2-polig analoog Bessel-filter gedigitaliseerd op 10 kHz. Het verschil in potentiaal tussen de sonde en de omringende geleidende oplossing creëert een Helmholtz capacitieve laag aan de sondepunt. Ligandbinding aan het antilichaam aan de sondepunt resulteert in een veranderde lokale lading en dus een verandering in de Helmholtz-capaciteit. Deze verandering in de capacitieve component van het circuit resulteert in een verschuiving in de grootte van de geïnjecteerde lading die nodig is om de sonde naar de potentiaal in het stapfunctiespanningsprotocol te brengen. De binding van een specifiek ligand aan de gefunctionaliseerde sonde resulteert dus in een verandering in de elektrodecapaciteitsmeting als een verandering in de piek capacitieve stroom.

<table><tbody><tr><td>AgCl discs elektrode</td><td>Warner Instruments (Holliston, MA)</td><td>64-1307</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NPY monoklonaal antilichaam</td><td>Abcam, (Cambridge, MA)</td><td>ab112473</td><td></td></tr><tr><td>Aangepaste multikanaals versterker/ 1 MΩ feedbackweerstand multikanaals hoofdtrap</td><td>NPI Electronic, (Tamm, Duitsland)</td><td>NA</td><td>Gebaseerd op NPI VA-10M multikanaals versterker</td></tr><tr><td>Dopamine HCl</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>H8502-10G</td><td></td></tr><tr><td>Vergulde mannelijke connectorpen</td><td>AMP-TE Connectivity (Amplimite)</td><td>6-66506-1</td><td></td></tr><tr><td>HEKA LIH 8+8 analoog-naar-digitaal/digitaal-naar-analoog apparaat</td><td>HEKA Elektronik, (Holliston, MA)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro data-acquisitiesoftware, v. 7.08</td><td>WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)</td><td></td><td>Software voor het besturen van opdrachten en data-acquisitie is op maat geschreven</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Standaard Digitale peristaltiekpomp</td><td>Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA-gecoate platinadraad</td><td>A-M Systems, (Sequim, WA)</td><td>773000</td><td>0.005&rdquo; kale diameter, 0.008&rdquo; gecoate diameter</td></tr><tr><td>Siliconen elastomeer</td><td>World Precision Instruments (Sarasota, FL)</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Synthetisch varkens NPY-peptide</td><td>Bachem (Torrance, CA)</td><td>4011654</td><td></td></tr><tr><td>Synthetisch varkens NPY-peptide</td><td>Bachem (Torrance, CA)</td><td>4011654</td><td></td></tr></tbody></table>

tijd-opgeloste in vivo meting van neuropeptidedynamica door capacitieve immunoprobe in porcine heart

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Het vermogen om biomarkers in vivo te meten die relevant zijn voor de beoordeling van ziekteprogressie is van groot belang voor de wetenschappelijke en medische gemeenschappen. De resolutie van de resultaten verkregen met de huidige methoden voor het meten van bepaalde biomarkers kan enkele dagen of weken duren om te verkrijgen, omdat ze zowel ruimtelijk als temporeel in resolutie kunnen worden beperkt (bijv. vloeistofcompartimentmicrodialyse van interstitiële vloeistof geanalyseerd door enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance vloeistofchromatografie [HPLC] of massaspectrometrie); zo wordt hun begeleiding van tijdige diagnose en behandeling verstoord. In deze studie wordt een unieke techniek voor het detecteren en meten van peptidetransmitters in vivo door het gebruik van een capacitieve immunoprobe biosensor (CI-sonde) gerapporteerd. Het fabricageprotocol en de in vitro karakterisering van deze sondes worden beschreven. Metingen van sympathische stimulatie-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo worden verstrekt. NPY-afgifte is gecorreleerd aan de sympathische afgifte van noradrenaline voor referentie. De gegevens tonen een aanpak voor de snelle en gelokaliseerde meting van neuropeptiden in vivo. Toekomstige toepassingen omvatten intraoperatieve real-time beoordeling van ziekteprogressie en minimaal invasieve kathetergebaseerde inzet van deze sondes.

