Name: Monstervoorbereiding voor snelle lipidenanalyse in drosophila-hersenen met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie massaspectrometrie beeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Leer MALDI-massaspectrometriebeeldvorming voor lipidenanalyse in Drosophila-hersenen. Deze methode maakt in situ-detectie mogelijk zonder labelen en ondersteunt betrouwbaar onderzoek naar metabolieten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy en Maya Hein worden ondersteund door de Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP). Jun Yin wordt ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Ondersteuning voor dit project werd geleverd door een PSC-CUNY Award aan Ye He en Rinat Abzalimov, gezamenlijk gefinancierd door The Professional Staff Congress en The City University of New York.

1. Inbedding van de vliegkop
OPMERKING: De hele procedure duurt ~ 45-60 min.
<ol><li>Bereid de optimale fase van de snijtemperatuurverbinding (OCT-compound) voor met een vlak oppervlak.<ol><li>Voeg OCT toe aan een plastic cryomold (15 mm x 15 mm x 5 mm) tot de helft van de diepte van de cryomold en voorkom bubbelvorming. Laat de mal enkele minuten op een plat oppervlak liggen en breng deze vervolgens over op droogijs.</li>
		<li>Houd de cryomold plat op het droogijs en laat de OCT een vlak en egaal oppervlak vormen. Wacht tot de OCT volledig is gestold in de mal. Gebruik de bevroren OCT-stadia onmiddellijk of bewaar ze bij −80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Verdoof volwassen vliegen met CO2 (d.w.z. een CO2-pad ).<ol><li>Maak een petrischaaltje met daarin een stukje laboratoriumdoekje. Gebruik water om een deel van het doekje te bevochtigen om de statische elektriciteit te verminderen. Houd het doekje half nat en half droog.</li>
		<li>Gebruik onder het ontleden van scope 1 een tang om de vliegenkop door te snijden. Verzamel elke keer 4-5 koppen en leg ze op het droge gedeelte van het laboratoriumdoekje. OPMERKING: Het verzamelen van 4-5 koppen duurt ~ 2 minuten.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng de OCT-fase over van droogijs naar de dissectiescope.<ol><li>Neem de OCT-fase van droogijs naar microscoop 2, breng de koppen onmiddellijk over naar de OCT-fase en rangschik ze snel, wat ~ 30 s duurt om OCT-smelten te voorkomen. Laat ~ 1 mm lege ruimte rond elk vliegenbrein om voldoende ondersteuning van de OCT en 4-5 mm lege ruimte vanaf de rand van het blok te garanderen om voldoende ruimte te bieden om het gedeelte te verwerken. Als de proboscis te lang is, verwijder dan de punt; als het niet te lang is, houd het dan intact. Leg het OCT-podium terug op het droogijs en laat het ~ 3 minuten aanblijven om ervoor te zorgen dat het OCT-podium bevroren en stevig blijft.</li>
		<li>Wanneer het OCT-stadium weer op het droogijs is en wacht op stolling, verzamel dan nog een ronde hoofden. Herhaal stap 1.2 en 1.3 om extra monsters over te brengen naar de resterende ruimte op het podium. OPMERKING: Acht koppen worden meestal bereid voor elk genotype en vier genotypen worden gebruikt in één OCT-fase in dit laboratorium.</li>
		<li>Gebruik twee dissectiemicroscopen, naast elkaar, om te voorkomen dat de focus verandert en de tijd die nodig is om de koppen op het OCT-stadium over te brengen en te rangschikken te verlengen en om het risico op smelten van de OCT-fase te verminderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Nadat alle vliegenkoppen zijn uitgelijnd, laat je het OCT-podium nog 5-10 minuten op het droogijs zitten.</li>
	<li>Neem het OCT-stadium weg van het droogijs, leg het op een plat oppervlak (bank) en voeg dan snel een grote hoeveelheid OCT-verbinding toe om alle monsters te bedekken en vul de hele cryomold, die ~ 3 s duurt.</li>
	<li>Breng de cryomold onmiddellijk terug naar droogijs en vries het hele OCT-blok met de ingebedde weefsels in. Laat het OCT-podium nog 5-10 minuten op het droogijs zitten. Label de monsters op de rand van de cryomold.</li>
	<li>Bewaar de bevroren monsters bij −80 °C totdat ze klaar zijn voor de section.</li>
</ol>2. Cryosectie van het weefsel
OPMERKING: Draag bij het hanteren van de indiumtinoxide (ITO) glijden te allen tijde handschoenen om weefselbesmetting te voorkomen. Het dragen van een masker wordt ook aanbevolen om te voorkomen dat u direct op de glijbaan ademt.
<ol><li>Bevestig de ITO-gecoate zijde door de geleidbaarheid van de ITO-dia's te testen met behulp van een voltmeter die is ingesteld op weerstand. Markeer de zijkant met een weerstandsmeting als de kant om het weefsel aan te hechten. Label het en plaats altijd een laboratoriumdoekje op de bodem van de dia om diabesmetting te voorkomen.</li>
	<li>Laat de weefsels gedurende 30-45 minuten in evenwicht komen in de cryostaatkamer.<ol><li>Om het smelten van de OCT te voorkomen, plaatst u alle benodigde gereedschappen zoals een tang en een dunpuntige artist-borstel van tevoren in de cryostaatkamer om ze voor te koelen.</li>
	</ol></li>
	<li>Reinig de cryostaat, bij voorkeur met 70% ethanol. Veeg de rolplaat en het podium af en verwijder de gebruikte messen. Gebruik extra schone doekjes om ervoor te zorgen dat de ethanol is verdampt en dat alle oppervlakken droog zijn voordat het snijden begint.</li>
	<li>Pas de temperatuur van de cryostaatkamer en de monsterkop aan op basis van het type weefsel (bijv. −14 °C voor lever, −20 °C voor spieren en −25 °C voor huid10; −18 °C voor vliegenkoppen in dit protocol).</li>
	<li>Monteer het weefsel op de monsterhouder met OCT. Zorg ervoor dat u voldoende OCT gebruikt om de basis van het OCT-blok te bedekken en monteer het blok zo plat mogelijk.</li>
