Name: Lentivirale gemedieerde levering van shRNAs aan hESCs en NPCs met behulp van goedkope kationische polymeerpolyethylenimine (PEI) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Leer hoe je met polyethylenimine (PEI) kosteneffectieve lentivirale vectoren produceert voor stabiele shRNA-expressie in humane embryonale stamcellen en neurale voorlopercellen. Deze methode biedt een betaalbaar alternatief voor gentherapie-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door onderzoeksbeurzen van de United Arab Emirates University (UAEU), grant # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) en # 12R010 (UAEU-AUA-beurs). We bedanken Prof Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) voor het helpen bewerken van het manuscript voor stijl en grammatica.
Alle gegevens zijn op aanvraag beschikbaar.

1. Transfectie van HEK293T-cellen met behulp van PEI- of Lipofectamine 3000-reagens
<ol><li>Kweek HEK293T cellen in DMEM + 10% FBS + 1x penicilline/streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2 totdat ze 90% confluent zijn voordat ze worden gezaaid voor transfectie. Gebruik een relatief laag aantal cellen voor de productie van een hoog titervirus (idealiter minder dan P30).</li>
	<li>Zaai 4 x 106 cellen in 10 ml volledig groeimedium in een weefselkweekplaat van 100 mm en groei 's nachts in een bevochtigde weefselkweekincubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2.
</li>
	<li>Verdun voor elke transfectie plasmide-DNA (voorraden van 1 mg/ml) in 1 ml serumvrije DMEM-media in centrifugebuizen van 1,5 ml met behulp van de volgende verhouding van invoer- en verpakkingsplasmiden: Entry vector = 10 μg psPAX2.0 = 7,5 μg pMD2.G = 5 μg</li>
	<li>Vortex voor 10 s en draai de buis op 10.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur om te verzamelen.</li>
	<li>Voeg 70 μL (1 mg/ml stockoplossing) PEI toe aan de buis en vortex en draai kort zoals hierboven beschreven om te verzamelen. Het gebruikte volume PEI is gebaseerd op een verhouding van 1:3 van totaal DNA (μg):P EI (μg).</li>
	<li>Verdun voor transfectie op basis van lipofectamine de bovenstaande vectoren in 500 μL serumvrije DMEM-media met 45 μL reagens P in de kit en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verdun 70 μL reagens L in de kit met 500 μL serumvrije DMEM-media en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Combineer de inhoud van beide buizen en incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om complexe vorming mogelijk te maken.</li>
	<li>Voeg druppelsgewijs 1 ml DNA/PEI of 1 ml DNA/lipofectaminecomplexen toe aan de plaat met cellen en incubeer gedurende 6 uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2.
</li>
	<li>Na 6 uur, verander naar verse complete groeimedia (10 ml) en breng de cellen terug naar de bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2.
</li>
</ol>2. LVS-collectie en ultracentrifugatie
<ol><li>Na 2 dagen transfectie verzamelt u de virusbevattende media en bedekt u de cellen opnieuw met 10 ml verse volledige groeimedia.</li>
	<li>Verzamel na 3 dagen transfectie de virusbevattende media en combineer deze met de virusbevattende media die op het tijdstip van 2 dagen zijn verzameld.</li>
	<li>Centrifugeer het virale supernatant bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C tot pelletcellulair vuil.</li>
	<li>Filtreer het supernatant met behulp van een poriegrootte van 0,45 μm laag eiwitbindend filter (PES of SFCA) en bewaar het bij 4 °C totdat het klaar is voor ultracentrifugatie. Het gefilterde supernatant dat lentivirale deeltjes bevat, kan gedurende 5 dagen bij 4 °C worden bewaard zonder een significant verlies aan virale titers.</li>
	<li>Steriliseer de ultracentrifugebuizen met bekers door ze gedurende 10 minuten te wassen met 70% ethanol, aan de lucht te drogen, te sluiten en op 4 °C te bewaren.</li>
	<li>Voeg 36 ml gefilterde media met lentivirale deeltjes toe aan een steriele ultracentrifugebuis.</li>
	<li>Vul 5 ml steriele stripette met 4 ml steriele 20% sucrose-oplossing (bereid in PBS) en doseer deze tot op de bodem van de ultracentrifugebuis (UC) die LVS bevat. Het is belangrijk dat de sucrose-oplossing niet wordt gemengd met de media en een gradiënt maakt aan de onderkant van de buis.</li>
	<li>Balanceer alle ultracentrifugebuizen met serumvrije DMEM-media, plaats ze in de koude ultracentrifugebuis met bekers en sluit de deksels.</li>
	<li>Draai de buizen op 125.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Gooi na de spin het supernatant voorzichtig weg door de inhoud van de buis in een container met bleekmiddel om te keren zonder de pellet te verstoren. Markeer de pellet indien zichtbaar.</li>
	<li>Plaats de ultracentrifugebuis in een steriele buis van 50 ml en voeg 200 μL steriele DPBS precies aan de bovenkant van de pellet toe. Ongestoord bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Meng de volgende dag voorzichtig door 40x op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Draai kort op 13.000 x g in een tafelcentrifuge om eventuele brokstukken te pelleteren.</li>
