Multi-Stream Perfusion Bioreactor geïntegreerd met Outlet Fractionation voor dynamische celcultuur

Deze methode helpt te begrijpen hoe secretiesnelheden met de tijd veranderen en hoe cellen reageren op tijd variërende vaste signalen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de lage kosten weinig training vereisen en de opstelling van het profusiesysteem kan worden aangepast voor nieuwe experimenten. Begin met het vullen van een spuit met een achtergrondoplossing en laad deze in de eerste spuitpomp.

Vul een andere spuit met traceroplossing en laad deze in de tweede spuitpomp. Sluit beide spuiten aan op twee van de drie poorten van een vierwegstopkraan met behulp van luerconnectoren. Sluit de stopkraan op de achtergrondoplossing en pomp de traceroplossing in de stopkraan totdat deze uit de open poort druppelt.

Stop de pomp en stel de spuit niet verder af. Zorg ervoor dat de bewegende staaf van de spuitpompen tegen de zuigers van de spuit wordt geduwd, zodat de stroom onmiddellijk begint wanneer de pomp wordt gestart. Sluit de stopkraan bij de traceroplossing en pomp de achtergrondoplossing in de stopkraan totdat alle resterende traceroplossing uit de open poort is gespoeld.

Stop de pomp en stel de spuit niet verder af. Stel de gewenste stroomsysteemcomponent in voor RTD-analyse. Steek het uiteinde in een pipetpuntdispenser en pomp de achtergrondoplossing door het onderdeel totdat het volledig is gevuld.

Stel de pomp voor de traceroplossing in op het gewenste debiet. Sluit de stopkraan bij de achtergrondoplossing en start de stroom van de traceroplossing. Start tegelijkertijd de breukcollector.

Ga gedurende een korte periode door met de stroom van de traceroplossing om een impulsinvoer van de tracer te benaderen. Een pulsduur van 10 minuten wordt aanbevolen voor RTD's met een stroomsnelheid van één milliliter per uur. Stop de traceroplossingspomp aan het einde van de traceroplossingspulsperiode.

Sluit de stopkraan snel bij de traceroplossing en start de stroom van de achtergrondoplossing met hetzelfde debiet. Laat de achtergrondoplossing stromen en verzamel fracties totdat alle tracer door het systeem en in de verzamelde fracties is gegaan. Onder steriele omstandigheden steekt u de stoppen met naalden in de putplaatculturen met de naalden omhoog getrokken.

Nadat de stop op zijn plaats is, verlaagt u de naalden tot de gewenste hoogte voor perfusie, omdat de hoogte van de uitlaatnaald het stabiele vloeistofniveau bepaalt. Sluit de naalden af met mannelijke luierdoppen en bewaar de hele putplaat in een couveuse op 37 graden Celsius tot gebruik. Bereid de twee media voor die voor perfusie moeten worden gebruikt en label het medium dat als eerste zal worden verstrekt als één en het andere medium twee.

Voor elke cultuur die moet worden toegediend, vult u één spuit met medium één om de hele duur van het dispensatie plus voldoende volume te duren om in eerste instantie het perfusiesysteem te vullen. Vul een tweede spuit met medium twee om de hele duur van de dispensie te duren. Sluit beide spuiten aan op twee van de drie poorten van een vierwegstopkraan.

Een lengte van de slang om de spuiten op de stopkranen aan te sluiten, kan nodig zijn. Bereid de stopkranen voor door de stopkraan te sluiten voor medium één en medium twee in de stopkraan te doseren totdat deze net uit de open poort begint te druppelen. Sluit vervolgens de stopkraan voor medium twee en doseer medium één in de stopkraan totdat alle resterende medium twee uit de open poort is gespoeld.

Bevestig de stroomopwaartse buis aan de open stopkraanpoort met behulp van een female to barb luer connector. Plaats een mannetje om de luerconnector aan het andere uiteinde van de buis te weerhakken. Doseer medium één uit de spuit totdat de stroomopwaartse buis is gevuld met medium en ga verder met de bereiding van stroomafwaartse slangen zoals eerder gedemonstreerd.