	<li>Plaats een schoon mes in het podium en vergrendel het. Plaats de kop van het monster naar behoefte in de richting van het podium om de gewenste snijhoek te bereiken.<ol><li>Plaats het monsterblok in een richting waarin alle genotypen/behandelingsgroepen verticaal ten opzichte van het blad zijn geplaatst. OPMERKING: Dit zorgt voor een consistent snijvlak en voorkomt kruisbesmetting door verschillende groepen. Als u een ander blok weefsel snijdt, schakel dan over op een nieuw mes tussen de monsters om kruisbesmetting te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Begin met snijden in dikke delen (50-100 μm) totdat het interessante gebied (bijvoorbeeld het gewenste gebied van de hersenen) is gevonden.<ol><li>Borstel voortdurend extra stukken af met een voorgekoelde artiestenborstel om het podium schoon te houden.</li>
	</ol></li>
	<li>Verander de dikte van de secties in 10-12 μm zodra het gewenste gebied is bereikt.<ol><li>Pas de kamertemperatuur indien nodig enigszins aan. Stel bijvoorbeeld een hogere temperatuur in als het gedeelte de neiging heeft om te schilferen of gemakkelijk uit elkaar te vallen. OPMERKING: De aanbevolen temperatuur voor OCT-blokken is −18 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Verzamel zorgvuldig het gewenste gedeelte en plak het op de ITO-dia. Voer deze bewerking uit in de cryostaatkamer.<ol><li>Neem een ITO-dia op kamertemperatuur en plaats deze over de sectie, benader de sectie voorzichtig en snel zodat de sectie zich aan de dia hecht zonder sporen achter te laten op het cryostaatstadium. OPMERKING: De OCT zal smelten en zich vastklampen aan de dia.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de schuif opzij in een rek of laboratoriumdoekje buiten de cryostaat tussen de verzamelingen van meerdere secties.</li>
	<li>Als vergelijking tussen verschillende steekproeven van hetzelfde cohort gewenst is, plaatst u de secties van meerdere monsters op één dia voor gelijktijdige analyse en minimale variatie. Indien nodig gescheiden van twee dia's, omdat de MALDI-doelhouder plaats biedt aan twee dia's in één keer.</li>
	<li>Transporteer de dia's in een vacuümdoos naar een exsiccator met droogmiddel als onderste laag. Droog de dia's onder een vacuüm gedurende 30-60 min. OPMERKING: Als alternatief, als het laboratorium niet is uitgerust met een vacuümdesiccator, moeten de dia's gedurende het hele proces op −20 °C worden bewaard tot opslag bij −80 °C binnen 24 uur of verzending op droogijs om verslechtering van lipiden of metabolieten te voorkomen.</li>
	<li>Ga verder met matrixdepositie. Gebruik 2,5-dihydroxybenzoëzuur (DHB) in methanol/water (70/30, v/v) als matrix.</li>
	<li>Als dia's niet onmiddellijk worden uitgevoerd, bewaar de dia's dan bij −80 °C (tot 1 maand voor vliegenhersenensecties en 6 maanden voor knaagdierhersensecties), of verzend het monster onmiddellijk naar MALDI-kernfaciliteiten met voldoende droogijs. Voor optimale opslag en verzending plaatst u de dia's in een schuiftransporter en sluit u de opening veilig af met wasfolie. Sluit af met een ritszak, plaats deze in een andere ritszak met droogmiddel en label de buitenkant. OPMERKING: Raadpleeg eerder werk voor de gevolgde stappen van diascanning, matrixdepositie en MALDI-beeldvormingsprocedures11.</li>
	<li>Matrixdepositie uitvoeren met behulp van de automatische HTX M5 matrixsproeier en een 40 mg/ml oplossing dhb in methanol/water (70/30, v/v). Spuit de matrix met een aangepast debiet van 0,12 ml/min en een nozzletemperatuur van 85 °C gedurende 10 gangen. Gebruik een N2 gasdruk van 10 psi. OPMERKING: Als de N2-gasdruk in de sproeier onder 5 psi wordt verlaagd, zal een veiligheidsmechanisme in de sproeier de verwarming onmiddellijk uitschakelen om schade aan de sproeier te voorkomen met een sproeisnelheid van 1.300 mm / min, 2 mm spoorafstand, 3 L / min debiet en 40 mm nozzlehoogte.</li>
	<li>Gebruik een MALDI time of flight (TOF) MS-instrument (zie de tabel met materialen) in positieve ionmodus om een massaspectrum te verkrijgen binnen het massabereik van m/z 50-1.000.<ol><li>Om het instrument te kalibreren, spot u 0,5 μL rode fosforemulsie in acetonitril op de ITO-dia's en gebruikt u de spectra om het instrument te kalibreren in het massabereik van 50-1.000 m / z door een kwadratische kalibratiecurve2 toe te passen.</li>
		<li>Stel de laserspotdiameters in op Medium, omdat dit het gemoduleerde bundelprofiel is voor een rasterbreedte van 40 μm, en verzamel beeldgegevens door 500 opnamen op te tellen met een laserherhalingssnelheid van 1.000 Hz per arraypositie.</li>
		<li>Gebruik software (zie de Materiaaltabel) om de spectrale gegevens vast te leggen en te verwerken. Voer beeldgegevensanalyse uit met behulp van rms-normalisatie (root mean square) om ionenbeelden te genereren met een bakbreedte van ±0,10 Da. Lijn de spectra van zowel het OCT- als het hersenweefsel uit hetzelfde experiment uit met behulp van de software om de overlappende pieken en de iononderdrukkingsinterferentie van de OCT te evalueren (aanvullende figuur S1). Verwerk na het experiment de MALDI-dia's met de weefselmonsters door hematoxyline- en eosinekleuring (H&E), zoals eerder beschreven11.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+lipids+and+their+derivatives+in+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications.</a> Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).</li>
<li>Augustin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+for+the+medium-chain+triglyceride+ketogenic+diet+in+neurological+and+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders.</a> Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).</li>
<li>Baldwin, K. T., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+astrocyte-induced+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).</li>
<li>Mauch, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cns+synaptogenesis+promoted+by+glia-derived+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol.</a> Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).</li>
<li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li>
<li>Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+using+lipopolysaccharide-stimulated+bone+marrow-derived+dendritic+cells+to+treat+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).</li>
