Name: Zelfassemblage van Microtubule Tactoids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Leer de zelfassemblage van microtubule tactoids met MAP65 en PEG voor celbiologisch onderzoek. Deze methode biedt inzicht in microtubuli-organisatie en mitotische spoelvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen alle leden van het Ross Lab in de zomer van 2021, in het bijzonder K. Alice Lindsay, bedanken voor hun hulp. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van NSF BIO-2134215 die S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee en J.L. Ross ondersteunde. Een subsidie van de KECK Foundation (Rae Anderson, USD, lead PI) ondersteunde R. Branch en P. Chauhan gedeeltelijk

<ol><li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+proteins%3A+structuring+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).</li>
<li>Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+meiotic+spindle+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte meiotic spindle assembly and function.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).</li>
<li>Brugués, J., Needleman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+basis+of+spindle+self-organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical basis of spindle self-organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).</li>
<li>Brugués, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleation+and+transport+organize+microtubules+in+metaphase+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles.</a> Cell. 149 (3), 554-564 (2012).</li>
<li>Gatlin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+fusion+requires+dynein-mediated+sliding+of+oppositely+oriented+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules.</a> Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).</li>
<li>Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmin%3A+A+protein+complex+required+for+centrosome-independent+microtubule+generation+within+the+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle.</a> Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).</li>
<li>Inoue, S., Sato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+by+labile+association+of+the+nature+of+mitotic+spindle+fibers+and+their+role+in+chromosome+movement+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules.</a> Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).</li>
<li>Allenspach, A. L., Roth, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+variations+during+mitosis+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural variations during mitosis in the chick embryo.</a> Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).</li>
<li>Theg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+microtubules+in+different+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic microtubules in different animal cells.</a> Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).</li>
<li>Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+anaphase+spindle+elongation+in+Diatoma+vulgare%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare.</a> Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).</li>
<li>Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChaikin%2C+PM+%22Principles+of+Condensed+Matter+Physics%22">Principles of Condensed Matter Physics</a>. , Cambridge University Press. (1995).</li>
<li>Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+and+collective+behavior+of+microtubule+bundles+in+the+presence+of+polyamines%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines.</a> Biophysical Journal. 101 (1), 205(2011).</li>
<li>Needleman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+assembly+of+microtubules+by+counterions%3A+From+hexagonal+bundles+to+living+necklaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).</li>
<li>Ross, J. L., Fygenson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+taxol+in+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mobility of taxol in microtubule bundles.</a> Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).</li>
<li>Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-like+beating+of+active+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cilia-like beating of active microtubule bundles.</a> Science. 333 (6041), 456-459 (2011).</li>
<li>Brandt, R., Lee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+microtubule-associated+protein+tau.+Identification+of+regions+which+affect+microtubule+growth%2C+nucleation%2C+and+bundle+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).</li>
<li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+organization+and+dynamics+dependent+on+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173(1989).</li>
<li>MacRae, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+organization+by+cross-linking+and+bundling+proteins.+Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Structure+and+Molecular+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).</li>
<li>She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+the+Ase1%2FPRC1%2FMAP65+family+in+central+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly.</a> Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).</li>
<li>Walczak, C. E., Shaw, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MAP+for+Bundling+Microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A MAP for Bundling Microtubules.</a> Cell. 142 (3), 364-367 (2010).</li>
<li>Edozie, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+spindle-like+microtubule+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Self-organization of spindle-like microtubule structures.</a> Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).</li>
<li>Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+the+microtubule+cross-linking+protein+MAP65-1+reveals+a+molecular+mechanism+for+contact-angle-dependent+microtubule+bundling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling.</a> Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).</li>
<li>Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+65-kDa+carrot+microtubule-associated+protein+forms+regularly+arranged+filamentous+cross-bridges+between+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).</li>
<li>Scheff, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+shape+and+internal+structure+of+protein+droplets+via+biopolymer+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments.</a> Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).</li>
<li>Weirich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+behavior+of+cross-linked+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Liquid behavior of cross-linked actin bundles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).</li>
<li>Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+motors+divide+active+liquid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-organizing motors divide active liquid droplets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).</li>
<li>Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crowder+and+surface+effects+on+self-organization+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Crowder and surface effects on self-organization of microtubules.</a> Physical Review E. 103 (6), 062408(2021).</li>
<li>Stanhope, K. T., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%2C+MAPs%2C+and+motor+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubules, MAPs, and motor patterns.</a> Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).</li>
<li>Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg">https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg</a> (2022).</li>
<li>Lantzsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+reorganization+during+female+meiosis+in+c.+Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans.</a> eLife. 10, 58903(2021).</li>
<li>Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+and+testing+of+a+new%2C+local+microtubule-disruption+tool+based+on+the+microtubule-severing+enzyme%2C+katanin+p60%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60.</a> Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).</li>
<li>Pecqueur, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designed+ankyrin+repeat+protein+selected+to+bind+to+tubulin+caps+the+microtubule+plus+end%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).</li>
<li>Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+dimers+of+the+mitotic+kinesin+motor+Eg5+step+processively+and+support+substantial+loads+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).</li>