Elektrodefabricage en karakterisering Een flexibele capacitieve immunoprobe (CI-sondes) werd gefabriceerd en een representatief beeld is afgebeeld in figuur 1A. De elektrodepotentiaal werd ingesteld door een computergestuurd spanningsklemcircuit (figuur 1B) en de elektrode werd ondergedompeld in een polydopamine-oplossing gemaakt in PBS. Polydopamine werd elektrodeposited op de geleidende elektrode tip13 voor functiona...

Gevestigde immunochemische methoden om peptidetransmitters in vivo te meten, vertrouwen op microdialyse of bulkvloeistoftrekking om het monster te verkrijgen voor offline analyse. Deze lijden echter aan spatiotemporale beperkingen. Het huidige protocol beschrijft de fabricage en toepassing van een capacitieve immunoprobe biosensor die de beperkingen van de bestaande technieken overwint.

Tijd-opgeloste in vivo meting van neuropeptidedynamica door capacitieve immunoprobe in porcine heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Dit is de eerste keer dat een methode is ontwikkeld voor de tijd-opgeloste meting van peptidetransmitterniveaus in vivo. We kunnen de niveaus van peptidetransmitters in afzonderlijke onderwerpen en discrete locaties meten met bijna-realtime analyse. Knip eerst een 25 centimeter lange perfluoroalkoxy-gecoate platinadraad.Verwijder vervolgens met behulp van een scalpel ongeveer vijf millimeter perfluoroalkoxy-coating van het ene uiteinde, voorzichtig om niet in de platinadraad te snijden. Steek nu het gestripte uiteinde van de platinadraad in een vergulde, mannelijke connectorpen van één millimeter. Krimp vervolgens met behulp van een naald-neustang de tanden van de connectorpen rond het gestripte uiteinde van de platinadraad en soldeer de platinadraad aan de vergulde connectorpen.Bereid vervolgens de dopamine-oplossing door 50 milligram dopaminehydrochloride toe te voegen in 50 milliliter 10-millimol PBS met pH-zes en meng door te roeren. Nadat de dopamine volledig is opgelost, plaatst u de punt van de platinadraad in het vat met de vers gemaakte met dopamine aangevulde PBS. Sluit de zilverchlorideschijfelektrode aan op het massakanaal in het hoofdstadium.Plaats vervolgens de zilverchlorideschijf in het vat met dopamine-aangevulde PBS en platinadraad. Voordat u verder gaat, sluit u een draadshunt aan op de referentiekanalen van de koptrap. Open de interactieve data-acquisitiesoftware en stel een zaagtand elektrodepositie-commandopotentiaalprotocol in door de startpotentiaal in te stellen op min 0,6 volt, de eindpotentiaal op 0,65 volt, de scansnelheid op 0,04 volt per seconde en de duur van de afzetting op 420 seconden.Na het voltooien van de poly-dopamine afzetting, verwijdert u de zilverchloride gemalen pellet en de punt van de platina draad uit het vat. Plaats de draadpunt gedurende twee tot vijf minuten in een microbuis met PBS van pH 7,4 en zorg ervoor dat de draadpunt geen contact maakt met de zijkanten of onderkant van de microbuis. Bereid vervolgens de antilichaamoplossing door het antilichaam van belang te combineren met het PBS van pH 7,4 in een verhouding van 1:20 in een vat van de juiste grootte.Week vervolgens de poly-dopamine afgezette punt van de platina-elektrode gedurende twee uur in antilichaamoplossing bij kamertemperatuur, zorg ervoor dat de platinadraadpunt in oplossing wordt gesuspendeerd en niet op het binnenoppervlak van de microbuis rust. Plaats de functionele punt van de capacitieve immunoprobe in de stroomkamer en zorg ervoor dat de punt van de elektrode op geen enkele manier wordt verstoord, omdat dit de sensorische punt van de sonde kan beschadigen. Voer vóór de eerste experimentele test een TBS-standaardrun uit om de capacitieve immunoprobe-sonde te conditioneren en stel voor het spanningsprotocol de positieve stappotentiaal in op 110 millivolts, negatieve stappotentiaal op min vijf millivolt, stapduur van 20 milliseconden en duur van acquisitie op 600 seconden.Maak vervolgens de peptide-oplossing van belang met behulp van dezelfde TBS om de