<li>Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+lipid+analysis+towards+lipidomics%2C+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+I%3A+Modern+lipid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).</li>
<li>Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+lipids+analysis+towards+lipidomics%2C+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+II%3A+Analytical+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).</li>
<li>Yang, K., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics%3A+Techniques%2C+applications%2C+and+outcomes+related+to+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).</li>
<li>Norris, J. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+tissue+specimens+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+imaging+mass+spectrometry+in+biological+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research.</a> Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).</li>
<li>Veerasammy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+metabolic+profiling+using+MALDI+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62008(2020).</li>
<li>Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+lipid+metabolism%3A+Multiple+pathways+driving+functional+outcomes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10(2018).</li>
<li>Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+and+their+trafficking%3A+An+integral+part+of+cellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization.</a> Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).</li>
<li>Wang, H., Eckel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+lipoproteins+doing+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">What are lipoproteins doing in the brain.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).</li>
<li>Palm, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+in+Drosophila+melanogaster-Assembly%2C+function%2C+and+influence+on+tissue+lipid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition.</a> PLoS Genetics. 8 (7), 1002828(2012).</li>
<li>Parra-Peralbo, E., Culi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+lipophorin+receptors+mediate+the+uptake+of+neutral+lipids+in+oocytes+and+imaginal+disc+cells+by+an+endocytosis-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism.</a> PLoS Genetics. 7 (2), 1001297(2011).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-specific+lipoprotein+receptors+interact+with+astrocyte+derived+apolipoprotein+and+mediate+neuron-glia+lipid+shuttling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2408(2021).</li>
<li>Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+lipid+species+in+Drosophila+during+overnutrition+by+UHPLC-MS%2FMS+and+MALDI-MSI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI.</a> Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).</li>
<li>Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+chemical+imaging+of+a+single+brain+tissue+section+using+ToF-SIMS%2C+MALDI-ToF+and+immuno%2Fhistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining.</a> Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).</li>
<li>Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+structural+effects+of+oral+administration+of+methylphenidate+in+Drosophila+brain+by+secondary+ion+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).</li>
<li>Dienel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+and+imaging+mass+spectrometric+assays+of+labile+brain+metabolites%3A+Critical+importance+of+brain+harvest+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures.</a> Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).</li>
<li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%3A+Practical+aspects+of+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation.</a> Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).</li>
<li>Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging+of+Drosophila+brain+using+matrix+sublimation+versus+modification+with+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).</li>
<li>Niehoff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Drosophila+lipids+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).</li>
<li>Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+imaging+of+GABA+in+the+Drosophila+melanogaster+adult+head%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head.</a> Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).</li>
<li>Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+fly+malpighian+tubule+lipidome+by+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).</li>
<li>Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+mass+spectrometry+for+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advances in mass spectrometry for lipidomics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).</li>
<li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+for+studying+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Lipidomics for studying metabolism.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).</li>
<li>Wang, M., Wang, C., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+internal+standards+for+accurate+quantification+of+complex+lipid+species+in+biological+extracts+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry-What%2C+how+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why.</a> Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Zoals aangetoond in de studie naar de variaties in lipidesamenstelling in mutante en wild-type Drosophila hersenen, kan MALDI MSI een waardevolle labelvrije beeldvormingstechniek zijn voor in situ analyse van moleculaire distributiepatronen in organen van kleine insecten. Inderdaad, omdat lipiden worden verdeeld in zowel het hersenweefsel als het vetlichaam van Drosophila-hoofden, kunnen conventionele lipidomics-benaderingen op basis van vloeistofchromatografie en massaspectrometrie (LC-MS) all...