<li>Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinesin-13+mutant+catalytically+depolymerizes+microtubules+in+ADP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP.</a> Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).</li>
<li>McNally, F. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+katanin%2C+an+ATPase+that+severs+and+disassembles+stable+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules.</a> Cell. 75 (3), 419-429 (1993).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De hier beschreven methoden zijn in verschillende artikelen gebruikt om microtubuli tactoïden te maken (figuur 2)22,28. Deze experimenten zijn biologisch relevant om de organisatieprincipes te helpen ontdekken die de vorm en stabiliteit van de mitotische of meiotische spindel in de meeste celtypen beheersen. Bovendien zijn microtubuli model vloeibare kristal mesogenen die kunnen helpen bij het leren van meer over hoe vloeibare kristallen nucleate en groeien nematische fasen uit isotrope fasen.
De hier beschreven procedure heeft verschillende voordelen voor het verkennen van microtubule zelforganisatie. Ten eerste is het zeer reproduceerbaar, omdat het in het lab is uitgevoerd door veel studenten, waaronder middelbare scholieren, met weinig voorkennis of training voordat ze in het lab begonnen. De tactoïden zijn birefringent22, waardoor ze naast fluorescentiemicroscopie ook in doorgelaten licht kunnen worden bekeken, waardoor deze methode toegankelijk is voor veel laboratoria en deze experimentele procedure kan worden aangepast aan educatieve doeleinden, naast hoogwaardig onderzoek. Ten slotte opent dit proces wegen om biologische systemen te blijven begrijpen en onderzoeken in een uitgeklede, reductionistische benadering, waardoor men kan begrijpen hoe elke aanvullende aandoening, eiwit of additief de zelforganisatie van tactoïden en, misschien, uiteindelijk, de spil kan veranderen. Doelen voor betere biomimicry zijn activiteit, vloeibaarheid en filamentpolariteitssortering.
Er kunnen verschillende factoren zijn die van invloed zijn op het experiment en onverwachte resultaten opleveren. Als de tactoïden zich bijvoorbeeld niet vormen (figuur 2) maar waaierachtige patronen worden waargenomen, is de MAP65 waarschijnlijk niet aanwezig of niet bindend aan de microtubuli22,28. Dit zou ook duidelijk moeten zijn in het MAP65-fluorescentiekanaal, omdat de GFP-MAP65 niet gebonden is aan de microtubuli.
Als de tactoïden zich niet vormen en de achtergrond als spikkels op het glas verschijnt, kan dit te wijten zijn aan de oppervlaktecoating. Eenmaal uitgevoerd, duurt de silanisatie slechts 1 maand op coverslips. Wanneer het slijt, kan de tubuline zich niet-specifiek aan het blootgestelde oppervlak binden. Deze binding zal in vreemde patronen plaatsvinden.
Als de tactoïden zich niet vormen en de tubuline wordt waargenomen in aggregaten van verschillende vormen en maten, kan dit te wijten zijn aan tubuline van slechte kwaliteit. Tubuline kan worden gecentrifugeerd om initiële aggregaten te verwijderen die deze off-pathway aggregatie kunnen aansturen in plaats van microtubule polymerisatie. Als het oppervlak zich aan de tubuline bindt, kan het ook de tubuline in de oplossing uitputten. Lage concentraties tubuline, onder de kritische concentratie voor het polymeriseren van microtubuli, kunnen resulteren in aggregaten.
In FRAP-experimenten, als het MAP65-kanaal geen herstel vertoont (figuur 5), is het mogelijk dat de fotobleaching de microtubuli fotode. Fotoschade veroorzaakt de gelokaliseerde vernietiging van de filamenten. Dit kan worden gecontroleerd door onderzoek in het zendkanaal. Microtubule tactoïden zijn zichtbaar in het overgedragen kanaal door een hoge brekingsindex die niet overeenkomt met het omringende water. Door licht geïnduceerde fotoschade zal verschijnen als een brandmerk of verlies van contrast in doorgelaten lichtbeeldvorming op de locatie van de ROI die wordt blootgesteld aan fotobleaching. Als dit gebeurt, moet de laser- of lichtkracht worden verminderd om de fotoschade van de eiwitten te remmen.
Er waren verschillende uitdagingen in deze procedure en aanpak. Een probleem is dat de lengtemetingen momenteel met de hand worden uitgevoerd door op de afbeelding te klikken. Deze methode, hoewel eenvoudig, kan leiden tot grote onzekerheid. De breedtemeting die de doorsnede gebruikt en past bij een Gauss is een betere methode om de grootte te kwantificeren. Een vergelijkbare methode zou kunnen worden gebruikt voor de lengte. Een tweede probleem is dat de tactoïden, omdat ze zo lang en dun zijn, soms kunnen buigen. Dit maakt het kwantificeren van de lengte moeilijker. De contourlengte kan worden gekwantificeerd met behulp van een gesegmenteerde lijn, maar er is extra onzekerheid telkens wanneer een segment wordt toegevoegd.
Vanuit een wetenschappelijk perspectief heeft deze benadering enkele andere uitdagingen voor het gebruik ervan als model voor vloeibare kristallen of spindels. De eerste uitdaging was de lange, dunne vorm van de tactoïden die microtubuli creëren (figuur 3 en figuur 4). Zoals opgemerkt in eerdere publicaties22, zijn microtubule tactoïden homogene tactoïden, niet bipolair. Dit betekent dat de microtubuli waaruit de vorm bestaat, zich niet heroriënteren om naar de uiteinden van de structuur te wijzen. In plaats daarvan zijn alle microtubuli evenwijdig aan de lange as en bevinden de "polen" zich op oneindig. Dit is heel anders dan de tactoïden die worden waargenomen voor moleculaire vloeibare kristallen of zelfs voor actine of DNA dat ook kan fungeren als vloeibare kristal mesogenen. In deze andere systemen zijn de tactoïden bipolair en, wanneer ze worden bekeken in gekruiste polarisatoren, vertonen ze de veelbetekenende tekenen van heroriëntatie van de staven.
Een tweede grote uitdaging in dit systeem is dat de microtubuli onbeweeglijk zijn in de tactoïde. Dit blijkt duidelijk uit FRAP-experimenten en -analyse omdat het herstel van de microtubuli zeer laag is. Hun vaste aard maakt microtubuli tactoïden minder waardevol dan grootschalige vloeibare kristalanalogen. De nematische fase van een vloeibaar kristal moet zowel vloeibare (vloeistof) als kristal (georganiseerde) eigenschappen hebben. Hoewel de vorm goed lijkt voor de spindel, maakt de immobiliteit het systeem minder opwindend als een model mitotische spindel. Aan de andere kant biedt dit probleem mogelijkheden om te onderzoeken hoe men de experimenten kan aanpassen om meer vloeibaarheid in het systeem te creëren.
Deze wetenschappelijke uitdagingen bieden spannende kansen die nieuwe kennis over het systeem mogelijk maken. Om de microtubuli tactoïden meer bipolair te maken, zou men kortere microtubuli kunnen gebruiken. Er is echter een extra uitdaging, omdat microtubuli niet veel goed gekarakteriseerde capping-eiwitten hebben om de lengte te beheersen zoals actine dat doet. Het gebruik van nucleatie en groei vereist het gebruik van zeer hoge concentraties tubuline en GMPCPP om korte microtubuli te maken. De hoge tubulineconcentratie resulteert in een groter aantal filamenten in het systeem, waardoor het moeilijker wordt om tactoïden van elkaar te scheiden. De toevoeging van nieuwe microtubule cappers, zoals DARPin33, kan helpen bij deze situatie. Het tweede probleem dat de microtubuli onbeweeglijk zijn, kan worden verzacht door de toevoeging van motoreiwitten, zoals kinesine-534, tetrameren van motoren die bij mitose worden gebruikt. Als alternatief kunnen kunstmatige dimeren van dimerische kinesine-1 worden gebruikt15.
Een andere manier om meer vloeibaarheid toe te voegen, zou zijn om de microtubuli hun dynamische instabiliteit te laten uitvoeren, het groeien en krimpen van microtubuli. Momenteel zijn microtubuli die worden bezaaid met stabiele GMPCPP-filamenten en vervolgens dynamische instabiliteit ondergaan, veel langer dan gewenst om een spindel of tactoïde te vormen, wat zou resulteren in zeer lange organisaties zoals fans of bundels. Het toevoegen van microtubule dynamische instabiliteit zou dus zorgvuldig moeten worden gedaan om de tactoïde vorm te behouden. De toevoeging van geassocieerde eiwitten en enzymen die de lengte kunnen regelen, kan dit probleem verminderen. Bijvoorbeeld, het depolymeriseren van kinesines, zoals kinesine-1335, of het scheiden van enzymen, zoals katanine36, zou waarschijnlijk nodig zijn. Deze experimenten zijn complex en moeilijk, hoewel ze zeer inzichtelijk zouden zijn, ongeacht wat de resultaten onthullen. Welke richting toekomstige experimenten ook opgaan, het hier ontwikkelde platform voor het maken van microtubule tactoïden kan nieuwe informatie blootleggen op de fysieke basis van microtubule organisatie.