Steek een mannetje om luer connector te weerhakken in het ene uiteinde van de stroomafwaartse buis en sluit het af met een vrouwelijke luer cap. Breng zorgvuldig alle voorbereide slangen, spuiten en de putplaat naar de incubator die zal worden gebruikt voor perfusie. Plaats de spuitpomp en fractiecollector op de gewenste plaatsen in de buurt van de incubator.

Plaats de spuitpomp bovenop of in de buurt van de incubator en plaats de fractiecollector naast de incubator in de buurt van de poort. Plaats de spuiten in de pomp. Bundel de afgedekte uiteinden van alle stroomopwaartse en stroomafwaartse buizen en duw ze van de buitenkant van de incubator naar binnen door de poort.

Steek de open uiteinden van de stroomafwaartse buizen in de pipetpunten van de multikopdispenser van de fractiecollector. Trek in de incubator zoveel mogelijk speling van de stroomopwaartse buizen in de incubator om de lengte van de buizen te maximaliseren waardoor het stromende medium warmte en koolstofdioxide kan ontvangen. Voor elke aangesloten put, maak snel de naalden en de upstream- en downstream-buizen voor die put los en bevestig ze vervolgens aan elkaar met hun luerconnectoren.

Zodra alle onderdelen zijn aangesloten, laat u de spuitpomp kort op een relatief hoge snelheid draaien om ervoor te zorgen dat alle stromen goed stromen. Op dit punt, als het gewenst is om het experiment te beginnen met de stroomafwaartse buizen vol met het medium, blijf de pomp draaien totdat ze allemaal zijn gevuld, anders stop je de pomp. Stel het pompdebiet van de spuit in voor medium één en de frequentie van het verzamelen van breuken en start beide machines tegelijkertijd om het experiment te starten.

Wanneer de mediumbron moet worden vervangen, stopt u snel de spuitpomp voor medium één. Draai de stopkraan dicht op medium één en start de spuitpomp voor medium twee. Schakel later desgewenst de bron op dezelfde manier terug naar medium één.

Verzamel breuken voor de gewenste experimentduur. De tracerconcentraties in de fracties van twee OTO-experimenten werden gemeten en ingevoerd in de RTD op basis van het MATLAB-gegevensscript om de twee RTD's te produceren. Enkele buizen en meerdere stukken buizen in serie passen goed bij een enkel axiale dispersiemodel en het toevoegen van een doordrenkte 48 putplaat in lijn veroorzaakte een verwaarloosbare afwijking waardoor zowel de rtd van één meter buis als de RTD van het hele systeem passen door axiale dispersiefuncties.

Een voorbeeld van een slechte modelfitting werd aangetoond met behulp van het axiale dispersiemodel dat was gemonteerd op de RTD-gegevens van de één meter buis en werd naast de gegevens uitgezet. De initiële parameterschattingen werden gewijzigd om een goede modelfit te produceren waarbij tau ongeveer gelijk was aan het volume van het perfusiesysteem gedeeld door het volumetrische debiet. Een puls van 90 minuten van TNF-alfa werd gedefinieerd als het ingangssignaal naar het systeem en werd samengevoegd met de één meter buis RTD om het TNF-alfasignaal bij de inlaat van de putplaat te bepalen.

Het ingangssignaal werd ook samengevoegd met de RTD van het hele systeem om het TNF-alfasignaal aan de uitgang van het systeem in de verzamelde fracties te bepalen. HEK 293-cellen werden ontworpen om GLuc af te scheiden, aangedreven door een promotor die het NF-kappaB-responselement bevat. Het experiment onthulde een significante toename van expressie en langzame afname van GLuc-expressie aangedreven door NF-kappaB na blootstelling aan TNF-alfa.

Variaties van het systeem worden beschreven in het begeleidende artikel, inclusief een eenvoudigere opstelling voor experimenten waarvoor geen invoersignalen nodig zijn en cellen worden blootgesteld aan farmaceutische verbindingsprofielen.