Lipiden zijn betrokken bij een breed scala aan biologische processen en kunnen grofweg worden ingedeeld in vijf categorieën op basis van hun structurele diversiteit: vetzuren, triacylglycerolen (TAGs), fosfolipiden, sterollipiden en sfingolipiden1. De fundamentele functies van lipiden zijn het leveren van energiebronnen voor biologische processen (d.w.z. TAGs) en het vormen van cellulaire membranen (d.w.z. fosfolipiden en cholesterol). Er zijn echter aanvullende rollen van lipiden opgemerkt in ontwikkeling en ziekten en zijn uitgebreid bestudeerd op biomedisch gebied. Rapporten hebben bijvoorbeeld aangetoond dat vetzuren van verschillende lengtes unieke therapeutische rollen kunnen hebben. Korte vetzuurketens kunnen betrokken zijn bij verdedigingsmechanismen tegen auto-immuunziekten, middellange vetzuurketens produceren metabolieten die aanvallen kunnen verminderen en lange vetzuurketens genereren metabolieten die kunnen worden gebruikt om metabole stoornissen te behandelen2. In het zenuwstelsel is aangetoond dat van glia afgeleide cholesterol en fosfolipiden van vitaal belang zijn voor synaptogenese 3,4. Andere soorten lipiden zijn veelbelovend gebleken in medische toepassingen, waaronder sfingolipiden die worden gebruikt in medicijnafgiftesystemen en sacharines die worden gebruikt om het immuunsysteem te ondersteunen 5,6. De talrijke rollen en potentiële therapeutische toepassingen van lipiden op biomedisch gebied hebben lipidomics - de studie van de routes en interacties van cellulaire lipiden - tot een kritisch en steeds belangrijker veld gemaakt.
Lipidomics maakt gebruik van analytische chemie om het lipidoom op grote schaal te bestuderen. De belangrijkste experimentele methoden die in lipidomics worden gebruikt, zijn gebaseerd op massaspectrometrie (MS) in combinatie met verschillende chromatografie- en ionenmobiliteitstechnieken 7,8. Het gebruik van MS in het gebied is voordelig vanwege de hoge specificiteit en gevoeligheid, de snelheid van verwerving en de unieke mogelijkheden om (1) lipiden en lipidemetabolieten te detecteren die zelfs op lage en voorbijgaande niveaus voorkomen, (2) honderden verschillende lipideverbindingen in een enkel experiment te detecteren, (3) voorheen onbekende lipiden te identificeren en (4) onderscheid te maken tussen lipide-isomeren. Onder de ontwikkelingen in MS, waaronder desorptie-elektrospray-ionisatie (DESI), MALDI en secundaire ionenmassaspectrometrie (SIMS), is MALDI MSI naar voren gekomen als een krachtige beeldvormingstechniek die conventionele MS-gebaseerde benaderingen aanvult door unieke informatie te verstrekken over de ruimtelijke verdeling van lipiden binnen weefselcompartimenten 9,10.
De typische workflow van lipidomics bestaat uit monstervoorbereiding, data-acquisitie met behulp van massaspectrometrietechnologie en data-analyse11. De studie van lipiden en metabolieten in monsters heeft geleid tot de opkomst van technieken om de fysiologische en pathologische omstandigheden van metabole processen in organismen te begrijpen. Hoewel het begrijpen van biologische interacties belangrijk is, maakt de gevoeligheid van lipiden en metabolieten ze moeilijk in beeld te brengen en te identificeren zonder kleurstoffen of andere modificaties. Veranderingen in metabolietniveaus of distributie kunnen leiden tot fenotypische veranderingen. Een hulpmiddel dat wordt gebruikt voor metabolomische profilering is MALDI MSI, een labelvrije, in situ beeldvormingstechniek die in staat is om honderden moleculen tegelijkertijd te detecteren. MALDI-beeldvorming maakt de visualisatie van metabolieten en lipiden in monsters mogelijk met behoud van hun integriteit en ruimtelijke verdeling. Eerdere technologie voor lipidenprofilering omvatte het gebruik van radioactieve chemicaliën om lipiden individueel in kaart te brengen, terwijl MALDI-beeldvorming hiervan afziet en tegelijkertijd een reeks lipiden kan detecteren.
Lipidenmetabolisme en homeostase spelen belangrijke functies in de celfysiologie, zoals het onderhoud en de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Een essentieel aspect van het lipidenmetabolisme van het zenuwstelsel is de lipide-shuttling tussen neuronen en gliacellen, die wordt gemedieerd door moleculaire dragerlipoproteïnen, waaronder lipoproteïne met zeer lage dichtheid (VLDL), lipoproteïnen met lage dichtheid (LDL) en lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL)12. Lipoproteïnen bevatten apolipoproteïnen (Apo), zoals ApoB en ApoD, die functioneren als structurele blokken lipidelading en als liganden voor lipoproteïnereceptoren. De neuron-glia kruisverwijzing van lipiden omvat meerdere spelers zoals glia-afgeleide ApoD, ApoE en ApoJ, en hun neuronale LDL-receptoren (LDLRs)13,14. In Drosophila is apolipophorine, een lid van de ApoB-familie, een belangrijke hemolymfe-lipidedrager15. Apolipophorine heeft twee nauw verwante lipoforinereceptoren (LpR's), LpR1 en LpR2, die homologen zijn van zoogdier LDLR15,16. In eerdere studies werden de astrocyten-uitgescheiden lipocaline Glial Lazarillo (GLaz), een Drosophila homoloog van menselijk ApoD, en zijn neuronale receptor LpR1 ontdekt om coöperatief neuron-glia lipide shuttling te bemiddelen, waardoor de dendrietmorfogenese wordt gereguleerd17. Daarom werd gespeculeerd dat het verlies van LpR1 een afname van het totale lipidengehalte in de Drosophila-hersenen zou veroorzaken. MALDI MSI zou een geschikt hulpmiddel zijn voor het profileren van de lipide-inhoud in kleine weefsels van LpR1−/− mutante en wild-type Drosophila-hersenen, zoals aangetoond in deze studie.
Ondanks de groeiende populariteit van MALDI MSI, belemmeren de hoge kosten en experimentele complexiteit van het instrument vaak de implementatie ervan in individuele laboratoria. De meeste MSI-onderzoeken van MALDI worden dus uitgevoerd met behulp van gedeelde kernfaciliteiten. Net als bij andere toepassingen van MALDI MSI is een zorgvuldig monstervoorbereidingsproces voor lipidomics van cruciaal belang om betrouwbare resultaten te bereiken. Omdat monsterdiapreparatie echter meestal wordt uitgevoerd in individuele onderzoekslaboratoria, is er een mogelijkheid van variatie in MALDI MSI-acquisitie. Om dit te bestrijden, beoogt dit artikel een gedetailleerd protocol te bieden voor de monstervoorbereiding van kleine biologische monsters voorafgaand aan MALDI MSI-meting met behulp van lipidenanalyse van een grote groep volwassen Drosophila-hersenen in positieve ionenmodus als voorbeeld11,17. Sommige fosfolipideklassen en de meerderheid van de kleine metabolieten worden echter gunstig gedetecteerd door MALDI-beeldvorming in negatieve ionenmodus, die eerder werd beschreven11. Daarom hopen we met deze twee voorbeeldstudies gedetailleerde monstervoorbereidingsprotocollen van verschillende combinaties te bieden: vrijstaand groot weefsel versus ingebed klein weefsel, dooimontage versus warmschuifmontage en positieve ionmodus versus negatieve ionmodus.