Celdeling via mitose is een van de belangrijkste biologische processen om het leven in stand te houden. De microtubule filamenten, samengesteld uit tubuline dimeren, zijn essentiële structurele elementen van dit proces. De voorbijgaande machinerie die in de metafase wordt gecreëerd wanneer de chromosomen in het celcentrum worden uitgelijnd, wordt de mitotische spindel genoemd vanwege zijn vorm, die lijkt op een spindel van een weefgetouw bedekt met draden (figuur 1A). Het is bij veel organismen goed ingeburgerd dat microtubuli in de metafase worden gebruikt om gecondenseerde chromosomen in het midden van de cel te duwen en te trekken, ze uit te lijnen en ze aan te sluiten op microtubuli die ze in de anafase uit elkaar zullen trekken (figuur 1B, C). De spindel vormt zich in zowel meiose (figuur 1B) als mitose (figuur 1C), ontstaan uit vele overlappende microtubuli die niet als draad om de centrale as zijn gewikkeld, maar parallel aan de interface lopen. Het creëren van deze op microtubuli gebaseerde structuren vereist geassocieerde eiwitten die crosslinken en geassocieerde enzymen die kunnen fungeren als motoren om de chromosomen te duwen en te trekken1.
Studies van meiotische spindels hebben aangetoond dat de microtubuli kort, dynamisch en overlappend zijn in crosslinked arrays 2,3,4,5,6 (Figuur 1Di). Door de fysische organisatie van deze korte microtubuli is de meiotische spindel vergelijkbaar met een vloeibaar kristal tactoïde (figuur 1E). Van spindels is inderdaad aangetoond dat ze samensmelten en samensmelten, zoals men zou verwachten van vloeibare kristaltatoïden5.
Veel studies die dateren uit de jaren 1960 hebben fixatie, seriële secties en elektronenmicroscopie gebruikt om te bepalen dat er twee soorten microtubuli in de mitotische spindel 7,8,9,10 zijn. Het eerste type wordt de kinetochore microtubuli genoemd, die de spindelpool verbinden met het kinetochore. Het tweede type wordt de interpolaire of polaire microtubuli genoemd, die voorbij de chromosomen groeien en elkaar overlappen in de midzone (figuur 1Dii)8,9,10. Een derde type wordt de astrale microtubuli genoemd, die zich buiten de spil bevinden en de polen verbinden met de celrand; deze microtubuliorganisaties vallen buiten het bestek van de huidige discussie. Er zijn recente studies geweest naar de interactie tussen augmin6 en gamma-tubuline ringcomplex dat nucleatiecentra voor microtubuli beïnvloedt, wat resulteert in een mitotische spindel met kortere microtubuli zoals in figuur 1D.
Omdat microtubuli langer zijn dan ze breed zijn, met een hoge beeldverhouding en hoge stijfheid, zijn ze als opgeschaalde versies van vloeibare kristalmoleculen. In de fysica van zachte materie zijn atomen en moleculen benaderd met behulp van minimale interacties om de fysische mechanismen van faseovergangen af te leiden, waaronder nucleatie en het smelten van kristallen11. Evenzo zijn microtubuli mesoschaalobjecten die opgeschaalde versies zijn van vloeibare kristalmoleculen, die inzicht geven in de fysica van vloeibare kristaldynamica, inclusief de nucleatie en groei van de nematische fasen van isotrope fasen. Verder, zoals hierboven besproken, vertoont de meiotische spindel eigenschappen zoals die van een vloeibaar kristal tactoïde, een nematische toestand die nucleeert en groeit uit de isotrope toestand van vloeibare kristalmoleculen 3,4,5. Voor tactoïden zijn nucleatie en groei vergelijkbaar met die van andere kristallen (d.w.z. een relatief hoge concentratie mesogenen vereisen [de moleculen die vloeibare kristallen vormen]). De unieke "spindel" vorm van de tactoïde komt van de lokale uitlijning van de vloeibare kristal mesogenen die uitlijnen in de nematische fase (figuur 1E). Ze kunnen geen afgerond kristal vormen omdat de moleculen zeer asymmetrisch zijn. Gezien de aard van de microtubuli is het misschien niet verwonderlijk dat de mitotische spindelmachinerie gemaakt van een hoge lokale concentratie microtubuli ook dezelfde vorm heeft, of het nu een tactoïde of een spindel wordt genoemd. Tactoïden kunnen bipolair zijn, met polen aan de taps toelopende uiteinden (figuur 1Ei), of homogeen, met polen effectief op oneindig (figuur 1Eii).
Gezien het belang van spindelvorming, zijn er inspanningen geleverd voor zelfgeorganiseerde spindelvorming in vitro door microtubulecondensatie in bundels aan te tonen via ionische soorten12,13, verdringingsmiddelen die uitputtingsinteracties creëren14,15, en specifieke microtubule crosslinking eiwitten 13,16,17,18,19, 21. Verrassend genoeg, hoewel deze middelen allemaal werken om de lokale concentratie van microtubuli te verhogen, resulteren ze vaak in lange microtubulibundels, maar niet in tactoïden. Een reden waarom deze bundels lang zijn, zou kunnen zijn dat de microtubuli waaruit ze bestaan ook lang zijn. Recent werk met kortere microtubuli meldde ook langere bundels die aan het einde niet taps toelopend zijn15; in dit geval worden de bundels bij elkaar gehouden met motoreiwitten die verlenging van de bundels veroorzaken en daardoor langer maken. Korte microtubuli met niet-extensiele crosslinkers zijn nodig voor taps toelopende, spindelachtige assemblages, zoals hier beschreven.
Onlangs hebben we een techniek ontwikkeld om de creatie van microtubule tactoïden mogelijk te maken met behulp van de antiparallel crosslinker, MAP65, in de aanwezigheid van nucleating stabiele microtubules22. De microtubuli moesten kort zijn, maar weinig bekende regulatoren van microtubulilengte kunnen microtubuli afdekken tegen dynamische instabiliteit of end-to-end gloeien. In plaats daarvan werd GMPCPP gebruikt om de filamenten na groei te nucleeren en te stabiliseren. Dit maakte het mogelijk om een hoge dichtheid van korte microtubuli te creëren die zichzelf konden organiseren in tactoïden. Deze tactoïden waren homogeen wanneer ze onder birefringence werden bekeken. Naast korte microtubuli werd een specifieke antiparallel crosslinker, MAP65, gebruikt om de tactoïden te vormen (figuur 2). MAP65 is een plantaardig microtubule-geassocieerd eiwit in de PRC1/Ase1 familie van mitotische crosslinkers23. MAP65 bestaat als een dimeer, met een sterke affiniteit om aan zichzelf te binden, evenals de microtubuli24. In tegenstelling tot de meiotische spindel en tactoïden waargenomen met actinefilamenten 25,26,27, die bipolair zijn en de vloeistofachtige eigenschappen van vloeibare kristallen hebben, zijn microtubuli tactoïden waargenomen als vast-achtig22,28.
Hier worden protocollen gepresenteerd voor het maken van de microtubule tactoïden en het karakteriseren van de vorm van de assemblages en de mobiliteit van de bestanddelen met behulp van op fluorescentie gebaseerde technieken.

