Bepaling van bindingsaffiniteit (K_D) van radioactief gelabelde antilichamen tegen geïmmobiliseerde antigenen

Deze methode kan de bindingsaffiniteit van een radioactief gelabeld antilichaam voor zijn antigeen bepalen. Het zal ook de specificiteit van binding meten. Het belangrijkste voordeel van deze eenvoudige methode is de specifieke karakterisering van bindingsaffiniteit van alleen het radioactief gelabelde antilichaam zonder interferentie van het niet-geconjugeerde ouderlijke antilichaam.

Deze techniek valideert kwantitatief het vermogen van een radioactief gelabeld antilichaam om zich aan zijn doelwit te binden. Dit is belangrijk voor toepassingen in nucleaire beeldvorming en in nucleaire therapie bij verschillende ziekten. De procedure wordt gedemonstreerd door Erika Belitzky, een postdoctorale medewerker van mijn laboratorium.

Bereid om te beginnen een immobilisatiebuffer voor door 191 milligram natriumbicarbonaat en 23,9 milligram natriumcarbonaat toe te voegen aan een conische buis van 50 milliliter. Voeg vervolgens 40 milliliter water van 18 megaohm toe en los op door vortexing. Stel nu de pH in op 9,0 voordat u het totale volume op 50 milliliter brengt.

Bereid vervolgens 200 milliliter wasbuffer voor door 200 milliliter PBS en 100 microliter Tween 20 toe te voegen aan een fles van 250 milliliter. Bereid ook 50 milliliter bindingsbuffer door 50 milligram BSA en 25 microliter Tween 20 tot 50 milliliter PBS toe te voegen en meng door vortexing. Voeg 1,5 gram BSA toe aan 50 milliliter PBS om de blokkerende buffer voor te bereiden en vortex voorzichtig te mengen.

Verdun het antigeen in immobilisatiebuffer. Neem vervolgens een breekbare plaat met 96 putten en platte bodem en voeg 100 microliter antigeen toe aan de bodem van elke put van 24 putten in een array van acht bij drie. Bedek de plaat met afdichtingstape en incubeer een nacht bij vier graden Celsius.

Was het bord de volgende dag drie keer met wasbuffer. Keer de plaat stevig om in de gootsteen om de vloeistof weg te gooien en tik op de plaat op een stapel papieren handdoeken om de overtollige vloeistof te verwijderen. Voeg vervolgens aan de putten met het antigeen 300 microliter wasbuffer per put toe met behulp van een meerkanaalspipet.

Voeg 300 microliter blokkeerbuffer per put toe aan zowel 24-antigeen-gecoate putten als 24 lege putten van de 96-putplaat. Incubeer vervolgens de plaat gedurende een uur bij omgevingstemperatuur en was elke put van de plaat driemaal met 300 microliter wasbuffer. Maak drievoudige seriële verdunningen van het radioactief gelabelde antilichaam in de bindingsbuffer gedurende acht rijen aangeduid als A tot H op de plaat.

Bereken eerst het volume van het voorraad radioactief gelabelde antilichaam dat nodig is om een 1,2-milliliteroplossing van de eerste concentratie te maken. Voeg vervolgens 800 microliter bindingsbuffer toe aan microcentrifugebuizen met het label B tot H en voeg het vereiste volume bindingsbuffer toe aan een microcentrifugebuis met het label A. Voeg het berekende volume van het voorraad radioactief gelabelde antilichaam toe aan buis A en vortex voorzichtig. Draai vervolgens naar beneden met behulp van een mini-microcentrifuge om alle vloeistof op de bodem van de buis te verzamelen.

Voeg vervolgens 400 microliter vloeistof toe van twee A naar buis B.Na vortexing draait u het af met behulp van een mini-microcentrifuge. Voeg op dezelfde manier de oplossing toe van buis B naar buis C, C naar D, tot buis H.Voeg 100 microliter van elke verdunning per put toe aan drie putten geïmmobiliseerd met antigeen en drie putten geblokkeerd met alleen BSA. Voeg nu 100 microliter van elke verdunning toe aan de microcentrifugebuizen met het label A-standaard tot H-standaard en sla deze buizen op als radioactief gelabelde antilichaamstandaarden die in de gammateller moeten worden getest.

Incubeer de plaat gedurende een uur bij 37 graden Celsius met zacht wiegen. Label microcentrifugebuizen voor elke put zoals beschreven in het manuscript. Zuig het radioactief gelabelde antilichaam op uit de putten van de 96-putplaat met behulp van een vacuümaspirator.

Voeg nu met behulp van een meerkanaalspipet 300 microliter wasbuffer toe aan elke put. Zuig de wasbuffer op en herhaal het wassen nog vier keer. Breek de putten uit elkaar in de juiste microcentrifugebuizen.

Tel de radioactiviteit in de buizen met het antigeen gemarkeerd als H1, H2, H3, H3 tot A1, A2, A3 en vervolgens met BSA alleen gemarkeerd als H4, H5, H6, tot A4, A5, A6 met behulp van een gammateller. Radioactief gelabelde amivantamab vertoonde een specifieke binding voor EGFR- en cMET-eiwitten. Evenzo werden bindende affiniteiten ook behouden door radioactief gelabelde fabs met één arm gebonden aan EGFR- en cMET-eiwitten.

De verzadigingsbindingsdiagrammen toonden aan dat wanneer de concentraties van radioactief gelabelde antilichamen te laag waren, verzadiging niet werd bereikt, zoals aangegeven door de lineaire curve. Concentraties van radioactief gelabelde antilichamen die te hoog waren, leidden tot verzadiging zonder duidelijke logaritmische groei, zoals blijkt uit het horizontale plateau. Ook werd een hoge niet-specifieke binding gezien als gevolg van hoge concentraties radioactief gelabelde antilichamen.

Deze procedure kan meerdere pogingen vergen om het concentratiebereik voor elk specifiek radioactief gelabeld antilichaam te optimaliseren. Gebruik gegevens van negatieve resultaten om toekomstige experimenten te ontwerpen. Zodra bindingsaffiniteit bekend is, kan het worden gebruikt als benchmark voor andere in vitro assays als onderdeel van de karakterisering van een radioactief gelabeld antilichaam.