Name: Gebruik van de precision-cut lung slice om de contractiele regulatie van luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spier te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Leer de contractiele regulatie van luchtweg- en intrapulmonale arteriële gladde spier met precision-cut lung slices van muizen. Dit ex vivo model behoudt de in vivo fenotype voor mechanistisch onderzoek naar pulmonale fysiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidies, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Alle dierverzorging was in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van het Massachusetts General Hospital. Wild-type C57/B6 mannelijke muizen, 8 weken oud, werden gebruikt voor de huidige studie.
1. Experimentele voorbereiding
<ol><li>Bereid de werkoplossing voor.<ol>
<li>Bereid 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, met Ca2+ en Mg2+, en pH gebalanceerd met 20 mM HEPES, zie Materiaaltabel). Gebruik de HBSS-oplossing om de PCLS voor te bereiden en te verwerken. Houd de HBSS-oplossing koud op ijs bij het bereiden van PCLS'en.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid het kweekmedium van PCLS voor door Dulbecco's Modified Eagle Medium en F-12 (DMEM-F12) aan te vullen met een antibioticum-antimycotisch middel (1:100 volumeverhouding, zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Bereid 1,5% agarose en 6% gelatine-oplossing.<ol>
<li>Meng laagsmeltpunt (LMP) agarose of gelatinepoeder (zie materiaaltabel) met HBSS-oplossing afzonderlijk in steriele centrifugebuizen van 15 ml (of buizen van 50 ml als het volume van de oplossing >10 ml) tot de eindconcentraties. OPMERKING: Totaal volume agarose-oplossing = 5 ml / muis x aantal muizen; gelatine-oplossing = 2 ml/muis x aantal muizen.</li>
		<li>Verwarm de oplossingsbuizen in kokend water totdat het poeder volledig is opgelost. Bewaar zowel agarose als gelatine-oplossingen in een waterbad van 42 °C. OPMERKING: Een verwarmingslamp aan de snijtafel kan nuttig zijn om de werkomgeving warm te houden en te voorkomen dat de agarose-oplossing stolt voordat deze in de muizenlong wordt geïnjecteerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dompel alle dissectiegereedschappen onder, waaronder een paar ontleedscharen, twee paar gebogen micro-ontleedtangen en een paar hemostatische tangen in 70% ethanoloplossing gedurende ten minste 20 minuten voor sterilisatie.</li>
	<li>Houd een vibratoom klaar (zie Materiaaltabel) om het longweefsel in dunne plakjes te snijden.</li>
	<li>Houd een omgekeerde fasecontrastmicroscoop met een CCD-camera om de luchtweg- of vasculaire contractiele reacties te evalueren en een op maat gemaakte laserscanconfisculator (zie Materiaaltabel) om de Ca2+ signalering in pulmonale SMC'ste beoordelen 18.</li>
</ol>2. Opblazen van muizenlongen met agarose en gelatine-oplossing
<ol><li>Euthanaseer de muis.<ol>
<li>Plaats de muis in een plastic kamer (ongeveer 750 cm3) met 5% isofluraan. Houd de muis in de kamer totdat deze minstens 1 minuut stopt met ademen. OPMERKING: Andere primaire euthanasiemethoden, zoals intraperitoneale injectie van ketamine (240 mg / kg) en xylazine (32 mg / kg) 19 of pentobarbital (0,3 ml) 20, kunnen worden toegepast als alternatieven voor geïnhaleerd isofluraan.</li>
		<li>Plaats het muislichaam op een snijplank in rugligging. Bevestig het lichaam in positie door de staart, voorpoten en het hoofd vast te pinnen met 25 G spuitnaalden en ontsmet het lichaam met 70% ethanolspray.</li>
		<li>Knip de buik van de muis open met een chirurgische schaar (incisie, ~ 2 cm lang x 2 cm breed). Snijd vervolgens de abdominale aorta af om het bloedvolume uit te putten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blaas longlobben op volgens de onderstaande stappen.<ol>
<li>Open de borstholte voorzichtig langs het borstbeen en de bilaterale inferieure ribbenkast boven het middenrif en observeer de longlobben die instorten wanneer de borstholte zich opent.</li>
		<li>Verwijder een deel van bilaterale ventrale ribbenkasten om het hart bloot te stellen. Voorkom longschade door de scherpe schaarpunt weg te wijzen van het longweefsel.</li>
		<li>Gebruik een tang om de thymus en het zachte weefsel in de muizenhals te scheiden om de luchtpijp bloot te leggen.</li>
		<li>Snijd een klein gaatje (1,2 mm in diameter) in het bovenste uiteinde van de luchtpijp waardoor de punt van een 20 G Y-vormige IV-katheter kan worden doorgelaten (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Sluit de ene adapterpoort van de Y-vormige katheter aan op een spuit van 3 ml, voorgevuld met 0,5 ml lucht, en de andere poort met een spuit van 3 ml voorgevuld met 2 ml warme 1,5% agarose-oplossing (42 °C).</li>
		<li>Injecteer agarose-oplossing om de katheter te vullen en duw de katheter vervolgens door de voorgesneden opening in de luchtpijp gedurende een lengte van 5-8 mm.</li>
		<li>Injecteer de agarose-oplossing langzaam op ongeveer 1 ml / 5 s. De long zal uitzetten langs de proximale-tot-distale as. Stop de injectie wanneer de rand van elke longkwab is opgeblazen. OPMERKING: Blaas de long niet te veel op, omdat dit deze kan scheuren. Het volume van agarose-oplossing om de hele long van een jongvolwassen muis op te blazen is ongeveer 1,3 ± 0,1 ml.</li>
		<li>Injecteer 0,2-0,3 ml lucht uit de andere spuit om de resterende agarose in de katheter en geleidende luchtwegen naar de distale longblaasjesruimte te duwen.</li>
		<li>Sluit de luchtpijp met een gebogen hemostatische tang (zie Materiaaltabel).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vul de pulmonale vasculatuur in.<ol>
<li>Vul een spuit van 1 ml met warme gelatine van 6%. Sluit aan op een naald hoofdhuidaderkatheter, vul de katheter met gelatine-oplossing en prik vervolgens de rechterkamer dicht bij de inferieure wand met de naald.</li>
		<li>Duw de naald in de rechter ventrikel gedurende 2-3 mm lang en richt de naaldpunt op de hoofdlongslagader.</li>
		<li>Injecteer 0,2 ml gelatine-oplossing langzaam in de rechter ventrikel en pulmonale arteriële vaten. OPMERKING: De longlobben lijken iets bleker met de juiste gelatine-inflatie.</li>
		<li>Houd de naald 5 minuten na injectie op zijn plaats, koel de longlobben door ijskoude HBSS-oplossing op het hart en de longen te gieten en plaats het lichaam vervolgens met de dissectieplank in een koelkast van 4 °C of op ijs gedurende in totaal 10 minuten.</li>
