Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen

Ons protocol zou het onderzoek van neuronale structuren van circuit- tot componentschalen vergemakkelijken, wat essentieel is voor een beter begrip van hersenfuncties. Onze clearingtechniek, ScaleSF, oefent krachtige clearingcapaciteit uit, evenals een hoog niveau van weefselbehoud dat nodig is voor gelijktijdige visualisatie van zowel grootschalige als kleinschalige structuren. Ons protocol is vooral effectief in de hersenen, waar neuronale cellen uitgebreide processen vertonen, enorme verbindingen en gespecialiseerde fijne subcellulaire structuren regelen.

Voordat u met het experiment begint, bereidt u Sca/eS-oplossingen zoals weergegeven in deze tabel en bedekt u de monsters met folie. Begin de procedure door acht milliliter elk van ScaleS0- en ScaleS4-oplossingen toe te voegen aan twee afzonderlijke putten van een celkweekplaat met zes putten en verwarm de plaat voor tot 37 graden Celsius in een incubator. Breng de hersenschijfjes over naar de voorverwarmde ScaleS0-oplossing met een spatel en incubeer de plakjes gedurende twee uur bij 37 graden Celsius in een schuddende incubator met 90 RPM.

Breng vervolgens de gepermeabiliseerde hersenplakken over in acht milliliter PBS minus in een celkweekplaat met zes putten en was gedurende 15 minuten door in een orbitale shaker op 40 tot 60 RPM te houden. Herhaal deze stap twee keer. Breng vervolgens de hersenschijfjes over in acht milliliter voorverwarmde ScaleS4-oplossing en incubeer gedurende acht tot 12 uur bij 90 RPM bij 37 graden Celsius.

Voor de voorbereiding van de kamer 3D-print het kamerframe en de microscooptrapadapters. Bevestig het kamerframe aan een afdekplaat met behulp van een drukgevoelige lijm. Bereid 1,5% agarose in scaleS4D25(0)oplossing.

Meng de oplossing en zet deze in de magnetron totdat de agarose volledig is opgelost. Laat de oplossing vervolgens afkoelen tot 37 graden Celsius. Monteer de vrijgemaakte hersenschijf op de onderste deklip van de beeldvormende kamer met een spatel.

Verwijder de overtollige oplossing uit de opgeruimde plak met behulp van een schone tissue. Voeg de ScaleS4-gel toe aan de hersenschijf met behulp van een micropipette om de beeldvormende kamer te vullen. Leg er nog een deklip op met een tang gevolgd door een stuk tissuepapier en een glazen schuif.

Breng de beeldkamer over naar een koelkast op vier graden Celsius. Plaats metalen gewichten op de glasplaat en laat ze 30 minuten staan. Verwijder na de incubatie het materiaal uit de beeldkamer en veeg overtollige gel af.

Plaats de beeldkamer in een glazen petrischaaltje van 60 millimeter en bevestig de rand van de beeldkamer op meerdere punten aan de schaal met een drukgevoelige lijm. Giet de ScaleS4-oplossing in de schaal en schud zachtjes gedurende een uur bij 40 tot 60 RPM bij 20 tot 25 graden Celsius. Vervang door een verse oplossing en verwijder luchtbellen op het geloppervlak door het oppervlak voorzichtig te schrapen met een pipetpunt.

Monteer de beeldkamer op een microscooptrap. Bereid een confocale laserscanmicroscoop voor die is uitgerust met een multi-immersie objectieflens van 2,5 millimeter werkafstand, 16x vergroting en 0,60 numeriek diafragma. Schakel alle relevante beeldverwerkingsapparatuur in, zoals het werkstation, de microscoop, de scanner, lasers, de kwiklamp en start een beeldbewerkingssoftware.

Stel de correctiekraag van de multi-immersie objectieflens in op 1,47. Dompel de objectieflens onder in de oplossing en laat deze de plak langzaam benaderen. Verwijder alle luchtbellen die vastzitten op de punt van de objectieflens.

Zoek regio's van belang in gewiste weefsels met behulp van epifluorescentie. Als u parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen wilt instellen, bepaalt u eerst de bitdiepte voor beeldacquisitie naarmate de grootte van de afbeelding toeneemt met de bit. Stel vervolgens de detectiegolflengte in op basis van het emissiespectrum.

Stel de XY-resolutie, scansnelheid en pinhole-grootte in. Pas ook het laservermogen, de versterking van de detectorversterker en de offset aan totdat een geschikt beeld is verkregen. Bepaal de tegelgrootte op basis van de grootte van de ROI en zorg ervoor dat de volledige lengte en breedte van de ROI worden vastgelegd.

Navigeer door het weefsel in alle vlakken en stel de start- en eindpunten van de stapel in. Stel de Z-stapgrootte in, afhankelijk van de gewenste Z-resolutie. Verzamel de beelden en verwerk ze met behulp van beeldanalysesoftware.

Met behulp van dit protocol werd optische clearing van een muishersenschijf van een millimeter dikte bereikt. EGFP-expressie in de hersenschors van PV-FGL-muizen toonde aan dat de fluorescentie en structurele integriteit van de weefsels behouden bleef. Refractieve index mismatch geïnduceerde aberraties veroorzaakten een merkbaar verlies van beeldhelderheid en resolutie van EGFP-positieve neuronen.

Deze neuronen werden duidelijk gevisualiseerd met de confocale laserscanmicroscoop toen de correctiekraag werd aangepast aan deze ScaleS4-oplossing. 3D-reconstructie van EGFP-gelabelde neuronen in de primaire somatosensorische cortex van de muis werd gedaan in een hersenschijf van één millimeter dik. Individuele dendritische prieeltjes versierd met dendritische stekels werden gezien bij een hogere vergroting.

Axon terminale prieelvorming en axonale boutons werden ook waargenomen in de plakjes. Reflectieve indexmatching tussen beeldvloeistof en objectlens is van cruciaal belang voor 3D-beeldvorming in gewiste weefsels. Onze techniek zou de integratie van neuronstructuur van circuit- tot componentschalen vergemakkelijken, inzicht geven in neuronmechanismen, informatie over verwerking in de hersenen.