<table><tbody><tr><td>2% Dichlorodimethylsilane</td><td>GE Healthcare</td><td>118945</td><td>Een hydrofobe silaanopvlakbehandeling. Dit kan tot drie keer worden hergebruikt en een jaar lang op kamertemperatuur worden bewaard.</td></tr><tr><td>5-minute epoxy</td><td>Bob Smith Industries</td><td></td><td>Voor het afdichten van experimentele kamers</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher</td><td>32900HPLC</td><td>100%</td></tr><tr><td>BL21 cellen</td><td>Bio Labs</td><td>C2527I</td><td>Competente bacteriecellen die worden gebruikt om MAP65 tot expressie te brengen</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C30-500MG</td><td>Onderdeel van het zuurstofscavengeringssysteem. Een 300 mg/ml stock wordt gemaakt in ddH2O en wordt bewaard in 10 µl aliquoten bij -20°C gedurende maximaal één jaar.</td></tr><tr><td>Dekvlakken (22 mm x 22 mm of 22 mm x 30 mm)</td><td>Fisher</td><td>12544-AP</td><td>Voor experimentele kamers</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-5G</td><td>Een klein molecuul dat wordt gebruikt om disulfidebindingen te breken en zuurstof te schaven. Een 1 M stock wordt gemaakt van poeder (Sigma) in ddH2O. De oplossing wordt gesplitst en bewaard bij -20C gedurende maximaal één jaar. De aliquoten worden 7-8 keer gebruikt en vervolgens weggegooid.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-10G</td><td>Basisingrediënt voor tubulinebuffer</td></tr><tr><td>Eppendorf 0,5 ml buisjes</td><td>Eppendorf</td><td>05 402 18</td><td>Voor het bewaren van experimentele oplossingen</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>111000200</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>Voor het reinigen en voor het trekken van oplossingen door experimentele kamers</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop met hoog NA-objectieven</td><td>Nikon</td><td>Ti-E, W2 Confocal</td><td>Voor beeldvormingsexperimenten</td></tr><tr><td>Vriezer -20°C</td><td>Fisherbrand</td><td>13986148</td><td>Voor het bewaren van reagentia</td></tr><tr><td>Vriezer -80°C</td><td>Thermo scientific</td><td>328223H01-C</td><td>Voor het bewaren van eiwitten.</td></tr><tr><td>Glascontainers voor silanisatie</td><td>Michaels</td><td></td><td>Voor het bereiden van experimentele kamers - behandeling van dekglasjes</td></tr><tr><td>Glasplaten</td><td>Fisher</td><td>12544-4</td><td>Voor experimentele kamers</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528-250G</td><td>Onderdeel van het zuurstofscavengeringssysteem. Een 300 mg/ml stock wordt gemaakt in ddH2O en wordt bewaard in 10 µl aliquoten bij -20°C.</td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>Onderdeel van het zuurstofscavengeringssysteem. Dit wordt bewaard bij 4°C gedurende maximaal één jaar.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-4055</td><td>Langzaam hydrolyseerbaar analoog van GTP dat wordt gebruikt om microtubuli te polymeriseren en te stabiliseren door de dynamische instabiliteit en spontane kritische concentratie voor microtubulusnucleatie te verminderen om een consistente lengte te krijgen. We kopen een 10 mM stock van Jena Biosciences en bewaren het bij -20°C gedurende maximaal één jaar.</td></tr><tr><td>Verwarmingselement voor microscoop</td><td>Okolab stage top incubator</td><td></td><td>Voor beeldvormingsexperimenten</td></tr><tr><td>Imidizool</td><td>Sigma</td><td>I2399</td><td>Gebaat om MAP65-eiwit van nikkelkralen te elueren om MAP65 te zuiveren</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>34155</td><td>Voor het reinigen en voor het trekken van oplossingen door experimentele kamers.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P250-500</td><td>1 M in ddH2O, vers gemaakt om verzuring na verloop van tijd te voorkomen.</td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td>Airgas</td><td>NI 230LT22</td><td>Om aliquoten te vriesdrogen. Dit kan ook worden gebruikt voor opslag (niet aanbevolen)</td></tr><tr><td>MAP65-eiwit</td><td>Ram Dixit</td><td></td><td>Een microtubulus-geassocieerd eiwit (MAP) met een moleculair gewicht van 65 kD dat een antiparallelle microtubuluscrosslinker is. We hebben een ongelabelde en GFP-gelabelde versie van MAP65-1 gezuiverd uit Arabidopsis thaliana. We mengen de GFP-MAP65 met het ongelabelde MAP65 zodat 10% van het eiwit is gelabeld. Het werkstock is een 10,8 µM-oplossing. Deze werkoplossing wordt bewaard bij 4°C en elke week vers gemaakt. Het protocol voor het zuiveren van de MAP65 en GFP-MAP65 wordt gegeven in ons eerdere methodenhoofdstuk (26).</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>MKCJ940</td><td>Ingrediënt voor tubulinebuffer</td></tr><tr><td>NTA-nikkelkralen</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>Kralen vereist om 6xHis-gelabelde MAP65-eiwitten te zuiveren</td></tr><tr><td>Optomicroscan</td><td>Nikon</td><td></td><td>405 nm lasersysteem dat de laser kan richten in elke gewenste vorm van interessegebied</td></tr><tr><td>PEM80</td><td></td><td></td><td>Neutrale tubulinepolymerisatiebasisbuffer voor oplossing gemaakt van 80 mM K-PIPES, pH 6,8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, bewaard bij 4°C gedurende maximaal één jaar.</td></tr><tr><td>Permanent dubbelzijdig plakband</td><td>3M - Scotch</td><td>34-8724-5691-7</td><td>Voor experimentele kamers</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>Voor vochtige kamer</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P7643-100G</td><td>Basisingrediënt voor tubulinebuffer</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>Een blokcopolymeer met twee hydrofiele polyethyleenoxide (PEO)-blokken aan de uiteinden en een hydrofobe centrumblok van polyfenyleenoxide (PPO) hydrofobe oppervlaktecoating die we gebruiken om eiwitbinding aan het oppervlak te voorkomen. Pluronic-F127 wordt gekocht als poeder (Sigma) en overnacht opgelost tot een 5% (w/v) oplossing in ddH2O. Eenmaal opgelost, kan de oplossing maximaal één jaar bij kamertemperatuur worden bewaard.</td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol</td><td>Affymetrix Inc</td><td>19966 500 GM