		<li>Verwijder de long en het hart van de muis uit de omliggende bindweefsels met een schaar. Scheid vervolgens elke longkwab en bewaar ze in HBSS-oplossing op ijs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Doorsnede van longlobben tot dunne plakjes
<ol><li>Trim en bevestig de longkwab aan de bovenkant van de monsterkolom met secondelijm en oriënteer de kwab (figuur 1A, B) zodat de snijrichting loodrecht op de meeste luchtwegen van de hila tot het longoppervlak kan staan.</li>
	<li>Gebruik een vibratoom met een vers dun scheermesje om de longkwab in plakjes van 150 μm te snijden. Verzamel de plakjes in steriele petrischalen van 100 mm, voorgevuld met koude HBSS-oplossing. OPMERKING: Stel de juiste bewegingensnelheid en oscillatiefrequentie van het blad in voordat u begint met snijden. Een typische instelling voor een Compresstom is Snelheidsniveau 4 en Oscillatieniveau 4.</li>
	<li>Breng plakjes over naar petrischalen gevuld met DMEM/F-12 kweekmedium (20 plakjes/15 ml medium/schaal) en bewaar ze een nacht voor experimenten in een incubator van 37 °C. OPMERKING: Muis-PCLS'en kunnen ongeveer 7 dagen in cultuur worden gehouden zonder de contractiele reacties van de luchtwegen te verliezen17. De levensduur van longslagaders is niet grondig geëvalueerd. In onze waarneming behouden ze intacte structuur en vasoreactie gedurende ten minste 3 dagen in DMEM / F12-medium. Voor langdurige opslag kunnen pcls'en van muizen worden geplaatst in cryovialen gevuld met DMEM/F12-medium met 10% DMSO (5 plakjes in 1 ml medium per injectieflacon), ingevroren in een met isopropylalcohol gevulde container bij -80 °C 's nachts en gecryopreserveerd in vloeibare stikstof gedurende weken tot maanden21.</li>
</ol>4. Analyseren van contractiele reacties van intrapulmonale luchtwegen en slagaders
<ol><li>Plaats PCLS'en in een hbss-gevulde kweekplaat met 24 putten, één in elke put. Plaats de PCLS in het midden van de put en verwijder de HBSS-oplossing met een pipet.</li>
	<li>Zoek de doelluchtweg en het vat in de plak onder de microscoop en bedek de plak vervolgens met een nylon gaas met een voorgesneden centraal gat (2-3 mm in diameter) om het doelgebied bloot te leggen.</li>
	<li>Leg een holle metalen ring bovenop het gaas om de plakjes op hun plaats te houden (figuur 2A).</li>
	<li>Voeg 600 μL HBSS-oplossing toe om de PCLS onder te dompelen. Laat het plakje 10 minuten rusten en noteer vervolgens de basislijnbeelden van luchtwegen of bloedvaten.</li>
	<li>Induceer de luchtweg- of vasculaire contractie door de blanco HBSS-oplossing voorzichtig met een pipet uit te zuigen en 600 μL HBSS toe te voegen met een agonist, zoals 1 μM methacholine (MCh) of 10 nM endotheline (zie Materiaaltabel). OPMERKING: KCl-stimulatie als standaard voor gereedschapssets is niet vereist voorafgaand aan blootstelling aan methacholine of endotheline. 100 mM KCl-stimulatie in de luchtwegen van muizen induceert alleen een kleine en onregelmatige samentrekking van de luchtwegen (10% -15%)20. Evenzo is een priming methacholine-stimulatie niet verplicht, omdat we hebben bevestigd dat dezelfde agonist, bijvoorbeeld methacholine of serotonine, een vergelijkbare luchtwegcontractie veroorzaakt bij de eerste en herhaalde blootstellingen 20,22.</li>
	<li>Observeer de reactie onder de microscoop totdat de luminale gebiedsverandering een equilibratory status bereikt en registreer vervolgens de luchtweg- of vasculaire beelden voor analyse.</li>
	<li>Verwijder MCh of endotheline-oplossing met een pipet en voeg een nieuwe HBSS-oplossing van 600 μL toe met dezelfde agonistenconcentratie en een relaxant; observeer en registreer de luchtweg of vasculaire ontspanning.</li>
	<li>Kwantificeer de luchtweg- of vasculaire reactie volgens de onderstaande stappen.<ol>
<li>Laad de afbeeldingen in de door nih gesponsorde gratis software FIJI.</li>
		<li>Selecteer de polygoonselectie op de werkbalk om het luchtweg- of vasculaire lumen op elk frame te schetsen.</li>
		<li>Kies Analyseren > Metingen instellen > gebied.</li>
		<li>Kies Analyseren > meten om het interessegebied te kwantificeren. De resultaten worden in een apart venster weergegeven voor statistische analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Analyse van Ca2+ signalering van luchtweg- of vasculaire SMC's
<ol><li>Bereid de Ca2+ kleurstoflaadbuffer voor.<ol>
<li>Los Ca2+ kleurstof op, Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (zie Materiaaltabel), 50 μg (één injectieflacon) met 10 μL DMSO.</li>
		<li>Los 0,2 g Pluronic F-12 poeder (zie materiaaltabel) op in 1 ml DMSO om een pluronische oplossing van 20% te genereren.</li>
		<li>Meng 10 μL 20% pluronische oplossing met 10 μL Ca2+ kleurstof-DMSO-oplossing.</li>
		<li>Maak Ca2+ kleurstoflaadbuffer door 20 μL van het mengsel toe te voegen aan 2 ml HBSS-oplossing met 200 μM sulfobroomftaalline (zie materiaaltabel).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats 15 muis-PSOS'en in 2 ml Ca2+ laadbuffer en incubeer bij 30 °C gedurende 1 uur. Verplaats vervolgens de plakjes naar 2 ml HBSS-oplossing met 100 μM sulfobroomphthaleïne gedurende nog eens 30 minuten voor fluorescerende verestering van kleurstoffen bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Detecteer Ca2+ signalering van SMC's.<ol>
<li>Leg Ca2+ plakjes met kleurstof op een groot dekglas.</li>
		<li>Vul een spuit van 3 ml met hoogvacuüm siliconenvet. Knijp het vet door een stompe naald van 18 G om twee parallelle lijnen over het afdekglas boven en onder de plak te tekenen.</li>
		<li>Bedek de plak met een nylon gaas tussen twee vetlijnen. Plaats het tweede afdekglas op het gaas om een kamer te genereren die aan de zijkanten is afgesloten met vet (figuur 3A). OPMERKING: Het nylon gaas is essentieel om de plak aan de onderste coverslip te houden en zo binnen de werkafstand van een omgekeerd objectief met een hoge magnitude te blijven, zoals 40x olie.</li>
		<li>Voeg HBSS- of agonistenoplossing vanaf het ene uiteinde toe aan de kamer door handmatig of via een perfusiesysteem te pipetteren. Verwijder de vloeistof uit de kamer door aan het andere uiteinde te zuigen met tissuepapier of vacuüm in het geval van continue vloeistofperfusie.</li>
		<li>Plaats de PCLS-kamer op het microscooppodium. Detecteer de Ca2+ signalering van SMC23 met een op maat gemaakte resonant scanning confocale microscoop met een laserscansnelheid van 15 of 30 beelden/s. OPMERKING: Als alternatief kan een high-speed commerciële laser scanning confocale microscoop, op grote schaal beschikbaar op dit moment, worden toegepast in de Ca2 + signaleringstest van pulmonale SMC's in PCLS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kwantificeer de Ca2+ fluorescentie in SMC's.<ol>
