Monstervoorbereiding voor snelle lipidenanalyse in drosophila-hersenen met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie massaspectrometrie beeldvorming

Maldi MS-spectrometrie beeldvorming is een gevestigd en nuttig hulpmiddel om lipidenrijkdom en -distributie te identificeren en te visualiseren, zonder overmatige monstermodificatie. Het belangrijkste voordeel van Maldi-beeldvorming is het vermogen om de lipiden in situ te detecteren zonder etikettering en tegelijkertijd grote populatie monsters te analyseren. Oefening baart kunst.

Zorg ervoor dat je goed oefent voordat je de echte experimentele monsters verwerkt. Minimaliseer de voorbereidingstijd van het monster en vermijd besmetting tijdens de hele procedure. Voeg om te beginnen de optimale snijtemperatuur of OCT toe aan een plastic cryomold tot de helft van de diepte van de cryovorm terwijl u bubbelvorming voorkomt.

Laat de mal enkele minuten op een vlak oppervlak liggen en breng deze vervolgens over op droogijs. Houd de cryomold plat op het droogijs en laat de OCT een vlak en egaal oppervlak vormen. Wacht tot de OCT volledig is gestold in de mal.

Gebruik de bevroren OCT-stadia onmiddellijk, of bewaar ze bij min 80 graden Celsius. Na het verdoven van de volwassen vliegen Met behulp van koolstofdioxide, bereid een petrischaal met een stuk laboratoriumdoekje. Gebruik water om een deel van het doekje te bevochtigen om de statische elektriciteit te verminderen.

Houd het doekje half nat en half droog. Nadat u de vliegenkop onder een ontleedbare scope één hebt gesneden, verzamelt u vier tot vijf koppen en plaatst u ze op het droge gedeelte van het laboratoriumdoekje. Neem het OCT-podium van droogijs naar microscoop twee.

Breng de koppen onmiddellijk over naar de OCT-fase en rangschik ze snel, wat ongeveer 30 tot 60 seconden duurt om oct-smelten te voorkomen. Laat ongeveer een millimeter lege ruimte rond elk vliegenbrein om voldoende ondersteuning van de OCT en vier tot vijf millimeter lege ruimte vanaf de rand van het blok te garanderen om voldoende ruimte te bieden om de sectie te verwerken. Leg het OCT-podium terug op het droogijs en laat het ongeveer drie minuten aanblijven om ervoor te zorgen dat het OCT-podium bevroren en stevig blijft.

Nadat alle vliegenkoppen zijn uitgelijnd, laat je het OCT-podium nog vijf tot 10 minuten op droogijs zitten. Breng het OCT-stadium over van het droogijs naar een plat oppervlak en voeg vervolgens snel een grote hoeveelheid OCT-verbinding toe om alle monsters te bedekken en vul de hele cryomold, wat ongeveer drie seconden duurt. Breng de cryomold onmiddellijk terug naar droogijs en vries het hele OCT-blok met de ingebedde weefsels in.

Laat het OCT-podium nog vijf tot 10 minuten op het droogijs zitten. Label de monsters op de rand van de cryomold en bewaar de bevroren monsters bij min 80 graden Celsius totdat ze klaar zijn voor sectie. Bevestig de ITO-gecodeerde zijde door de geleidbaarheid van de ITO-dia's te testen met behulp van een voltmeter die is ingesteld op weerstand.

Markeer de zijkant met een weerstandsmeting als de kant om het weefsel aan te hechten. Label het en plaats altijd een laboratoriumdoekje op de bodem van de dia om diabesmetting te voorkomen. Laat de weefsels vervolgens gedurende 30 tot 45 minuten in evenwicht zijn in de cryostaatkamer.

Reinig de cryostaat, bij voorkeur met 70% ethanol. Veeg de rolplaat in fase af en verwijder de gebruikte messen. Gebruik extra schone doekjes om ervoor te zorgen dat de ethanol is verdampt en dat alle oppervlakken droog zijn voordat het snijden begint.

Pas vervolgens de temperatuur van de kop van het cryostatkamerzandmonster aan op basis van het type weefsel. Monteer het weefsel op de monsterhouder met OCT. Zorg ervoor dat u voldoende OCT gebruikt om de basis van het OCT-blok te bedekken en monteer het blok zo plat mogelijk.

Plaats een schoon mes op het podium en vergrendel het. Plaats de kop van het monster naar behoefte in de richting van het podium om de gewenste snijhoek te bereiken. Begin vervolgens met het snijden in dikke delen totdat het interessante gebied is gevonden.