zelfassemblage van microtubule tactoids

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

Het cytoskelet is verantwoordelijk voor grote interne organisatie en reorganisatie binnen de cel, allemaal zonder een manager om de veranderingen te sturen. Dit is vooral het geval tijdens mitose of meiose, waarbij de microtubuli de spil vormen tijdens de celdeling. De spil is de machinerie die wordt gebruikt om genetisch materiaal te scheiden tijdens celdeling. Om zelfgeorganiseerde spindels in vitro te creëren, hebben we onlangs een techniek ontwikkeld om microtubuli te reconstitueren tot spindelachtige assemblages met een minimale set microtubuli-geassocieerde eiwitten en verdringingsmiddelen. Specifiek werd MAP65 gebruikt, een antiparallel microtubule crosslinker van planten, een homoloog van Ase1 van gist en PRC1 van zoogdierorganismen. Deze crosslinker organiseert zelf microtubuli in lange, dunne, spindelachtige microtubuli zelfgeorganiseerde assemblages. Deze assemblages zijn ook vergelijkbaar met vloeibare kristal tactoïden, en microtubuli kunnen worden gebruikt als mesoschaal mesogenen. Hier worden protocollen gepresenteerd voor het maken van deze microtubule tactoïden, evenals voor het karakteriseren van de vorm van de assemblages met behulp van fluorescentiemicroscopie en de mobiliteit van de bestanddelen met behulp van fluorescentieherstel na fotobleaching.