<li>Laad de opgenomen afbeeldingsreeks naar FIJI en kies de afbeelding > Type > 8-bits grijswaarden.</li>
		<li>Selecteer de rechthoekige selectie op de werkbalk en definieer een interessegebied van 5 pixels x 5 pixels (ROI) in een cel met gladde spieren.</li>
		<li>Kies Metingen analyseren > Metingen instellen > gemiddelde grijswaarde , die de ca2+ fluorescentie-intensiteit vertegenwoordigt.</li>
		<li>Als de positie van een ROI verandert met SMC-contractie, kiest u Analyseren > de Ca2+ fluorescerende intensiteit frame voor frame meten.</li>
		<li>Als de ROI van SMC op een vergelijkbare positie blijft in een stapel afbeeldingen, kiest u Afbeelding > stapels > Meetstapel van de Ca2+ fluorescerende intensiteit. OPMERKING: Een op maat geschreven macro kan worden aangesloten om de ROI binnen de SMC bij te houden wanneer deze met krimp in een afbeeldingsstack beweegt en meet automatisch de Ca2+ intensiteit (grijswaarde) van ROI frame voor frame.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+smooth+muscle+contributions+to+airway+structure+and+function%3A+implications+for+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).</li>
<li>Lechartier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+diversity+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+arterial+hypertension%3A+implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy.</a> Chest. 161 (1), 219-231 (2022).</li>
<li>Doeing, D. C., Solway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+smooth+muscle+in+the+pathophysiology+and+treatment+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma.</a> Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).</li>
<li>McGovern, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172(2013).</li>
<li>Bikou, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+characterization+of+pulmonary+hypertension+in+mice+using+the+hypoxia%2FSU5416+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252(2020).</li>
<li>Stenmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+diverse+changes+in+the+functional+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).</li>
<li>Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+and+Ca2%2B+signaling+of+smooth+muscle+cells+in+different+generations+of+mouse+airways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).</li>
<li>Chin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+smooth+muscle+is+structurally+and+mechanically+similar+to+that+of+other+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species.</a> The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mediators+mediate+airway+smooth+muscle+contraction+through+a+G+protein-coupled+receptor-transmembrane+protein+16A-voltage-dependent+Ca%282%2B%29+channel+axis+and+contribute+to+bronchial+hyperresponsiveness+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).</li>
<li>Currigan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasoconstrictor+responses+to+vasopressor+agents+in+human+pulmonary+and+radial+arteries%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study.</a> Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).</li>
<li>Halayko, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+differentiation+paths+in+airway+smooth+muscle+culture%3A+induction+of+functionally+contractile+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).</li>
<li>Worth, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganisation+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).</li>
<li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li>
<li>Placke, M. E., Fisher, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+peripheral+lung+organ+culture-a+model+for+respiratory+tract+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).</li>
<li>Fisher, G. L., Placke, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+lung+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">In vitro models of lung toxicity.</a> Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).</li>
<li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+arterioles+is+determined+by+the+frequency+of+Ca2%2B+oscillations+induced+by+5-HT+and+KCl%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480(2020).</li>
<li>Sanderson, M. J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Video-rate confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).</li>
<li>Kolbe, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cytokine+induction+upon+pseudomonas+aeruginosa+infection+in+murine+precision+cut+lung+slices+depends+on+sensing+of+bacterial+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability.</a> Frontiers in Immunology. 11, 598636(2020).</li>
<li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT%2C+ACH%2C+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li>
<li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).</li>
<li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+Ca2%2B+sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li>
<li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795(2014).</li>
<li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li>
<li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2%2B+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li>
<li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li>
<li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li>
<li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NT4%2FTrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162(2019).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lung+tissue+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li>
<li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li>
<li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li>
<li>Mondoñedo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566(2020).</li>
<li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li>
<li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De voorbereiding van PCLS omvat verschillende kritieke stappen. Ten eerste is het essentieel om de longkwab homogeen op te blazen om de variatie van weefselstijfheid door ongelijke agaroseverdeling te voorkomen. Aangezien de vloeistof snel in dunne katheters of luchtwegen gels bij een temperatuur onder 37 °C, kan het resulterende vuldefect in het distale longveld de ongelijkheid van longweefselstijfheid vergroten en weefselscheuren veroorzaken tijdens de vibratomsectie. Daarom kan worden geoefend om de laagsmeltende agar...