<table><tbody><tr><td>2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)</td><td>Millipore Sigma Aldrich</td><td>85707-1G-F</td><td></td></tr><tr><td>Andwin Scientific&nbsp;CRYOMOLD 15X15X5</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9464347</td><td></td></tr><tr><td>Andwin Scientific&nbsp;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-111-2302</td><td></td></tr><tr><td>autoflex speed MALDI-TOF MS system</td><td>Bruker Daltonics Inc</td><td></td><td>MALDI-TOF MS instrument</td></tr><tr><td>BD&nbsp;Syringe with Luer-Lok Tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp;Vacutainer General Use Syringe Needles</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-021-020</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Daltonics&nbsp;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0380464</td><td></td></tr><tr><td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics</td><td></td><td>AC219095000</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td><td>Amazon</td><td>Perfection V600</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;5-Place Slide Mailer</td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Digital Auto-Range Multimeter</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-241-1</td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging v3.0</td><td>Bruker Daltonics Inc</td><td></td><td>Bruker MS imaging analysis software</td></tr><tr><td>HPLC Grade Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>MMX04751</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Grade Water</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-1</td><td></td></tr><tr><td>HTX M5 Sprayer</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td></td><td>Automatic heated matrix sprayer</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>MSC&nbsp;Ziploc Freezer Bag</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-111-3769</td><td></td></tr><tr><td>SCiLS Lab (2015b)</td><td>SCiLS Lab</td><td></td><td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp;CryoStar NX50 Cryostat</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>95-713-0</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-642-7</td><td></td></tr></tbody></table>

