Gebruik van de precision-cut lung slice om de contractiele regulatie van luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spier te bestuderen

De PCLS ondersteunt de beoordeling van de activiteit van luchtweg- en vasculaire gladde spiercellen in een bijna intacte weefselomgeving, waardoor een waardevol ex vivo model voor longonderzoek wordt geboden. In termen van onderzoek naar gladde spieren behouden de nauwkeurig gesneden longplakken het in vivo fenotype van gladde spiercellen en hun interactie met omliggende structuren terwijl ze toegang bieden tot gladde spiercellen, wat belangrijk is voor een mechanistische studie op cellulair niveau. Plaats om te beginnen het muislichaam op een snijplank in rugligging.

Pin de staart, voorpoten en kop vast met 25G spuitnaalden en ontsmet het lichaam met 70% ethanol. Open de borstholte voorzichtig langs het borstbeen en bilaterale inferieure ribbenkast boven het diafragma. Richt vervolgens de scherpe schaarpunt weg van het longweefsel en verwijder een deel van de bilaterale ventrale ribbenkasten om het hart bloot te leggen.

Merk op dat de longlobben instorten wanneer de borstholte opengaat. Gebruik een schaar om zacht weefsel in de muizenhals te verwijderen om de luchtpijp bloot te leggen. Maak aan het bovenste uiteinde van de luchtpijp een klein gat met een diameter van 1,2 millimeter dat het passeren van een 20G Y-vormige IV-katheterpunt mogelijk moet maken.

Sluit de ene adapterpoort van de Y-vormige katheter aan op een spuit van 3 milliliter, voorgevuld met 0,5 milliliter lucht en de andere poort met een spuit van 3 milliliter, voorgevuld met 2 milliliter 1,5% agarose-oplossing verwarmd tot 42 graden Celsius. Injecteer agarose-oplossing om de katheter te vullen en duw de katheter vervolgens door de opening in de luchtpijp tot 5 tot 8 millimeter. Injecteer de agarose-oplossing langzaam met een snelheid van 1 milliliter per 5 seconden.

Merk op dat de long uitzet langs de proximale tot distale as. Stop de injectie wanneer de rand van elke longkwab is opgeblazen. Injecteer vervolgens 0,2 tot 0,3 milliliter lucht uit de andere spuit om de resterende agarose in geleidende luchtwegen naar de distale longblaasjesruimte te duwen.

Clip sloot de luchtpijp met een paar gebogen hemostatische tangen. Om de pulmonale vasculatuur te vullen, vult u een spuit van 1 milliliter met warme 6% gelatine en sluit u deze aan op een naald-hoofdhuidaderkatheter. Vul de katheter in met gelatine-oplossing en prik vervolgens de rechter ventrikel dicht bij de inferieure wand met de naald.

Duw de naald gedurende 2 tot 3 millimeter in de rechter ventrikel en richt de naaldpunt op de hoofdlongslagader. Injecteer ongeveer 0,2 milliliter gelatine-oplossing langzaam in de rechter ventrikel en pulmonale arteriële vaten. Houd de naald vijf minuten na injectie op zijn plaats en koel de longlobben door ijskoude HBSS-oplossing op het hart en de longen te gieten en plaats het lichaam in een koelkast.

Verwijder na deze stap de long en het hart van de muis uit de omliggende bindweefsels met een schaar. Scheid vervolgens elke longkwab en bewaar ze in HBSS-oplossing op ijs. Trim de longkwab en oriënteer deze zodanig dat de snijrichting loodrecht staat op de meeste luchtwegen van de hila tot het longoppervlak.

Bevestig het bovenop de monsterkolom met superlijm. Gebruik een vibratoom met een vers dun scheermesje om de longkwab in plakjes van 150 micrometer te snijden. Verzamel de plakjes in steriele petrischalen voorgevuld met koude HBSS-oplossing.

Breng de plakjes over in petrischalen gevuld met DMEM/F-12 kweekmedium. Plaats de gerechten een nacht voor de experimenten in een incubator van 37 graden Celsius. Plaats een enkele precisiegesneden longschijf in elk putje van een 24-putjes kweekplaat gevuld met HBSS.