Gladde spiercel (SMC) is een belangrijk structureel celtype in de longen, voornamelijk woonachtig in de mediawand van luchtwegen en longvaten. SMC's trekken samen om het luminale kaliber te veranderen, waardoor de lucht- en bloedstroomwordt geregeld 1,2. Daarom is contractiele regulatie van SMC's essentieel om de homeostase van luchtventilatie en pulmonale circulatie te behouden. Afwijkende SMC-contractiliteit daarentegen veroorzaakt obstructieve luchtweg- of pulmonale vaatziekten zoals astma en pulmonale arteriële hypertensie. De functionele beoordeling van long-SMC's is echter uitgedaagd door beperkte toegang tot het longweefsel, met name die kleine luchtwegen en microvessels in het distale deel van de long 2,3. Huidige oplossingen nemen hun toevlucht tot indirecte testen, zoals het meten van luchtstroomweerstand door Flexivent om luchtwegvernauwing te weerspiegelen, en het controleren van pulmonale arteriële bloeddruk door rechterhartkatheterisatie om pulmonale vasocontractie te beoordelen 4,5. Deze indirecte testen hebben echter meerdere nadelen, zoals verward worden door structurele factoren, het niet vastleggen van de ruimtelijke diversiteit van luchtweg- of vasculaire reacties in de hele longschaal 6,7, en ongeschikt voor de mechanistische studie van contractiele regulatie op cellulair niveau. Daarom zijn alternatieve benaderingen met behulp van geïsoleerde primaire cellen, luchtpijp /bronchiën spierstrips 8,9 of grote vasculaire segmenten10 toegepast voor de SMC-studie in vitro. Toch hebben deze methoden ook beperkingen. Een snelle fenotypische aanpassing van primaire SMC's in de kweekconditie11,12 maakt het bijvoorbeeld problematisch om bevindingen uit celcultuur naar in vivo instellingen te extrapoleren. Bovendien vertegenwoordigt het contractiele fenotype van SMC's in de geïsoleerde proximale luchtweg- of vasculaire segmenten mogelijk niet de SMC's in de distale long 6,7. Bovendien blijft de spierkrachtmeting op weefselniveau losgekoppeld van moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die essentieel zijn voor mechanistisch inzicht in contractiele regulatie.
Precision-cut lung slice (PCLS), een levend longweefselgedeelte, biedt een ideaal ex vivo hulpmiddel om pulmonale SMC's te karakteriseren in een bijna in vivo micro-omgeving (d.w.z. bewaarde multicellulaire architectuur en interactie)13. Sinds Drs. Placke en Fisher voor het eerst de bereiding van longplakken van agarose-opgeblazen ratten- en hamsterlongen introduceerden in de jaren1980 14,15, is deze techniek voortdurend geavanceerd om PCLS'en te voorzien van hogere kwaliteit en grotere veelzijdigheid voor biomedisch onderzoek. Een belangrijke verbetering is de verbetering van pulmonale arteriële conservering door gelatine-infusie naast longinflatie met agarose via de luchtpijp. Als gevolg hiervan worden zowel de luchtweg als de longslagader intact gehouden in de PCLS voor ex vivo beoordeling16. Bovendien is de PCLS levensvatbaar voor een langere tijd in cultuur. Bijvoorbeeld, muis PCLS'en hadden geen significante verandering in de levensvatbaarheid van de cel en het metabolisme gedurende minimaal 12 dagen in cultuur, evenals, ze behielden de contractiliteit van de luchtwegen gedurende maximaal 7 dagen17. Bovendien houdt PCLS luchtwegen of bloedvaten van verschillende grootte bij voor contractie- en ontspanningstests. Bovendien kan intracellulaire Ca2+ signalering van SMC's, de determinante factor van celcontractiliteit, worden getest met Ca2+ reporterkleurstoffen afgebeeld door een confocale of 2-fotonenmicroscoop13.
Gezien de uitgebreide toepassing van het muismodel in longonderzoek, wordt hier een gedetailleerd protocol beschreven voor het voorbereiden van muis PCLS met intacte luchtwegen en intrapulmonale slagaders voor ex vivo longonderzoek. Met behulp van de voorbereide PCLS'en hebben we vervolgens aangetoond hoe we de luchtweg- en pulmonale arteriële reacties op vernauwende of ontspannende stimuli kunnen evalueren. Daarnaast wordt ook de methode beschreven om de PCLS te laden met Ca2+ reporterkleurstof en vervolgens Ca2+ signalering van SMC's geassocieerd met contractiele of relaxante reacties in beeld te brengen.