	<li>Breng het supernatant over in een nieuwe buis en aliquot het viruspreparaat als 20 μL aliquots. Bewaren bij −80 °C.</li>
	<li>Zet 5 μL van het preparaat opzij voor virale titermetingen.</li>
</ol>3. LVS-titermeting voor op pLKO.1 gebaseerde vectoren
<ol><li>Bepaal de titer van lentivirale deeltjes met behulp van een qPCR volgens de aanbevelingen van de fabrikant.</li>
	<li>Bereid voor een standaardcurve vijf 10-voudige seriële verdunningen van Standard Control DNA (meegeleverd in de kit) door in elke stap 5 μL DNA te verdunnen tot 45 μL nucleasevrij H2O. Gebruik verdunningen van 1:100 tot 1:100.000 om een standaardcurve te genereren.</li>
	<li>Stel reacties op ijs in duplicaten op de volgende manier in: 2x qPCR master mix 10 μL Primer mix 2 μL Monster of standaard DNA 2 μL Nucleasevrij H2O 6 μL</li>
	<li>Voer qPCR uit met behulp van de fietsomstandigheden die worden vermeld in de handleiding van de kit voor een totaal van 35 cycli.</li>
	<li>Plotcyclusdrempelwaarden (Ct) op de Y-as versus virustiter op de X-as.</li>
	<li>Genereer een logaritmische regressie met behulp van vier standaard controle-DNA-verdunningen (1:100 tot 1:100.000) om de onbekende virusmonstertiter te bepalen met behulp van een trendlijnvergelijking.</li>
</ol>4. LVS-titermeting voor op pll3.7 gebaseerde vectoren
<ol><li>Zaad 1 x 105 HEK293T cellen in elke put van een P12-put plaat in 1 ml volledige groeimedia 24 uur vóór infecties.</li>
	<li>Vul de media aan met polybreen van 8 μg/ml en voeg 1 ml toe aan elke steriele buis van 1,5 ml.</li>
	<li>Verdun de virale deeltjes met behulp van 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL en 0,1 μL geconcentreerde lentivirale deeltjes in elk van de 1 ml polybreenbevattende media.</li>
	<li>Vervang de media van HEK293T-cellen door de media die aangegeven hoeveelheden lentivirale deeltjes bevatten, samen met 8 μg/ml polybreen en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2.</li>
	<li>De volgende dag, verander op verse media en zet de kweek voort gedurende 72 uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2.</li>
	<li>Was na 72 uur de cellen met PBS, trypsinize bij 37 °C volgens het protocol van de fabrikant en resuspendeer in 1 ml PBS.</li>
	<li>Voer FACS-celsortering uit met behulp van een celsorteerder, volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Stel de poort in op 0% GFP-positieve cellen met behulp van niet-geïnfecteerde HEK293T-cellen en tel 50.000 gebeurtenissen voor elk monster om het percentage positieve cellen voor elke virale verdunning te bepalen.</li>
	<li>Gebruik alleen de volumes lentivirale deeltjes die %GFP-positieve cellen geven in het bereik van 2% -20% om de titer van lentivirale deeltjes te berekenen.</li>
</ol>5. Infectie van hESCs en stabiele selectie
<ol><li>Was de cellen met 2 ml PBS die in elke put van een 6-well cell culture multiwell plaat groeit.</li>
	<li>Maak de cellen los van de celkweekplaat met behulp van 1 ml 1x celdissociatiereagens door incubatie bij 37 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Verzamel de cellen in DMEM/F12-media en centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de celpellet te verzamelen.</li>
	<li>Aspirateer, resuspendeer de cellen in 1 ml en tel met behulp van een hemocytometer.</li>
	<li>Maak een celsuspensie met 2 x 105 cellen / ml volledige groeimedia met mTeSR1 aangevuld met 10 ng / ml basis fibroblastgroeifactor (bFGF), penicilline / streptomycine (P / S) en 10 μM ROCK-remmer (RI).</li>
	<li>Zaai 1 x 105 cellen op 50x verdunde complete keldermembraan matrix-gecoate P24-putplaten in 500 μL van volledige groeimedia en kweek de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2.
</li>
	<li>Infecteer de volgende dag hESCs bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 met 8 μg/ml polybreen en incubeer bij 37 °C gedurende 8 uur.</li>
	<li>Vervang na 8 uur de virusbevattende media door verse groeimedia (-RI) en zet de kweek voort totdat de cellen voor 90% samenvloeien.</li>
	<li>Start de selectie van puromycine (0,8 μg / ml) wanneer de cellen 90% samenvloeiing bereiken, wat meestal 48-72 uur na infectie is.</li>
	<li>Nadat de selectie is voltooid (meestal 4-6 dagen), splitst u de stabiele cellen (1:4) en breidt u de cellen uit voor cryopreservatie en verdere analyse.</li>
</ol>6. Transductie van H9-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC's)
OPMERKING: NPC's werden afgeleid van H9-cellen met behulp van een dual-Smad-remmingsprotocol, zoals eerder beschreven19.
<ol><li>Behandel in het kort H9-cellen met celdissociatiereagens bij 37 °C gedurende 5 minuten om enkele cellen te genereren en resuspendatie in volledige groeimedia met mTeSR1 aangevuld met 10 ng / ml basis fibroblastgroeifactor (bFGF), penicilline / streptomycine (P / S) en 10 μM ROCK-remmer (RI). Zaad op 1:50 verdunde Matrigel-gecoate 6-well celkweekschalen met een dichtheid van 60.000 cellen /cm2 (dag 0).</li>