monstervoorbereiding voor snelle lipidenanalyse in drosophila-hersenen met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie massaspectrometrie beeldvorming

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Lipid profiling, of lipidomics, is een gevestigde techniek die wordt gebruikt om het volledige lipidegehalte van een cel of weefsel te bestuderen. Informatie verkregen uit lipidomics is waardevol bij het bestuderen van de paden die betrokken zijn bij ontwikkeling, ziekte en cellulair metabolisme. Veel gereedschappen en instrumentaties hebben lipidomics-projecten ondersteund, met name verschillende combinaties van massaspectrometrie en vloeistofchromatografietechnieken. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) is onlangs naar voren gekomen als een krachtige beeldvormingstechniek die conventionele benaderingen aanvult. Deze nieuwe techniek biedt unieke informatie over de ruimtelijke verdeling van lipiden binnen weefselcompartimenten, die voorheen onbereikbaar was zonder het gebruik van overmatige modificaties. De voorbeeldvoorbereiding van de MSI-aanpak van MALDI is van cruciaal belang en is daarom de focus van dit artikel. Dit artikel presenteert een snelle lipidenanalyse van een groot aantal Drosophila-hersenen ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) om een gedetailleerd protocol te bieden voor de voorbereiding van kleine weefsels voor lipidenanalyse of metaboliet- en kleine molecuulanalyse via MALDI MSI.

Het verlies van de neuronale receptor LpR1 van de astrocyten-uitgescheiden lipocaline Glial Lazarillo (GLaz), een Drosophila homoloog van menselijk ApoD, werd verondersteld een afname van het totale lipidegehalte in de Drosophila hersenen te kunnen veroorzaken. Om dit te testen, werd MALDI MSI gebruikt om de lipiden in LpR1−/− mutante en wild-type Drosophila hersenen te profileren, wat hieronder wordt uitgewerkt.
Het experiment werd uitgevoerd vol...

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de juiste monstervoorbereiding voor lipide- en metabolietanalyse in kleine weefsels, zoals de Drosophila-hersenen , met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie beeldvorming.

Monstervoorbereiding voor snelle lipidenanalyse in drosophila-hersenen met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie massaspectrometrie beeldvorming

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired ...