<table><tbody><tr><td>1 mL spuit</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>15 mL steriele centrifugeerbuizen</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>3 mL spuit</td><td>BD</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>50 mL steriele centrifugeerbuizen</td><td>Celltreat</td><td>229422</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl-bèta-methacholine</td><td>Millipore Sigma</td><td>62-51-1</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-anitmycotic</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Nikon</td><td>Nikon Ds-Ri2 camera</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td><td></td></tr><tr><td>Cryogene flacons</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Op maat gebouwde laser scanning confocale microscoop</td><td></td><td></td><td>Details in Verwijzing 18</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-092-CM</td><td></td></tr><tr><td>Endotheline 1</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Fijne dissectieschaart</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9702861</td><td></td></tr><tr><td>Invriescontainer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine uit varkenshuid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatic forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-117</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Hoog vacuüm siliconenvet</td><td>Fisher Scientific</td><td>146355d</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Metalen ringen</td><td>Home Depot Product Authority</td><td>800442</td><td>Everbilt Flat Washers #10</td></tr><tr><td>Micro-dissectie forceps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>Naald voor scalpaders (25 G)</td><td>EXELINT</td><td>26708</td><td></td></tr><tr><td>NOC-5</td><td>Cayman Chemical</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Nylon gaas</td><td>Component Supply</td><td>U-CMN-300</td><td></td></tr><tr><td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td><td>Life Technologies</td><td>o-6807</td><td></td></tr><tr><td>Phasecontrastmicroscoop</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TS 100</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Thermo Fisher</td><td>P-6867</td><td></td></tr><tr><td>Veiligheidsmesjes</td><td>Personna</td><td></td><td>Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count</td></tr><tr><td>Sulfobromoftaleïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0252</td><td></td></tr><tr><td>Superlijm</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td>Krazy Glue, All purpose</td></tr><tr><td>Ultrapure lage smeltpunt agarose</td><td>Thermo Fisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vibratoom</td><td>Precisionary</td><td>VF 310-0Z</td><td></td></tr><tr><td>Vibratoom koelblok</td><td>Precisionary</td><td>SKU-VM-CB12.5-NC</td><td></td></tr><tr><td>Vibratoom monsterbuis</td><td>Precisionary</td><td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td><td></td></tr><tr><td>Y-vormige IV-katheter</td><td>BD</td><td>383336</td><td>BD Saf-T-Intima closed IV catheter</td></tr></tbody></table>