samenstelling van het superfusaat te behouden. Stel een spruitstuksysteem in waarbij het superfusaat kan worden geschakeld tussen TBS en peptide-aangevulde TBS. Gebruik TBS-standaardparameters en stel het peptide sensing data acquisition protocol in door de duur van de acquisitie in te stellen op 360 seconden.Vóór de poly-dopamine-afzetting rijgt u de blootgestelde punt van de platinadraadelektrode door een 22-gauge hypodermische naald, waardoor ongeveer twee millimeter voorbij de punt van de naald overblijft. Gebruik een tang en buig voorzichtig de punt van de platinadraadelektrode om een weerhaak te maken die aan het uiteinde van de hypodermische naald hangt. Trek de naald voorzichtig terug van de prikkeldraadpunt, laat voldoende draad over om in het vat te plaatsen zonder dat de naald in contact komt met de vloeistof en ga verder met dopamineafzetting zoals eerder aangetoond.Spoel nu de prikkeldraadsondepunt met PBS en plaats deze in de antilichaamoplossing. Verwijder vervolgens voorzichtig de gefunctionaliseerde punt uit de PBS. Verplaats de hypodermische naald naar de prikkelbare capacitieve immunoprobe en implanteer deze voorzichtig in het interessante gebied voordat u de gouden connectorpen in het hoofdstadium steekt.Eenmaal geïmplanteerd, trekt u de hypodermische naald terug en laat u de elektrode op zijn plaats. Een positieve stap in de commandopotentiaal meet de injectiestroom die nodig is om de sondespanning te klemmen en maakt het mogelijk om de capacitieve stroom te meten. De negatieve commandopotentiaalstap verwijdert het gebonden peptide uit het antilichaam via elektrostatische afstoting.De golfvorm van het stapfunctiecommando gaf de tijd-opgeloste iteratieve detectie en kwantificering van het peptide weer. Het onderste spoor vertegenwoordigde de commandopotentiaal en de resulterende stroom onder de superfusie van de sonde in TBS. De equilibrated capacitieve immunoprobe vertoonde kleiner initieel verval en een stabiele uitgangswaarde gedurende zes minuten.De stroom van neuropeptide Y in de stroomkamer verhoogde de capacitieve stromen ten opzichte van de basislijn. Capacitieve immunoprobestromen gemeten met een neuropeptide Y antilichaam-gefunctionaliseerde sonde toonden een concentratieafhankelijk signaal dat gevoelig is voor laag-picomol neuropeptide Y Voor kalibratie werd een standaardcurve gemeten voor alle geteste concentraties. De stimulatie van het bilaterale stellaire ganglion vertoonde verhoogd neuropeptide Y wanneer het werd uitgezet met de negatieve controle capacitieve stromen.Noradrenaline-afgifte gemeten onder stellaatstimulatie toonde een synchrone afgifte met neuropeptide Y, consistent met een opgeroepen sympathische respons. De ontwikkeling van deze technieken kan intraoperatieve uitlezingen van belangrijke modulatoren van hartactiviteit bieden, waardoor potentiële snelle therapeutische of interventionele begeleiding wordt geboden. De techniek zoals hier gepresenteerd is specifiek voor cardiovasculaire inzet, maar de techniek zelf is geschikt voor andere fysiologische omgevingen, zoals urine, skeletspieren, nieren, vetweefsel, et cetera.

time-resolved-vivo-measurement-neuropeptide-dynamics-capacitive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video demonstrates a method for detecting and quantifying peptide transmitters using a capacitive immunoprobe biosensor. The functionalized electrode, coated with antibodies, interacts with peptides of interest, leading to a signal change that allows precise measurement and detection of peptides.

Target Peptide Detection and Measurement Using a Capacitive Immunoprobe Biosensor

Dit artikel beschrijft de gedetailleerde protocol en de apparatuur die nodig is voor dual optische kaart brengen van transmembraan potentiaal (V m) en gratis intra-sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca 2+ in de Langendorff-doorbloed konijn hart. Deze methode maakt directe observatie en kwantificering van Vm en SR Ca 2+ dynamiek in het intacte hart.