Maldi MS-spectrometrie beeldvorming is een gevestigd en nuttig hulpmiddel om lipidenrijkdom en -distributie te identificeren en te visualiseren, zonder overmatige monstermodificatie. Het belangrijkste voordeel van Maldi-beeldvorming is het vermogen om de lipiden in situ te detecteren zonder etikettering en tegelijkertijd grote populatie monsters te analyseren. Oefening baart kunst.Zorg ervoor dat je goed oefent voordat je de echte experimentele monsters verwerkt. Minimaliseer de voorbereidingstijd van het monster en vermijd besmetting tijdens de hele procedure. Voeg om te beginnen de optimale snijtemperatuur of OCT toe aan een plastic cryomold tot de helft van de diepte van de cryovorm terwijl u bubbelvorming voorkomt.Laat de mal enkele minuten op een vlak oppervlak liggen en breng deze vervolgens over op droogijs. Houd de cryomold plat op het droogijs en laat de OCT een vlak en egaal oppervlak vormen. Wacht tot de OCT volledig is gestold in de mal.Gebruik de bevroren OCT-stadia onmiddellijk, of bewaar ze bij min 80 graden Celsius. Na het verdoven van de volwassen vliegen Met behulp van koolstofdioxide, bereid een petrischaal met een stuk laboratoriumdoekje. Gebruik water om een deel van het doekje te bevochtigen om de statische elektriciteit te verminderen.Houd het doekje half nat en half droog. Nadat u de vliegenkop onder een ontleedbare scope één hebt gesneden, verzamelt u vier tot vijf koppen en plaatst u ze op het droge gedeelte van het laboratoriumdoekje. Neem het OCT-podium van droogijs naar microscoop twee.Breng de koppen onmiddellijk over naar de OCT-fase en rangschik ze snel, wat ongeveer 30 tot 60 seconden duurt om oct-smelten te voorkomen. Laat ongeveer een millimeter lege ruimte rond elk vliegenbrein om voldoende ondersteuning van de OCT en vier tot vijf millimeter lege ruimte vanaf de rand van het blok te garanderen om voldoende ruimte te bieden om de sectie te verwerken. Leg het OCT-podium terug op het droogijs en laat het ongeveer drie minuten aanblijven om ervoor te zorgen dat het OCT-podium bevroren en stevig blijft.Nadat alle vliegenkoppen zijn uitgelijnd, laat je het OCT-podium nog vijf tot 10 minuten op droogijs zitten. Breng het OCT-stadium over van het droogijs naar een plat oppervlak en voeg vervolgens snel een grote hoeveelheid OCT-verbinding toe om alle monsters te bedekken en vul de hele cryomold, wat ongeveer drie seconden duurt. Breng de cryomold onmiddellijk terug naar droogijs en vries het hele OCT-blok met de ingebedde weefsels in.Laat het OCT-podium nog vijf tot 10 minuten op het droogijs zitten. Label de monsters op de rand van de cryomold en bewaar de bevroren monsters bij min 80 graden Celsius totdat ze klaar zijn voor sectie. Bevestig de ITO-gecodeerde zijde door de geleidbaarheid van de ITO-dia's te testen met behulp van een voltmeter die is ingesteld op weerstand.Markeer de zijkant met een weerstandsmeting als de kant om het weefsel aan te hechten. Label het en plaats altijd een laboratoriumdoekje op de bodem van de dia om diabesmetting te voorkomen. Laat de weefsels vervolgens gedurende 30 tot 45 minuten in evenwicht zijn in de cryostaatkamer.Reinig de cryostaat, bij voorkeur met 70% ethanol. Veeg de rolplaat in fase af en verwijder de gebruikte messen. Gebruik extra schone doekjes om ervoor te zorgen dat de ethanol is verdampt en dat alle oppervlakken droog zijn voordat het snijden begint.Pas vervolgens de temperatuur van de kop van het cryostatkamerzandmonster aan op basis van het type weefsel. Monteer het weefsel op de monsterhouder met OCT. Zorg ervoor dat u voldoende OCT gebruikt om de basis van het OCT-blok te bedekken en monteer het blok zo plat mogelijk.Plaats een schoon mes op het podium en vergrendel het. Plaats de kop van het monster naar behoefte in de richting van het podium om de gewenste snijhoek te bereiken. Begin vervolgens met het snijden in dikke delen totdat het interessante gebied is gevonden.Borstel de extra stukken voortdurend af met een voorgekoelde artiestenborstel om het podium schoon te houden. Pas de kamertemperatuur indien nodig enigszins aan en verander de dikte van de secties in 10 tot 12 micrometer zodra het gewenste gebied is bereikt. Verzamel zorgvuldig de gewenste sectie.Neem een ITO-dia op kamertemperatuur en plaats deze over het gedeelte. Benader het gedeelte voorzichtig en plak het op de dia zonder sporen achter te laten op het cryostaatstadium. Plaats de schuif opzij in een rek of laboratoriumdoekje buiten de cryostaat tussen de verzamelingen van meerdere secties.Als vergelijking tussen verschillende monsters van hetzelfde cohort gewenst is, plaatst u de secties van meerdere monsters op één dia, zodat ze tegelijkertijd kunnen worden geanalyseerd om variatie te minimaliseren. Indien nodig gescheiden van twee dia's, omdat de Maldi-doelhouder plaats biedt aan twee dia's in één keer. Transporteer de dia's in een vacuümbox naar een droogmiddel met uitdroging als onderste laag.Drijf de dia's gedurende 30 tot 60 minuten onder een vacuüm en ga dan verder met de matrixafzetting. Gebruik twee vijf dihydroxybenzoëzuur, of DHB, in methanolwater als matrix. Plaats de glijbanen in een schuiftransporter en sluit de opening goed af met de wasfolie.Verzegel met de ritszak. Doe het in een andere ritszak met droogmiddel. Label de buitenkant en verzend het monster met voldoende droge ogen naar de kernfaciliteiten van Maldi.Gebruik voor de matrixafzetting 40 milligram per milliliter DHB en methanolwater als matrix en spuit het met behulp van een automatische HTX M5 matrixspuit. Gebruik een stikstofgasdruk van 10 PSI. Gebruik een Maldi-vluchttijd, MS-instrument en positieve ionmodus om een massaspectrum te verkrijgen.Kalibreer het instrument door 0,5 microliter rode fosforemulsie in aceto Nitro op de ITO-dia's te plaatsen. Gebruik het spectra om het instrument te kalibreren in het massabereik van 100 tot 1000 MZ door een kwadratische kalibratiecurve toe te passen. Stel de laserspotdiameters in op medium, omdat dit het gemoduleerde straalprofiel is voor een rasterbreedte van 40 micrometer en verzamel beeldgegevens door 500 opnamen op te tellen met een laserherhalingssnelheid van 1000 hertz per arraypositie.Noteer vervolgens de spectrale gegevens. Voer de analyse van de beeldgegevens uit met behulp van root mean square normalisatie om ionenbeelden te genereren met een bandbreedte van plus minus 0,10 Dalton. Lijn de spectra van zowel het OCT als het hersenweefsel uit hetzelfde experiment uit met behulp van de software om de overlappende pieken in de ionpressie-interferentie van de OCT te evalueren.Verwerk ten slotte de MALDI-dia's met de weefselmonsters door hematoxyline en eosine, of H- en E-kleuring. Beelden van Maldi MS-analyse onthulden een algemene afname van het lipidegehalte in de LPR1 knock-out mutant hersenen. De representatieve H- en E-gekleurde volwassen vliegenhersenensecties worden hier weergegeven.De lipidensoorten, hun respectievelijke MZ-waarden en de schalen van de heatmap worden ook aangegeven in deze afbeelding. De gemiddelde reductieplooi van de LPR1 knock-out mutant in vergelijking met de controles van ten minste vier biologische replicaties, worden weergegeven als nummers naast de pijlen. Het massaspectrum van het geselecteerde blanco OCT-gebied in het hersenweefselgebied van zowel de controle- als de mutante vliegen wordt weergegeven in het bereik van MZ1 tot 1000 en MZ520 tot 900.De interferentie van OCT wordt geassocieerd met zowel ionenonderdrukkingsverschijnselen als overlappende signaalproblemen. Om de betrouwbaarheid van lipidomics-gegevens te behouden, zijn geschikte monstervoorbereiding, dissectie en cryo-sectie cruciaal. Na het uitvoeren van het Maldi-experiment kunnen de identiteiten van de lipiden worden geverifieerd via LCMS, ook bekend als vloeistofchromatografie, op massaspectrometrie gebaseerde lipodomica.Deze techniek krijgt moleculaire inzichten in de homeostase van hersenlipiden door gebruik te maken van het krachtige tot zachte modelsysteem dat de weg vrijmaakt om menselijke ziektegerelateerde metabole veranderingen in de hersenen te begrijpen.