gebruik van de precision-cut lung slice om de contractiele regulatie van luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spier te bestuderen

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Gladde spiercellen (SMC) bemiddelen de samentrekking van de luchtwegen en de intrapulmonale slagader om respectievelijk de luchtstroomweerstand en de pulmonale circulatie te wijzigen, waardoor ze een cruciale rol spelen in de homeostase van het longsysteem. Deregulering van SMC-contractiliteit draagt bij aan verschillende longziekten, waaronder astma en pulmonale hypertensie. Vanwege de beperkte toegang tot weefsel en een gebrek aan kweeksystemen om in vivo SMC-fenotypen te behouden, blijven moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de gedereguleerde SMC-contractiliteit bij deze ziekten echter volledig geïdentificeerd. De precision-cut lung slice (PCLS) biedt een ex vivo model dat deze technische problemen omzeilt. Als een levende, dunne longweefselsectie behoudt de PCLS SMC in een natuurlijke omgeving en maakt het in situ tracking van SMC-contractie en intracellulaire Ca2 + -signalering mogelijk die de SMC-contractiliteit reguleert. Hier wordt een gedetailleerd PCLS-voorbereidingsprotocol voor muizen verstrekt, dat intacte luchtwegen en intrapulmonale slagaders behoudt. Dit protocol omvat twee essentiële stappen voordat de longkwab aan snijwonden wordt onderworpen: het opblazen van de luchtweg met laagsmeltpunt agarose door de luchtpijp en het vullen van longvaten met gelatine door de rechter ventrikel. De PCLS bereid met behulp van dit protocol kan worden gebruikt voor bioassays om Ca2+-gemedieerde contractiele regulatie van SMC in zowel de luchtwegen als de intrapulmonale arteriële compartimenten te evalueren. Toegepast op muismodellen van luchtwegaandoeningen maakt dit protocol het functioneel onderzoek van SMC mogelijk, waardoor inzicht wordt verkregen in het onderliggende mechanisme van SMC-contractiliteitsderegulatie bij ziekten.