Met slechts een klein aantal componenten, tubulinedimeer en microtubule crosslinkers kunnen microtubule tactoïden ontstaan (figuur 2A). Hoewel dit protocol incubatie beschrijft om te nucleeren en microtubuli te laten groeien in een incubator, kunnen de nucleatie en groei direct onder de microscoop worden waargenomen (die binnen 30 minuten voltooid zijn) (figuur 2B). De concentratie tubuline wordt constant gehouden op 13,6 μm en MAP65-MT binding op 10%.
Figuur 4 vertegenwoordigt succesvolle gegevens. De tactoïden moeten zichtbaar zijn met zowel een 561 nm laser in het tubulinekanaal als 488 nm in het MAP65-kanaal, die elkaar perfect overlappen (figuur 4A). Een mysterie van het systeem is dat de breedte van de tactoïden niet lijkt te variëren onder een verscheidenheid aan experimentele veranderingen, waaronder het veranderen van de microtubulilengtes, de MAP65-concentratie en de verdringingsmiddelen (figuur 4B) 22,28. De lengte is veel variabeler en hangt af van zowel de microtubulilengtes als de MAP65-concentratie (figuur 4B)22,28.
Bij het uitvoeren van FRAP is waargenomen dat het MAP65-signaal herstelt, maar het microtubule-signaal herstelt niet (figuur 5). Het herstel in FRAP is te danken aan de mobiliteit en beweging van de gelabelde en fotobleached objecten. In het geval van de MAP65 dissociëren de verduisterde moleculen zich van de microtubuli en verplaatsen nieuwe zich naar het gebied (figuur 5). De MAP65-binding is in evenwicht, dus de snelheid van binden en ontkoppelen is gelijk (gemeten in moleculen per seconde). Voor de microtubuli werd geen herstel gezien, wat impliceert dat de microtubuli niet in staat zijn om het tactoïde te verlaten (figuur 5A, Bi, C). Verder werd geen verspreiding van het verduisterde gebied gezien, wat suggereert dat de microtubuli lokaal onbeweeglijk zijn en geen vloeistof in de tactoïde vorm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg"> Figuur 1: Verschillende modellen van spindelvorming. Een mitotische spindel is een machine gemaakt van microtubuli en de bijbehorende eiwitten en enzymen die de chromosomen uitlijnt en scheidt in de twee nieuwe dochtercellen tijdens de celdeling. (A) Afbeelding van een vroege middeleeuwen drop spindel replica met fijn garen uit Nederland. Deze figuur is aangepast van een Wikimedia-afbeelding door Peter van der Sluijs30. (B) Driedimensionale reconstructie van microtubuli in verschillende stadia van wild-type meiose II. Microtubuli worden in het groen weergegeven en chromosomen worden in grijs weergegeven. Schaalbalk = 1 μm. Dit cijfer is aangepast van Lantzsch et al.31. (C) Microscopiebeeld van de microtubuli in een mitotische spil van een delende Sf9-cel. De spindelpolen en de microtubuli van de spil zijn gelabeld met een groen fluorescerend eiwit. Schaalbalk = 5 μm. Dit cijfer is aangepast van Advani et al.32. (D) Verschillende modellen van hoe mitotische en meiotische spindelmicrotubuli zijn georganiseerd. (i) Eerder waargenomen voor meiotische spindels gemaakt van Xenopus-ei-extracten, werden de microtubuli (groen) afgeleid als kort en dynamisch in de hele spil. Dit is vergelijkbaar met een bipolaire tactoïde organisatie in een vloeibaar kristal. (ii) Het canonieke model voor microtubule-organisatie in een mitotische spindel heeft twee soorten microtubuli: interpolaire of polaire microtubuli (donkergroen) die crosslinken in de middenzone rond de chromosomen en kinetochore microtubuli (lichtgroen) die worden gebundeld en uitgerekt van de pool naar het kinetochore om de chromosomen te duwen en te trekken. Op alle afbeeldingen worden chromosomen weergegeven in transparant blauw en spindelpolen in donkergroen. (E) Schema's van mesogenen (groene lijnen) in een vloeibaar kristal tactoïde voor (i) bipolaire en (ii) homogene tactoïden. Bipolaire tactoïden hebben twee polen aan het einde van de tactoïde, en de mesogenen heroriënteren zich om naar die polen te wijzen. Homogene tactoïden hebben polen op oneindig en de mesogenen veranderen niet van oriëntatie langs de lengte van het tactoïde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg"> Figuur 2: Microtubule condensatie. (A) Microtubuli kunnen worden gebundeld en verknoopt door een verscheidenheid aan methoden, waaronder ionische soorten, uitputtingskrachten veroorzaakt door verdringingsmiddelen en specifieke microtubule crosslinkers, zoals MAP65. (i) Tubulinedimmeren en MAP65-eiwitten worden gemengd tot nucleate en groeien microtubuli. (ii) Microtubuli nucleeren en groeien uit de tubuline, en MAP65 bindt onmiddellijk aan microtubuli, een ander MAP65-monomeer, of beide en veroorzaakt bundeling. (iii) Microtubuli in de verknoopte bundels nucleeren en groeien. (iv) De uiteindelijke configuratie is een microtubuli tactoïde vergelijkbaar met een spindel. (B) Tijdreeksen van microtubuli tactoïden die gedurende 105 minuten nucleeren en groeien. Schaalbalk = 5 μm. Figuur aangepast van Edozie et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg"> Figuur 3: Stromingskamerassemblage. De stromingskamer is gemaakt met behulp van een glazen schuif, gesiliciseerd afdekglas en permanente dubbelzijdige tape. Het geel gemarkeerde gebied is het stroompad waar het monster wordt gestroomd en waargenomen. Het volume van de stroomkamer is ~ 20 μL. Epoxy werd gebruikt om de uiteinden van de kamer af te dichten om te voorkomen dat het monster verdampt tijdens langdurige beeldvorming gedurende enkele uren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg"> Figuur 4: Tactoïde afbeeldingen en lengte- en breedteanalyse. (A) Voorbeeldgegevens van tactoïden gevormd zoals beschreven en afgebeeld met behulp van draaiende schijf confocale tonen (i) microtubule kanaal beeldvorming rhodamine-gelabelde tubuline met behulp van een 561 nm laser, (ii) GFP-MAP65 kanaal imaging van de GFP met behulp van een 488 nm laser, en (iii) samengevoegde overlay beeld van de microtubuli kanaal (magenta) en GFP-MAP65 kanaal (cyaan). Overlapgebieden worden weergegeven als wit en tonen aan dat de microtubuli en MAP65 precies colocaliseren. Schaalbalk = 10 μm voor alle afbeeldingen in (A). (B) Kwantificering van de tactoïde lengte en breedte. (i) Afbeelding van een tactoïde die zonder labels moet worden geanalyseerd. Schaalbalk = 5 μm. (ii) Dezelfde afbeelding als in (i), waarbij de lengte (ononderbroken lijn met lijnkappen) en breedte (stippellijn) metingen worden aangegeven. Schaalbalk = 5 μm. (iii) De breedte werd gemeten door het intensiteitsprofiel over het tactoïde te nemen op de loodrechte bisector (stippellijn) aangegeven in (ii). Het intensiteitsprofiel was geschikt voor een Gaussische functie om de amplitude en breedte van het tactoïde te onthullen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg"> Figuur 5: Representatieve FRAP-gegevens en -analyse. (A) Microscopietijdreeksgegevens van (i) microtubule tactoïde en (ii) GFP-MAP65, en (iii) overlaybeeld van beide kanalen met microtubuli in magenta en GFP-MAP65 in cyaan die werden gefotobleacheerd op tijd 63 s en waargenomen gedurende nog eens 5 minuten. (B) Gekwantificeerde intensiteit van de (i ) microtubulikanaal in het gebleekte gebied (magentacirkels) en de achtergrond (donkergrijze cirkels) en (ii) GFP-MAP65-kanaal in het gebleekte gebied (cyaanvierkanten) en de achtergrond (donkergrijze vierkanten). (C) De gegevens werden gecorrigeerd voor de achtergrondruis en opnieuw geschaald voor het microtubulikanaal (magentacirkels) en het GFP-MAP65-kanaal (cyaanvierkanten). De microtubuli herstellen zich niet, maar de GFP-MAP65 wel en kan worden aangepast (donkergrijze lijn) aan een stijgend exponentieel verval om de amplitude en de tijdschaal van herstel te vinden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit artikel presenteert een protocol voor de vorming van microtubule-assemblages in de vorm van tactoïden met behulp van MAP65, een plantaardige microtubule crosslinker, en PEG als een crowding agent.