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

In het hart, moleculaire gebeurtenissen coördineren van de elektrische en contractiele functie van het orgel. Een set van de lokale veld fluorescentiemicroscopie technieken hier gepresenteerde maakt de registratie van cellulaire variabelen in intacte harten. Het identificeren van mechanismen voor het definiëren van de hartfunctie is van cruciaal belang in het begrijpen hoe het hart werkt onder pathologische situaties.

Lokale Field fluorescentiemicroscopie: Beeldvorming van cellulaire signalen in Intact Hearts

Hier presenteren we een protocol voor de modulatie van het intracardiac autonome zenuwstelsel en de beoordeling van de invloed daarvan op fundamentele electrofysiologie, arrhythmogenesis en kamp dynamiek met behulp van een ex vivo Langendorff setup.

Impact van Intracardiac neuronen op cardiale electrofysiologie en Arrhythmogenesis in een Ex Vivo Langendorff systeem

Dit artikel bevat een set van protocollen voor de ontwikkeling van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hartspier (hipsc-cm) netwerken gekweekt op multi well mea platen om reversibel elektroporate de celmembraan voor actie potentiële metingen. Opnamen met hoge doorvoer worden via dezelfde cellocaties herhaaldelijk over dagen verkregen.

Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyte netwerken op multi well micro-elektrode arrays voor terugkerende actie potentiële opnames

Het doel van deze studie was het vaststellen van een methode voor het onderzoeken van de cardiale dynamiek met behulp van een translationeel diermodel. De beschreven experimentele aanpak omvat Dual-emission optocardiografie in combinatie met een elektrofysiologisch onderzoek om elektrische activiteit te beoordelen in een geïsoleerd, intact varkens hart model.

Optocardiografie en elektrofysiologie studies van ex vivo Langendorff-perfused Hearts

We beschrijven protocollen voor het beoordelen van de mate van transductie door cel-penetrerende peptiden met behulp van ex vivo imaging systemen, gevolgd door paraffine inbedding, sectie, en confocale fluorescerende microscopie met behulp van cardiale targeting peptide als voorbeeld. In ons protocol kan één dier worden gebruikt om beide soorten beeldvormingsbeoordeling van dezelfde organen te verkrijgen, waardoor het aantal dieren dat nodig is voor studies met de helft wordt gehalveerd.

In Vivo Beeldvorming van transduction efficiëntie van cardiale targeting Peptide

Dit protocol heeft tot doel een nieuwe methodologie te beschrijven om de intrinsieke cardiale vuursnelheid te meten met behulp van micro-elektrode array-registratie van het hele sinoatriale knoopweefsel om pacemaking-defecten bij muizen te identificeren. Farmacologische middelen kunnen ook in deze methode worden geïntroduceerd om hun effecten op intrinsieke pacemaking te bestuderen.

Micro-elektrode array-opname van de vuursnelheid van de sinoatriale knoop om intrinsieke cardiale pacemakingdefecten bij muizen te identificeren

Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) zijn naar voren gekomen als een veelbelovend in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de contractiliteit en elektrofysiologie van hiPSC-CM's.

Technische toepassingen van micro-elektrode array en patchklemopnamen op door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

Dit protocol schetst geavanceerde materiaalfabricage en ex vivo rattenhartmethoden voor optische en elektrische bidirectionele bio-interfacing, waardoor nauwkeurige hartstimulatie, registratie en infarctmodellering voor bio-elektronicaonderzoek mogelijk zijn.

Bidirectionele elektrische en opto-elektronische interfaces in gezonde en ischemische ex vivo rattenharten

Leer tijd-opgeloste meting van neuropeptidedynamica in vivo met een capacitieve immunoprobe in een porcine heart. Deze methode biedt bijna-realtime analyse op discrete locaties.

Tijd-opgeloste in vivo meting van neuropeptidedynamica door capacitieve immunoprobe in porcine heart

Meer video's verkennen