Pcls-preparaat bij muizen met behoud van intacte intrapulmonale luchtwegen en slagaders Een 150 μm dikke PCLS werd waargenomen onder de omgekeerde fase-contrastmicroscoop. In muizenlongen gaan geleidende luchtwegen gepaard met intrapulmonale slagaders, die van de hilus naar de perifere long lopen. Een representatieve pulmonale luchtweg-slagaderbundel in een muis PCLS is weergegeven in figuur 2B. De luchtweg kan gemakkelijk worden geïdentificeerd door kubusvormige epitheel...

Het huidige protocol beschrijft het voorbereiden en gebruiken van precisiegesneden longplakken van muizen om de luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spiercontractiliteit in een bijna in vivo omgeving te beoordelen.

Gebruik van de precision-cut lung slice om de contractiele regulatie van luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spier te bestuderen

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

De PCLS ondersteunt de beoordeling van de activiteit van luchtweg- en vasculaire gladde spiercellen in een bijna intacte weefselomgeving, waardoor een waardevol ex vivo model voor longonderzoek wordt geboden. In termen van onderzoek naar gladde spieren behouden de nauwkeurig gesneden longplakken het in vivo fenotype van gladde spiercellen en hun interactie met omliggende structuren terwijl ze toegang bieden tot gladde spiercellen, wat belangrijk is voor een mechanistische studie op cellulair niveau. Plaats om te beginnen het muislichaam op een snijplank in rugligging.Pin de staart, voorpoten en kop vast met 25G spuitnaalden en ontsmet het lichaam met 70% ethanol. Open de borstholte voorzichtig langs het borstbeen en bilaterale inferieure ribbenkast boven het diafragma. Richt vervolgens de scherpe schaarpunt weg van het longweefsel en verwijder een deel van de bilaterale ventrale ribbenkasten om het hart bloot te leggen.Merk op dat de longlobben instorten wanneer de borstholte opengaat. Gebruik een schaar om zacht weefsel in de muizenhals te verwijderen om de luchtpijp bloot te leggen. Maak aan het bovenste uiteinde van de luchtpijp een klein gat met een diameter van 1,2 millimeter dat het passeren van een 20G Y-vormige IV-katheterpunt mogelijk moet maken.Sluit de ene adapterpoort van de Y-vormige katheter aan op een spuit van 3 milliliter, voorgevuld met 0,5 milliliter lucht en de andere poort met een spuit van 3 milliliter, voorgevuld met 2 milliliter 1,5% agarose-oplossing verwarmd tot 42 graden Celsius. Injecteer agarose-oplossing om de katheter te vullen en duw de katheter vervolgens door de opening in de luchtpijp tot 5 tot 8 millimeter. Injecteer de agarose-oplossing langzaam met een snelheid van 1 milliliter per 5 seconden.Merk op dat de long uitzet langs de proximale tot distale as. Stop de injectie wanneer de rand van elke longkwab is opgeblazen. Injecteer vervolgens 0,2 tot 0,3 milliliter lucht uit de andere spuit om de resterende agarose in geleidende luchtwegen naar de distale longblaasjesruimte te duwen.Clip sloot de luchtpijp met een paar gebogen hemostatische tangen. Om de pulmonale vasculatuur te vullen, vult u een spuit van 1 milliliter met warme 6% gelatine en sluit u deze aan op een naald-hoofdhuidaderkatheter. Vul de katheter in met gelatine-oplossing en prik vervolgens de rechter ventrikel dicht bij de inferieure wand met de naald.Duw de naald gedurende 2 tot 3 millimeter in de rechter ventrikel en richt de naaldpunt op de hoofdlongslagader. Injecteer ongeveer 0,2 milliliter gelatine-oplossing langzaam in de rechter ventrikel en pulmonale arteriële vaten. Houd de naald vijf minuten na injectie op zijn plaats en koel de longlobben door ijskoude HBSS-oplossing op het hart en de longen te gieten en plaats het lichaam in een koelkast.Verwijder na deze stap de long en het hart van de muis uit de omliggende bindweefsels met een schaar. Scheid vervolgens elke longkwab en bewaar ze in HBSS-oplossing op ijs. Trim de longkwab en oriënteer deze zodanig dat de snijrichting loodrecht staat op de meeste luchtwegen van de hila tot het longoppervlak.Bevestig het bovenop de monsterkolom met superlijm. Gebruik een vibratoom met een vers dun scheermesje om de longkwab in plakjes van 150 micrometer te snijden. Verzamel de plakjes in steriele petrischalen voorgevuld met koude HBSS-oplossing.Breng de plakjes over in petrischalen gevuld met DMEM/F-12 kweekmedium. Plaats de gerechten een nacht voor de experimenten in een incubator van 37 graden Celsius. Plaats een enkele precisiegesneden longschijf in elk putje van een 24-putjes kweekplaat gevuld met HBSS.Plaats het plakje in het midden van het putje en verwijder vervolgens de HBSS-oplossing met een pipet. Zoek onder een microscoop de doelluchtweg en het vat in de plak en bedek deze vervolgens met een nylon gaas met een voorgesneden centraal gat om het beoogde luchtwegvatgebied bloot te leggen. Leg een holle metalen ring bovenop het gaas om de plakjes op hun plaats te houden.Voeg vervolgens 600 microliter HBSS-oplossing toe om de plakjes onder te dompelen. Neem na 10 minuten de basislijnafbeeldingen op. Om de luchtweg- of vasculaire contractie te induceren, verwijdert u voorzichtig de HBSS-oplossing met een pipet en voegt u 600 microliter HBSS toe met een agonist.Om de calciumkleurstofbelastingsbuffer te bereiden, lost u eerst 50 microgram kleurstof op met 10 microliter DMSO en 0,2 gram Pluronic F-12-poeder in 1 milliliter DMSO. Meng 10 microliter van de Pluronic-oplossing met 10 microliter calciumkleurstofoplossing. Voeg dit mengsel toe aan 2 milliliter HBSS-oplossing met 200 micromolair sulfobroomftaleïne.Plaats vervolgens 15 nauwkeurig gesneden longplakken in 2 milliliter calciumlaadbuffer en incubeer gedurende een uur bij 30 graden Celsius, gevolgd door gedurende 30 minuten incuberen in HBSS met 100 micromolaire sulfobroomftaleïne. Plaats vervolgens met calciumkleurstof geladen plakjes op een groot afdekglas. Vul hoogvacuüm siliconenvet in een spuit van 3 milliliter bevestigd aan een stompe naald van 18 G of een pipetpunt van 200 microliter en teken twee parallelle lijnen over het afdekglas, boven en onder de plak.Bedek de plak met een nylon gaas tussen twee vetlijnen. Plaats het tweede afdekglas op het gaas om een kamer te genereren. Voeg HBSS of een agonistoplossing aan het ene uiteinde met een pipet toe aan de kamer.Verwijder de vloeistof uit de kamer door aan het andere uiteinde te zuigen met tissuepapier. De kamer van de plak is nu klaar voor de calciumbeeldvorming met een high speed laser scanning confocale microscoop. Pulmonale luchtwegslagaderbundels werden waargenomen in nauwkeurig gesneden longplakken met een dikte van 150 micrometer onder een fasecontrastmicroscoop.In rusttoestand werd een luchtweg geïdentificeerd door kubusvormige epitheelcellen met een nabijgelegen longslagader. Na blootstelling aan methacholine werd het luminale gebied verminderd, terwijl de longslagader geen reactie op de stimuli vertoonde. Luchtwegcontractiele responsen werden gekwantificeerd door het percentage luminale gebiedsreductie en vertoonden vergelijkbare dosisafhankelijke responsen in één dag- en vijfdaagse culturen.Bij het bereiken van het perifere longveld vertakken de geleidende luchtwegen zich in ademhalingskanalen en zakjes rond de kleine intra-acinaire arteriolen. Bij blootstelling aan endotheel vernauwen zowel de luchtwegen als de longslagaders, gevolgd door noc-5 geïnduceerde ontspanning. In de rusttoestand vertoonden de met calciumkleurstof geladen plakjes een lage fluorescentie in de gladde spiercellen van de luchtwegen en het vasculaire systeem onder een confocale fluorescerende microscoop.Bij blootstelling aan agonisten steeg de calciumfluorescentie-intensiteit in de cellen en verspreidde zich naar de hele cel, wat correleerde met de oscillerende signalen. Qua techniek is het essentieel om de long met agarose homogeen op te blazen en snelle of overmatige agarose-injectie te vermijden. Duw altijd lucht aan het einde om de agarose van de geleidende luchtweg naar de distale longblaasjesruimte te spoelen.Samenvattend, met behulp van de precisie-gesneden longplakjescultuur, kan men een speciale verscheidenheid aan pulmonale gladde spierfuncties bieden en de deregulatie van gladde spieren in vitro modelleren. Het biedt ook een ideaal platform om novo vaatverwijdende of bronchodilatator medicijnen te screenen.