	<li>Initieer differentiatie wanneer de cellen 95% -100% confluentie bereiken door te veranderen in 100% KSR-media met LDN193189 (200 nM) en SB431542 (10 μM) (dag 1).</li>
	<li>Verander op dag 2 de media opnieuw met 100% KSR aangevuld met LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) en XAV939 (5 μM).</li>
	<li>Schakel op dag 4 van de differentiatie over op een mengsel van KSR-medium (75%) en N2-medium (25%) met LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) en XAV939 (5 μM).</li>
	<li>Schakel van dag 6 tot dag 12 geleidelijk de media over naar 100% N2 aangevuld met LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) en XAV939 (5 μM) door de N2-media elke dag met 25% te verhogen en de media na elke 2 dagen te veranderen.</li>
	<li>Cultuurdag 12 NPC's in N2:B27 media aangevuld met 20 ng/ml bFGF.</li>
	<li>Zaad 2 x 105 cellen in elke put van een 1:50 verdunde complete keldermembraan matrix-gecoate P6-plaat in 2 ml NPC-cultuurmedia en incubeer om de cellen te laten hechten.</li>
	<li>Infecteer de cellen de volgende dag met lentivirale deeltjes bij een MOI 6 in aanwezigheid van 8 μg/ml polybreen.</li>
	<li>Vervang na 8 uur de virusbevattende media door verse NPC-groeimedia.</li>
	<li>Herhaal de volgende dag de infecties en verander de media om 8 uur.</li>
	<li>Houd de cellen 72 uur in cultuur voordat u ze oogst voor verdere analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+Somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).</li>
<li>Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).</li>
<li>Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+and+nonviral+gene+delivery+and+its+role+in+pluripotent+stem+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105(2008).</li>
<li>Li, S. D., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+is+superior+to+viral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nonviral is superior to viral gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).</li>
<li>Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+delivery+systems%3A+From+simple+transfection+agents+to+artificial+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li>
<li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells%3A+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).</li>
<li>Sukhorukov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+high-intensity+field+pulses%3A+Strategies+for+improving+robustness+and+performance+of+electrotransfection+and+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion.</a> The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).</li>
<li>Floch, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+phosphonolipids+as+non+viral+vectors+for+DNA+transfection+in+hematopoietic+cell+lines+and+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).</li>
<li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).</li>
<li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).</li>
<li>Zhang, X., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+delivery+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene delivery in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).</li>
<li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li>
<li>Gropp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).</li>
<li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991(2021).</li>
<li>Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 3, 16017(2016).</li>
<li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+nonviral+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation+during+in-vitro+human+embryonic+cortical+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415(2017).</li>
<li>Weissinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+in+purified+human+hematopoietic+peripheral-blood+stem+cells+by+means+of+electroporation+without+prestimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+and+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+transgene+expression+to+antigen-presenting+cells+derived+from+lentivirus-transduced+engrafting+human+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Blood. 99 (2), 399-408 (2002).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).</li>
<li>Sweeney, N. P., Vink, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+lentiviral+vector+genome+size+and+producer+cell+genomic+to+gag-pol+mRNA+ratios+on+packaging+efficiency+and+titre%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Het vermogen om stamcellen genetisch te modificeren voor studie of klinische doeleinden wordt beperkt door zowel technologie als het basisbegrip van de biologie van hESCs. Technieken die een aanzienlijk potentieel hebben aangetoond in muis-SER's, zoals lipofectie en elektroporatie, zijn niet erg efficiënt voor hESCs, die notoir moeilijk zijn voor genafgifte met conventionele methoden20. Dit idee heeft niet alleen geleid tot de optimalisatie van bestaande technieken, maar ook tot de ontwikkeling va...

Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) afgeleid van de blastocyst binnenste celmassa zijn pluripotent en kunnen worden gedifferentieerd in verschillende celtypen, afhankelijk van externe factoren onder in vitro omstandigheden 1,2. Om het potentieel van hESCs volledig te benutten, is het noodzakelijk om snelle en betrouwbare genafgiftemethoden voor deze cellen te hebben. Conventioneel kunnen de gebruikte technieken grofweg worden ingedeeld in twee typen: niet-virale en virale genafgiftesystemen 3,4. De meest gebruikte niet-virale genafgiftesystemen zijn lipofectie, elektroporatie en nucleofection. Niet-virale toedieningssystemen zijn voordelig vanwege minder insertiemutaties en een algehele afname van immunogeniciteit 5,6. Deze methoden resulteren echter in een lage transfectie-efficiëntie en een korte duur van voorbijgaande genexpressie, wat een belangrijke beperking is voor langetermijndifferentiatiestudies7. Elektroporatie resulteert in een betere transfectie-efficiëntie in vergelijking met lipofectie; het resulteert echter in meer dan 50% celdood 8,9,10. Met behulp van nucleofection kunnen de celoverleving en transfectie-efficiëntie worden verbeterd door lipofectie en elektroporatie te combineren, maar de aanpak heeft celspecifieke buffers en gespecialiseerde apparatuur nodig en wordt dus behoorlijk duur voor opgeschaalde toepassingen 11,12.
Daarentegen hebben virale vectoren verbeterde transfectie-efficiënties aangetoond, evenals een algehele lage cytotoxiciteit, na transductie. Bovendien zijn de geleverde genen stabiel tot expressie gebracht en maken deze methode dus ideaal voor langetermijnstudies13. Een van de meest gebruikte virale vectoren voor genafgifte in hESCs zijn lentivirale vectoren (LVS), die meer dan 80% transductie-efficiëntie kunnen geven met behulp van virale deeltjes met een hoge titer14,15. Lipofectie en CaPO 4-precipitatie behoren tot de meest gebruikte methoden om HEK293T-cellen of zijn derivaten tijdelijk te transfecteren met genoverdrachtsvectoren samen met verpakkingsplasmiden om lentivirale deeltjes16 te produceren. Hoewel lipofectie resulteert in een goede transfectie-efficiëntie en lage cytotoxiciteit, wordt de techniek belemmerd door de kosten, en opschalen om hoge titer lentivirale deeltjes te krijgen zou erg duur zijn. CaPO4-neerslag resulteert in relatief vergelijkbare transfectie-efficiënties als die verkregen met behulp van lipofectie. Hoewel kosteneffectief, resulteert CaPO4-neerslag in aanzienlijke celdood na transfecties, wat het moeilijk maakt om te standaardiseren en batch-to-batch variaties te vermijden17. In dit scenario is het ontwikkelen van een methode die een hoge transfectie-efficiëntie, lage cytotoxiciteit en kosteneffectiviteit geeft, cruciaal voor de productie van lentivirale deeltjes met een hoge titer die in hESCs worden gebruikt.
Polyethylenimine (PEI) is een kationisch polymeer dat HEK293T-cellen met een hoge efficiëntie kan transfecteren zonder veel cytotoxiciteit en heeft een verwaarloosbare kost in vergelijking met op lipofectie gebaseerde methoden18. In deze situatie kan PEI worden gebruikt voor opgeschaalde toepassingen van lvs-productie met een hoge titer door de concentratie van lentivirale deeltjes uit kweeksupernatanten met behulp van verschillende technieken. Het gepresenteerde artikel beschrijft het gebruik van PEI om HEK293T-cellen en lentivirale vectorconcentratie te transfecteren met behulp van ultracentrifugatie via een sucrosekussen. Met behulp van deze methode verkrijgen we regelmatig titers ruim boven 5 x 107 IE / ml met lage batch-to-batch variaties. De methode is eenvoudig, ongecompliceerd en kosteneffectief voor opgeschaalde toepassingen voor genafgifte aan hESCs en hESCs-afgeleide cellen.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF Recombinant human</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin FRAC V</td><td>Invitrogen</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopamine</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM media</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Nutrient mix F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w/o: Ca and Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovie serum</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution</td><td>GE healthcare</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamine, 100X&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH Polyclonal antibody</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH shRNA</td><td>Macrogen</td><td></td><td>Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 complete media</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium 1X CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 Supplement 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 Supplement 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin SOL</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pLKO.1 TRC vector</td><td>Addgene</td><td>10878</td><td></td></tr><tr><td>pLL3.7 vector&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene infection reagent</td><td>Sigma</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, branched</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Tocris</td><td>4551/10</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin .05% EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