Plaats het plakje in het midden van het putje en verwijder vervolgens de HBSS-oplossing met een pipet. Zoek onder een microscoop de doelluchtweg en het vat in de plak en bedek deze vervolgens met een nylon gaas met een voorgesneden centraal gat om het beoogde luchtwegvatgebied bloot te leggen. Leg een holle metalen ring bovenop het gaas om de plakjes op hun plaats te houden.

Voeg vervolgens 600 microliter HBSS-oplossing toe om de plakjes onder te dompelen. Neem na 10 minuten de basislijnafbeeldingen op. Om de luchtweg- of vasculaire contractie te induceren, verwijdert u voorzichtig de HBSS-oplossing met een pipet en voegt u 600 microliter HBSS toe met een agonist.

Om de calciumkleurstofbelastingsbuffer te bereiden, lost u eerst 50 microgram kleurstof op met 10 microliter DMSO en 0,2 gram Pluronic F-12-poeder in 1 milliliter DMSO. Meng 10 microliter van de Pluronic-oplossing met 10 microliter calciumkleurstofoplossing. Voeg dit mengsel toe aan 2 milliliter HBSS-oplossing met 200 micromolair sulfobroomftaleïne.

Plaats vervolgens 15 nauwkeurig gesneden longplakken in 2 milliliter calciumlaadbuffer en incubeer gedurende een uur bij 30 graden Celsius, gevolgd door gedurende 30 minuten incuberen in HBSS met 100 micromolaire sulfobroomftaleïne. Plaats vervolgens met calciumkleurstof geladen plakjes op een groot afdekglas. Vul hoogvacuüm siliconenvet in een spuit van 3 milliliter bevestigd aan een stompe naald van 18 G of een pipetpunt van 200 microliter en teken twee parallelle lijnen over het afdekglas, boven en onder de plak.

Bedek de plak met een nylon gaas tussen twee vetlijnen. Plaats het tweede afdekglas op het gaas om een kamer te genereren. Voeg HBSS of een agonistoplossing aan het ene uiteinde met een pipet toe aan de kamer.

Verwijder de vloeistof uit de kamer door aan het andere uiteinde te zuigen met tissuepapier. De kamer van de plak is nu klaar voor de calciumbeeldvorming met een high speed laser scanning confocale microscoop. Pulmonale luchtwegslagaderbundels werden waargenomen in nauwkeurig gesneden longplakken met een dikte van 150 micrometer onder een fasecontrastmicroscoop.

In rusttoestand werd een luchtweg geïdentificeerd door kubusvormige epitheelcellen met een nabijgelegen longslagader. Na blootstelling aan methacholine werd het luminale gebied verminderd, terwijl de longslagader geen reactie op de stimuli vertoonde. Luchtwegcontractiele responsen werden gekwantificeerd door het percentage luminale gebiedsreductie en vertoonden vergelijkbare dosisafhankelijke responsen in één dag- en vijfdaagse culturen.

Bij het bereiken van het perifere longveld vertakken de geleidende luchtwegen zich in ademhalingskanalen en zakjes rond de kleine intra-acinaire arteriolen. Bij blootstelling aan endotheel vernauwen zowel de luchtwegen als de longslagaders, gevolgd door noc-5 geïnduceerde ontspanning. In de rusttoestand vertoonden de met calciumkleurstof geladen plakjes een lage fluorescentie in de gladde spiercellen van de luchtwegen en het vasculaire systeem onder een confocale fluorescerende microscoop.

Bij blootstelling aan agonisten steeg de calciumfluorescentie-intensiteit in de cellen en verspreidde zich naar de hele cel, wat correleerde met de oscillerende signalen. Qua techniek is het essentieel om de long met agarose homogeen op te blazen en snelle of overmatige agarose-injectie te vermijden. Duw altijd lucht aan het einde om de agarose van de geleidende luchtweg naar de distale longblaasjesruimte te spoelen.

Samenvattend, met behulp van de precisie-gesneden longplakjescultuur, kan men een speciale verscheidenheid aan pulmonale gladde spierfuncties bieden en de deregulatie van gladde spieren in vitro modelleren. Het biedt ook een ideaal platform om novo vaatverwijdende of bronchodilatator medicijnen te screenen.