utilizing-precision-cut-lung-slice-to-study-contractile-regulation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hypoxische pulmonale vasoconstrictie (HPV) is een belangrijk fysiologisch fenomeen waarbij bij alveolaire hypoxie longperfusie wordt afgestemd op beademing. Het belangrijkste vasculaire segment dat bijdraagt aan HPV is de intra-acinaire slagader. Hier beschrijven we ons protocol voor de analyse van HPV van muriene longvaten met diameters van 20-100 μm.

Videomorfometrische analyse van hypoxische pulmonale vasoconstrictie van intrapulmonale slagaders met behulp van murineprecisie gesneden longschijfjes

We beschrijven een werkwijze voor het precisie-cut Lung Schijfjes (PCLS) en immunokleuring ze naar de lokalisatie van diverse immuun celsoorten te visualiseren in de longen. Ons protocol kan worden uitgebreid tot de locatie en de functie van vele verschillende celtypen te visualiseren onder verschillende omstandigheden.

Precisie-cut Mouse Lung Slices Live Pulmonary visualiseren van dendritische cellen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het behoud van de vasculaire contractiliteit van PCLS-muizenlongweefsel, wat resulteert in een geavanceerd driedimensionaal beeld van de pulmonale vasculatuur en de luchtwegen, die tot 10 dagen kunnen worden bewaard en die vatbaar zijn voor tal van procedures.

Precisie gesneden longplakken als een efficiënt hulpmiddel voor ex vivo longvatstructuur en contractiliteitsstudies

Vasculaire reacties van arteriële pulmonale circulatie kunnen worden onderzocht met behulp van intrapulmonale slagader (IPA) en vasculaire gladde spiercellen (VSMC's). De huidige studie beschrijft de isolatie van IPA in detail en de protocollen die worden gebruikt voor het onderzoeken van vasorelaxatie als reactie op fysiologische stimuli.

Isolatie van intrapulmonale slagader en gladde spiercellen om vasculaire reacties te onderzoeken

Het testen van visuele gevoeligheid bij hagedissen met behulp van een operante conditionering paradigma dat het afspelen van video van de random-dot kinematograms en computer-gegenereerde ongewervelde dieren in dienst heeft.

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Computer-gegenereerde prikkels met behulp van de Jacky draak als een model.

Door de computer gegenereerde Animal Model Stimuli

Focus Ca 2 + Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel

Deze video laat zien en vergelijkt twee experimentele modellen te bestuderen van de ontwikkeling van obliteratieve luchtwegaandoeningen (OAD) in muizen, de heterotope en orthotope tracheale transplantatie model.

Heterotope en orthotope Tracheale transplantatie in Muizen worden gebruikt als modellen voor de ontwikkeling van de obliterans luchtwegaandoeningen Study

De navelstrengen worden gebruikt om de gladde spiercellen isoleren door op verschillende manieren. In dit werk gebruikten we de enzymatische behandeling voor geïsoleerde gladde spiercellen.

Isolatie van de Mens Umbilical arteriële gladde spiercellen (HUASMC)

Inspanningen om de katalytische subeenheid van telomerase isoleren, tert, in voldoende hoeveelheden voor structurele studies, is voldaan met beperkt succes voor meer dan een decennium. Hier presenteren we methoden voor de isolatie van het recombinante Tribolium castaneum TERT...

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Leer de contractiele regulatie van luchtweg- en intrapulmonale arteriële gladde spier met precision-cut lung slices van muizen. Dit ex vivo model behoudt de in vivo fenotype voor mechanistisch onderzoek naar pulmonale fysiologie.

Gebruik van de precision-cut lung slice om de contractiele regulatie van luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spier te bestuderen (Video) | JoVE Journal

Gebruik van de precision-cut lung slice om de contractiele regulatie van luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spier te bestuderen

Meer video's verkennen