lentivirale gemedieerde levering van shrna's aan hescs en npc's met behulp van goedkope kationische polymeerpolyethylenimine (pei)

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van lentivirale deeltjes voor de levering van korte haarspeldrna's (shRNA's) aan zowel menselijke embryonale stamcellen (hESCs) als neurale voorlopercellen (NPC's) afgeleid van hESCs met een hoge efficiëntie. Lentivirale deeltjes werden gegenereerd door hek293T-cellen te co-transfecteren met behulp van entryvectoren (die shRNA's dragen) samen met verpakkingsplasmiden (pAX en pMD2.G) met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI). Virale deeltjes werden geconcentreerd met behulp van ultracentrifugatie, wat resulteerde in gemiddelde titers boven 5 x 107. Zowel hESCs als NPC's kunnen met hoge efficiëntie worden geïnfecteerd met behulp van deze lentivirale deeltjes, zoals blijkt uit puromycineselectie en stabiele expressie in hESCs, evenals voorbijgaande GFP-expressie in NPC's. Bovendien toonde western blot-analyse een significante vermindering van de expressie van genen gericht op shRNA's. Bovendien behielden de cellen hun pluripotentie en differentiatiepotentieel, zoals blijkt uit hun daaropvolgende differentiatie in verschillende afstammingslijnen van het CZS. Het huidige protocol gaat over de levering van shRNA's; dezelfde benadering kan echter worden gebruikt voor de ectopische expressie van cDA's voor overexpressiestudies.