Borstel de extra stukken voortdurend af met een voorgekoelde artiestenborstel om het podium schoon te houden. Pas de kamertemperatuur indien nodig enigszins aan en verander de dikte van de secties in 10 tot 12 micrometer zodra het gewenste gebied is bereikt. Verzamel zorgvuldig de gewenste sectie.

Neem een ITO-dia op kamertemperatuur en plaats deze over het gedeelte. Benader het gedeelte voorzichtig en plak het op de dia zonder sporen achter te laten op het cryostaatstadium. Plaats de schuif opzij in een rek of laboratoriumdoekje buiten de cryostaat tussen de verzamelingen van meerdere secties.

Als vergelijking tussen verschillende monsters van hetzelfde cohort gewenst is, plaatst u de secties van meerdere monsters op één dia, zodat ze tegelijkertijd kunnen worden geanalyseerd om variatie te minimaliseren. Indien nodig gescheiden van twee dia's, omdat de Maldi-doelhouder plaats biedt aan twee dia's in één keer. Transporteer de dia's in een vacuümbox naar een droogmiddel met uitdroging als onderste laag.

Drijf de dia's gedurende 30 tot 60 minuten onder een vacuüm en ga dan verder met de matrixafzetting. Gebruik twee vijf dihydroxybenzoëzuur, of DHB, in methanolwater als matrix. Plaats de glijbanen in een schuiftransporter en sluit de opening goed af met de wasfolie.

Verzegel met de ritszak. Doe het in een andere ritszak met droogmiddel. Label de buitenkant en verzend het monster met voldoende droge ogen naar de kernfaciliteiten van Maldi.

Gebruik voor de matrixafzetting 40 milligram per milliliter DHB en methanolwater als matrix en spuit het met behulp van een automatische HTX M5 matrixspuit. Gebruik een stikstofgasdruk van 10 PSI. Gebruik een Maldi-vluchttijd, MS-instrument en positieve ionmodus om een massaspectrum te verkrijgen.

Kalibreer het instrument door 0,5 microliter rode fosforemulsie in aceto Nitro op de ITO-dia's te plaatsen. Gebruik het spectra om het instrument te kalibreren in het massabereik van 100 tot 1000 MZ door een kwadratische kalibratiecurve toe te passen. Stel de laserspotdiameters in op medium, omdat dit het gemoduleerde straalprofiel is voor een rasterbreedte van 40 micrometer en verzamel beeldgegevens door 500 opnamen op te tellen met een laserherhalingssnelheid van 1000 hertz per arraypositie.

Noteer vervolgens de spectrale gegevens. Voer de analyse van de beeldgegevens uit met behulp van root mean square normalisatie om ionenbeelden te genereren met een bandbreedte van plus minus 0,10 Dalton. Lijn de spectra van zowel het OCT als het hersenweefsel uit hetzelfde experiment uit met behulp van de software om de overlappende pieken in de ionpressie-interferentie van de OCT te evalueren.

Verwerk ten slotte de MALDI-dia's met de weefselmonsters door hematoxyline en eosine, of H- en E-kleuring. Beelden van Maldi MS-analyse onthulden een algemene afname van het lipidegehalte in de LPR1 knock-out mutant hersenen. De representatieve H- en E-gekleurde volwassen vliegenhersenensecties worden hier weergegeven.

De lipidensoorten, hun respectievelijke MZ-waarden en de schalen van de heatmap worden ook aangegeven in deze afbeelding. De gemiddelde reductieplooi van de LPR1 knock-out mutant in vergelijking met de controles van ten minste vier biologische replicaties, worden weergegeven als nummers naast de pijlen. Het massaspectrum van het geselecteerde blanco OCT-gebied in het hersenweefselgebied van zowel de controle- als de mutante vliegen wordt weergegeven in het bereik van MZ1 tot 1000 en MZ520 tot 900.

De interferentie van OCT wordt geassocieerd met zowel ionenonderdrukkingsverschijnselen als overlappende signaalproblemen. Om de betrouwbaarheid van lipidomics-gegevens te behouden, zijn geschikte monstervoorbereiding, dissectie en cryo-sectie cruciaal. Na het uitvoeren van het Maldi-experiment kunnen de identiteiten van de lipiden worden geverifieerd via LCMS, ook bekend als vloeistofchromatografie, op massaspectrometrie gebaseerde lipodomica.

Deze techniek krijgt moleculaire inzichten in de homeostase van hersenlipiden door gebruik te maken van het krachtige tot zachte modelsysteem dat de weg vrijmaakt om menselijke ziektegerelateerde metabole veranderingen in de hersenen te begrijpen.