Zelfassemblage van Microtubule Tactoids

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Dit protocol maakt de spontane zelforganisatie van microtubuli tactoïden mogelijk met behulp van een anti-parallelle cross-linker, MAP65. Dit systeem kan ons helpen de organisatie van microtubuli en biologische systemen zoals mitotische spindels te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een minimalistisch systeem is dat spindelachtige vormen voor microtubuli kan recreëren die zeer reproduceerbaar en toegankelijk is voor veel laboratoria.Deze methode is niet alleen van toepassing op cellulaire systemen, maar kan ook dienen als een model voor meso-schaal vloeibare kristalstudies. Om tubuline te bereiden, haalt u eerst een aliquot ongelabelde tubuline met één milligram gelyofiliseerde tubuline uit de vriezer van min 80 graden Celsius en houdt u deze op ijs. Voeg vervolgens 200 microliter koude PEM-80 toe.Om al het lyofiel op te lossen, houdt u de buis 10 minuten op ijs. Haal vervolgens een tube rhodamine-gelabelde tubuline met 20 microgram gelyofiliseerd tubulinepoeder uit de vriezer van min 80 graden Celsius en bewaar het op ijs. Voeg vervolgens vier microliter koude PEM-80 toe en houd de buis gedurende 10 minuten op ijs om al het lyofiel op te lossen.Zodra de gelyofiliseerde tubulinen zijn opgelost, voegt u 100 microliter van de geresuspendeerde ongelabelde tubuline-oplossing toe aan de vier microliter rhodamine-gelabelde tubuline-oplossing. Meng vervolgens de oplossingen door zes tot zeven keer heel langzaam te leidingen. Om de resterende 100 microliter ongelabelde tubuline-oplossing op te slaan, plaatst u eerst de buis in vloeibare stikstof om de oplossing te bevriezen en houdt u de buis vervolgens op min 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik.Verdeel vervolgens de tubulinemix in zeven nieuwe buizen door 15 microliter in elk toe te voegen. Vries de buizen in vloeibare stikstof zoals eerder aangetoond en bewaar ze bij min 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Om stroomkamers samen te stellen voor het uitvoeren van experimenten, reinigt u eerst een glazen glijbaan met dubbel gedestilleerd water en droogt u deze met een pluisvrij laboratoriumdoekje.Maak vervolgens de dia eerst schoon met ethanol, gevolgd door dubbel gedestilleerd water. Om een stroompad te maken, snijdt u een 40 tot 50 millimeter lang stuk dubbelzijdige tape. Splits het vervolgens tussen om twee dunnere stroken tape te maken en plaats de twee stroken op de dia vijf tot acht millimeter uit elkaar.Plaats vervolgens verzande afdekslips bovenop het stroompad. Sluit vervolgens de dia af en deksel gleed de dubbelzijdige tapestrips af door zachtjes op het tapegebied te drukken met de achterkant van een pen. Als de afdichting goed is gemaakt, moet de tape van doorschijnend naar helder worden.Om de extra tape aan de randen te verwijderen, snijdt u de tape met een scheermesje, waardoor u slechts één millimeter van de ingang van de stroomkamer overblijft. Label vervolgens de kamer met de juiste experimentele parameters Voor het uitvoeren van de tactoïde experimenten, ontdooi eerst alle benodigde reagentia op ijs en bewaar ze op het ijs tijdens het werk. Bedek vervolgens de stroomkamer met 20 microliter 5% niet-ionische blokcopolymeer oppervlakteactieve stof opgelost in PEM-80 met kleine druppels aan beide uiteinden van de kamer om de vorming van luchtbellen binnenin te voorkomen.Houd vervolgens de stroomkamer in een vochtige kamer gemaakt van petrischaal met een nat, pluisvrij laboratoriumdoekje gedurende ten minste vijf tot zeven minuten. Meng vervolgens PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, dithiothreitol, glucose, polyethyleenglycol, het eerder gemaakte tubulinemengsel en MAP65 met GFP MAP65 voor visualisatie in een steriele buis door vijf tot zes keer te pipetteren, waardoor de buis op ijs blijft. Voeg vervolgens een microliter van een voorgemengde oplossing van glucoseoxidase en catalase toe aan de buis van het tubuline-MAP-mengsel en meng opnieuw door zeven tot acht keer te leidingen.Verdeel het totale volume van de oplossing in twee porties voor gebruik in afzonderlijke kamers. Ondertussen moet de vloeistof die eerder aan de stroomkamer is toegevoegd, worden verwijderd door capillaire werking door een pluisvrij laboratoriumdoekje aan het andere uiteinde van de kamer te gebruiken, samen met de toevoeging van het tubuline-MAP-mengsel aan de stroomkamer. Zodra het monster volledig in de kamer is, sluit u de twee uiteinden van de kamer af met epoxy van vijf minuten en houdt u het ongeveer 30 minuten op 37 graden Celsius om te nucleeren en microtubule-tactoïden te laten groeien.Voor het in beeld brengen van de tactoïden door fluorescentiemicroscopie, gebruikt u objectieven met een numeriek diafragma van 1,2 of meer in een vergroting van 60X of hoger om voldoende licht in fluorescentie te verzamelen. Neem de beelden op met een gratis metaaloxide halfgeleider of een camera van een opgeladen apparaat. Om het monster te behouden, bewaart u het in een omgevingskamer van 37 graden Celsius.Als alternatief kunnen andere podiumverwarmers, waaronder heteluchttrapverwarmers en objectieve temperatuurgecontroleerde kragen met circulerend warm water, voor dit doel worden gebruikt. Aangezien geschikte excitatiebronnen essentieel zijn voor de juiste fluorescentie voor rhodamine tubuline, gebruikt u een laser van 561 nanometer met ten minste één milliwatt vermogen bij het monster voor beelden van goede kwaliteit. Verander voor GFP MAP65 echter de excitatiebron in een laser van 488 nanometer.Als u breedveldeposeloscentiemicroscopie gebruikt, gebruik dan een rhodaminefilterkubus met een excitatie van 540 12,5 nanometer, dichroïsch van 545 nanometer 12,5 nanometer afsnijding en emissie van 575 nanometer long-pass. Gebruik voor GFP MAP een GFP-filterkubus met excitatie van 480 15 nanometer, dichroïsch van 505 nanometer 15 nanometer afgesneden en emissie van 515 nanometer long-pass. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat het verlichtingsvermogen en de belichtingstijden zodanig zijn dat de intensiteitsschaal voor de camera niet verzadigd is, neemt u ten minste 10 afbeeldingen van verschillende gebieden om meer dan 100 tactoïden in zowel het rode als het groene kanaal in beeld te brengen en slaat u ze op als 16-bits TIFF-afbeeldingen voor analyse.Met behulp van dit protocol kunnen microtubule tactoïden waarvan de vorming binnen 30 minuten wordt voltooid, direct onder de microscoop worden gevisualiseerd. De tactoïden zijn zichtbaar met zowel een 561-nanometer laser in het tubulinekanaal als een 488-nanometer laser in het MAP65-kanaal. De beelden overlappen elkaar ook perfect.Bij deze methode konden ook de lengte en breedte van de tactoïden worden gemeten. Het intensiteitsprofiel van een tactoïde bleek te variëren met de breedte. Bovendien werd de immobiele aard van de microtubule tactoïden aangetoond door fluorescentieherstel na fotobleking of FRAP-experimenten, die geen herstel van fluorescentie na het fotobleken lieten zien.Aan de andere kant onthulden FRAP-experimenten een mobiel karakter van MAP65, waarvoor een geleidelijk herstel en fluorescentie kon worden waargenomen na het bleken van foto's. Dit fluorescentieherstel door MAP65 kan worden aangepast aan een toenemend exponentieel verval om de amplitude en de tijdschaal van herstel te vinden. Het tactoïde experimentgedeelte moet binnen 10 tot 12 minuten worden voltooid, omdat de tubuline snel slecht kan worden op ijs, wat schadelijk kan zijn voor de nucleatie van tactoïden.Toekomstig werk met verschillende microtubule cross-linking eiwitten en cross-linking motoreiwitten, enzymen die microtubuli kunnen verplaatsen, zal nieuwe informatie over de zelforganisatie van de mitotische spindel blijven blootleggen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video describes TIRF, a total internal reflection microscopy-based technique to visualize actin and microtubule polymerization dynamics. The method allows the high-resolution imaging of actin and microtubule coupling dynamics in real-time, which is essential for understanding cellular crosstalks.