sample-preparation-for-rapid-lipid-analysis-drosophila-brain-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Beschrijven we een nieuwe kwantitatieve lipidomics methode voor het identificeren van een groot aantal soorten lipiden in gist met behulp van survey-scan electrospray ionisatie massa spectrometrie (ESI / MS). Deze methode dan op dit moment beschikbare methoden voor lipide identificatie en kwantificering in de mogelijkheid om verschillende moleculaire vormen van lipiden, gevoeligheid en snelheid op te lossen.

Een kwantitatieve beoordeling van de gist Lipidome met behulp van electrospray ionisatie massaspectrometrie

In deze video-artikel stellen we een methode voor het isoleren van een of...

Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen

Dithranol (DT, 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) is eerder gerapporteerd als een MALDI matrix voor weefsel beeldvorming van kleine moleculen, protocollen voor het gebruik van DT voor de MALDI beeldvorming van endogene lipiden op de oppervlak van het weefsel secties door positieve-ion MALDI-MS op een ultrahoge resolutie quadrupool-FTICR instrument worden hier gegeven.

Dithranol als een matrix voor Matrix Assisted Laser desorptie / ionisatie Imaging op een Fourier transform ion cyclotron resonantie spectrometrie

Zebravissen ontwikkelen zich tot een waardevol model voor de verwerking van voedingslipiden en metabole ziekten. Beschreven worden protocollen van lipide-rijke larvale voeders, live beeldvorming van voedingsfluorescente lipide-analoga en kwantificering van voedselinname. Deze technieken kunnen worden toegepast op een verscheidenheid aan screenings-, beeldvormings- en hypothesegestuurde onderzoekstechnieken.

Vetrijke Feeding Paradigm voor larvale zebravis: Voeden, Live Imaging, en kwantificering van voedselinname

Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Het doel van dit protocol is om een ​​eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).

Middelgrote voorbereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten

Dit protocol wordt beschreven hoe voor te bereiden Drosophila larven op basis van GC-MS metabolomic analyse.

Voorbereiding van Drosophila larvale monsters van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)-gebaseerd metabolomica

Integriteit van de bloed-hersen barrière is essentieel voor de functie van het zenuwstelsel. In Drosophila melanogasterwordt de bloed-hersen barrière gevormd door gliacellen tijdens de late embryogenese. Dit protocol beschrijft methoden voor het testen van de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière in D. melanogaster -embryo's en derde instar larven.

Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de monstervoorbereiding bij het plannen van experimenten met MALDI MSI om metabole en moleculaire detectie in biologische monsters te maximaliseren.

Monstervoorbereiding voor metabole profilering met behulp van MALDI massaspectrometrie beeldvorming

Dit protocol schetst het gebruik van microMS voor fluorescentiegeleide, eencellige MALDI-2-massaspectrometrie, waardoor verbeterde moleculaire profilering van primaire neuronale cellen van ratten mogelijk is.

Fluorescentiegeleide matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie met lasergeïnduceerde postionisatiemassaspectrometrie van individuele neurale cellen van ratten

Leer MALDI-massaspectrometriebeeldvorming voor lipidenanalyse in Drosophila-hersenen. Deze methode maakt in situ-detectie mogelijk zonder labelen en ondersteunt betrouwbaar onderzoek naar metabolieten.

Monstervoorbereiding voor snelle lipidenanalyse in drosophila-hersenen met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie massaspectrometrie beeldvorming (Video) | JoVE Journal

Monstervoorbereiding voor snelle lipidenanalyse in drosophila-hersenen met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie massaspectrometrie beeldvorming

Meer video's verkennen