Na genoverdracht is onvermijdelijk een hoge levensvatbaarheid van hESCs vereist. Ondanks de inspanningen en optimalisatie van protocollen om celdood na elektroporatie van hESCs te verminderen, wordt nog steeds meer dan 50% celdood waargenomen na elektroporatie van deze cellen, samen met een lage transfectie-efficiëntie20. Lentivirale gemedieerde genoverdracht resulteert niet alleen in een hoge efficiëntie van genoverdracht, maar toont ook hoge niveaus van cel levensvatbaarheid na transductie. De o...

Met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI) produceerden we lentivirale deeltjes voor stabiele expressie van shRNA's in H9 menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en transiënt getransduceerde H9-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC's) met een hoge efficiëntie.

Lentivirale gemedieerde levering van shRNA's aan hESCs en NPC's met behulp van goedkope kationische polymeerpolyethylenimine (PEI)

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

Transfectie van HEK293T-cellen moet worden uitgevoerd bij 90% confluency. Ook het gebruik van een 0,45 micron laag eiwitbindend filter voor lentivirale vectorfiltratie en het gebruik van een sucrosekussen voor ultracentrifugatie zijn essentieel. Begin met het kweken van HEK293T-cellen in DMEM-medium met 10% FBS en 1X penicilline streptomycine bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof totdat cellen 90% samenvloeiing bereiken voordat ze worden gezaaid voor transfectie.Zaai vier keer 10 naar de zes cellen in 10 milliliter volledig groeimedium in een weefselkweekplaat van 100 millimeter en groei 's nachts in een bevochtigde weefselkweekincubator met een atmosfeer van 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof. Verdun voor elke transfectie één milligram per milliliter plasmide-DNA-voorraden in één milliliter serumvrije DMEM-media in centrifugebuizen van 1,5 milliliter door de verhouding van invoer- en verpakkingsplasmiden te volgen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Vortex de buis gedurende 10 seconden en draai op 10, 000 keer G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur om te verzamelen.Voeg vervolgens 70 microliter van éé

lentiviral-mediated-delivery-shrnas-to-hescs-npcs-using-low-cost

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het artikel beschrijft de protocol voor plaatsspecifieke transfectie van gecodeerde sequentie van siRNA in een hechtende zoogdiercelkweek met een micro-elektrode array (MEA).

Hoog rendement, Site-specific Transfectie van adherente cellen met siRNA Met behulp van micro-elektrode arrays (MEA)

Source: Tagliafierro, L., et al. Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the lentiviral transduction of neural progenitor cells (NPCs) for targeted epigenetic modification of alpha-synuclein, a key protein in Parkinson’s disease. The protocol enables methyltransferase-mediated DNA methylation, reducing SNCA expression for studying gene regulation...

Lentiviral Transduction of Neural Progenitor Cells for Epigenetic Regulation of Alpha-Synuclein Expression

In this video, we demonstrate a method to perform transduction of shRNA lentiviral vectors to obtain stable knockdown cell lines in immortalized hematopoietic stem and progenitor cells (iHSPCs).

Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in iHSPCs In Vitro: A Lentivirus-Based shRNA Expression System Delivery into iHSPCs for Knockdown of Specific Gene Expression

Een protocol voor de nanodeeltjes tracking analyse (NTA) en high-throughput flowcytometrie om polymere genafgifte nanodeeltjes evalueren beschreven. NTA wordt gebruikt om de nanodeeltjes deeltjesgrootteverdeling en het plasmide per deeltjesverdeling karakteriseren. High-throughput flowcytometrie in staat stelt kwantitatieve transfectie efficiëntie evaluatie voor een bibliotheek van gen delivery biomaterialen.

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Levering blijft de belangrijkste uitdaging voor de therapeutische toepassing van kleine interfererende RNA (siRNA). Dit protocol omvat het gebruik van een multifunctionele en biocompatibele siRNA afleverplateau, bestaande uit arginine en polyethyleenimine geënte poreuze silicium microdeeltjes.

Poreuze Silicon Micropartikels voor Levering van siRNA Therapeutics

Het doel van dit protocol is om cationische/anionische liposomen met een neuro-targeterend peptide te gebruiken als een CNS-afleversysteem om siRNA in staat te stellen de BBB over te steken. De optimalisatie van een afleversysteem voor behandelingen, zoals siRNA, zou meer behandelingsopties mogelijk maken voor prionen en andere neurodegeneratieve ziekten.

Levering van therapeutische siRNA het CZS gebruiken kationische en anionische liposomen

Dit manuscript beschrijft de efficiënte, niet-virale aflevering van miR aan endotheelcellen door een PEI / MNP vector en de magnetisatie. Dus behalve genetische modificatie, deze benadering voor magnetische cellen leiding en MRI detecteerbaarheid. De techniek kan worden gebruikt om de kenmerken van de therapeutische cel producten te verbeteren.

voorbereiding en<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering van Magnetische miR-gemodificeerde endotheelcellen

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van kationische nanoliposomes, die is gebaseerd op de methode van de droge-film en kan worden gebruikt voor de veilige en efficiënte levering van in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA.

Generatie van kationische Nanoliposomes voor de efficiënte levering van In Vitro getranscribeerd Messenger RNA

Beschrijven we een methode van het gebruik van polyethyleneimine (PEI)-gecoat superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes voor transfecting macrofagen met siRNA. Deze nanodeeltjes kan efficiënt siRNA leveren aan macrofagen in vitro en in vivo en stilte doel genexpressie.

Ijzeroxide Polyethyleneimine-gecoate nanodeeltjes als een voertuig voor de levering van kleine Mengend RNA aan macrofagen In Vitro en In Vivo

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

Een protocol om gengemodificeerde menselijke pseudoislets te maken van verspreide menselijke eilandjes cellen die door lentivirus met korte haarspeld RNA (shRNA) worden weergegeven. Dit protocol maakt gebruik van direct beschikbare enzym-en kweekvaten, kan gemakkelijk worden uitgevoerd en produceert genetisch gemodificeerde humane pseudoislets die geschikt zijn voor functionele en morfologische studies.

Lentivirale gemedieerde gen-uitschakeling in humaan pseudo-eilandje bereid in lage bevestigings platen

Leer hoe je met polyethylenimine (PEI) kosteneffectieve lentivirale vectoren produceert voor stabiele shRNA-expressie in humane embryonale stamcellen en neurale voorlopercellen. Deze methode biedt een betaalbaar alternatief voor gentherapie-onderzoek.

Lentivirale gemedieerde levering van shRNAs aan hESCs en NPCs met behulp van goedkope kationische polymeerpolyethylenimine (PEI) (Video) | JoVE Journal

Lentivirale gemedieerde levering van shRNA's aan hESCs en NPC's met behulp van goedkope kationische polymeerpolyethylenimine (PEI)

Meer video's verkennen