TIRF Microscopy to Visualize Actin and Microtubule Coupling Dynamics

Microtubules zijn inherent instabiel polymeren en hun schakelen tussen groei en bakvet stochastische en moeilijk te controleren. Hier beschrijven we protocollen gebruiken gesegmenteerde microtubuli met photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisatie van gesegmenteerde microtubuli kan worden geactiveerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het bijstaan ​​van de analyse van bewegingen met de demontage uiteinden van microtubuli.

Voorbereiding van Segmented Microtubules om Motions Gedreven door het demonteren uiteinden van microtubuli Studie

Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.

Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

Hier presenteren we een protocol voor het reconstitueren van microtubulibundels in vitro en het direct kwantificeren van de krachten die erin worden uitgeoefend met behulp van gelijktijdige optische vangmethoden en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Deze test maakt het mogelijk om op nanoschaal de krachten en verplaatsingen te meten die worden gegenereerd door eiwitensembles binnen actieve microtubulinetwerken.

Direct meten van krachten binnen gereconstitueerde actieve microtubulibundels

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Hier worden methoden gepresenteerd voor het bereiden van actieve nematica uit microtubuli en kinesinemotoren, inclusief eiwitvoorbereiding en -constructie en het gebruik van putten voor actieve nematische opsluiting.

Vormen, beperken en observeren van op microtubule gebaseerde actieve nematica

Dit manuscript wordt beschreven standaardprotocollen voor het meten van tau hyperphosphorylation, tau binding aan de microtubuli, en lokalisatie van intracellulaire tau drug behandelingen na te meten. Deze protocollen kunnen herhaaldelijk worden gebruikt voor het screenen van drugs of andere verbindingen die gericht zijn op tau hyperphosphorylation of microtubulus bindend.

Assay voor fosforylatie en microtubulus bindende samen met lokalisatie van Tau-eiwit in Colorectal kankercellen

In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

Hier presenteren we een protocol voor het lymfkliertest in vivo labelen van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten met biotine. Dit protocol bevat informatie over hoe perfuse muis nieren, het isoleren van de glomeruli, en het uitvoeren van endogene immunoprecipitation van de proteïne van belang.

Isolatie van de Glomeruli en In Vivo Labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten

We beschrijven protocollen voor de structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO door Röntgen kristallografie. De methoden omvatten eiwit expressie, zuivering en karakterisering, evenals strategieën voor succesvolle kristal optimalisatie en structuurbepaling van het eiwit in zijn ongebonden vorm.

Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO

Leer de zelfassemblage van microtubule tactoids met MAP65 en PEG voor celbiologisch onderzoek. Deze methode biedt inzicht in microtubuli-organisatie en mitotische spoelvorming.

Zelfassemblage van Microtubule Tactoids

Meer video's verkennen